Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu biologii wirusa SARS-CoV-2 i próbie znalezienia leków, w szczególności medycyny chińskiej, przeciwko SARS-CoV-2. Wszystkie badania nad żywym wirusem SARS-CoV-2 muszą być kontrolowane w laboratorium na trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. A to eksperymentalne ograniczenie sprawia, że badanie SARS-CoV-2 jest możliwe tylko w przypadku kilku osób. Wirus SARS-CoV-2 podobnie jak praktyczna metoda badania SARS-CoV-2 możliwa bez ograniczenia bezpieczeństwa biologicznego poziomu trzeciego laboratorium, a lista będzie bardzo przydatną metodą.

[Instruktor] Na początek wysiewaj około 3 milionów komórek HEK-293T na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 10 centymetrów z kompletnym podłożem DMEM, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny. Sprawdź płynność współczynnika komórkowego pod mikroskopem. Rozcieńczyć 60 mikrolitrów PEI z jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego pożywką bez surowicy, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów. Teraz weź 200 mikrolitrów pożywki bez surowicy i dodaj do niej 6,7 mikrograma plazmidu N, 10 mikrogramów plazmidu Luc-T20, 0,016 mikrograma plazmidu S i 3,3 mikrograma plazmidu M-IRES-E. Delikatnie dodać rozcieńczony roztwór PEI do roztworu zawierającego plazmidy powlekające białka struktury wirusa i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To jest rozwiązanie do transfekcji. Ostrożnie upuść roztwór do transfekcji na komórki HEK-293T i delikatnie zakręć płytką do hodowli tkankowej, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Zamień pożywkę do hodowli komórkowej na kompletną pożywkę DMEM sześć godzin po zakażeniu i inkubuj transfekowane komórki HEK-293T w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. Zbierz supernatant zakażonych komórek HEK-293T, który zawiera cząsteczki podobne do wirusa SARS-CoV-2. Przefiltruj zebrany supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. To jest podłoże SC2-VLP. Wysiewaj 40 000 komórek HEK-293T ze stabilną ekspresją enzymu konwertującego angiotensynę 2 lub ACE2 i TMPRSS2 na 96-dołkowej płytce i dodaj 50 mikrolitrów pożywki SC2-VLP. Inkubować 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Po inkubacji usuń pożywkę z każdego dołka 96-dołkowej płytki i przemyj raz 100 mikrolitrami PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza. Lizę komórek HEK-293T wysianych TMPRSS2 ACE2 za pomocą 20 mikrolitrów pasywnego buforu do lizy i delikatnie kołysz próbką na wytrząsarce orbitalnej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować 96-dołkową płytkę o masie 4 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki do mikropłytek z chłodzeniem, a następnie natychmiast przenieść płytkę do łaźni lodowej. Weź 100 mikrolitrów odtworzonego buforu do oznaczania lucyferazy do nowej nieprzezroczystej białej 96-dołkowej płytki i dodaj 20 mikrolitrów lizatu do każdej studzienki. Mieszać krótko, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy. Zmierz sygnał luminescencji za pomocą czytnika płytek. Następnie, aby ocenić skład pożywki SC2-VLP, dodaj 1,36 mililitra roztworu PEG 8000 do 10 mililitrów pożywki SC2-VLP. Umieść mieszaninę na wytrząsarce orbitalnej i powoli mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Odwirować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2 000 G przez 30 minut. I zbierz granulat SC2-VLP do analizy western blot. Umieść około 3 milionów komórek HEK-293T równomiernie w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem o średnicy 15 milimetrów i pozwól komórkom przylegać i rosnąć, aż osiągną około 70% zgryźliwości. Po transekcji komórek, jak wykazano wcześniej, ze zmodyfikowanymi ilościami plazmidu, delikatnie umyj naczynie hodowlane dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego PBS. Dodaj jeden mililitr 4% roztworu utrwalającego aldehyd paraform w temperaturze pokojowej i inkubuj przez 15 minut. Umyj komórki dwukrotnie przez pięć minut, każdy jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej i przeniknij komórki, dodając jeden mililitr 0,25% Triton X-100 przez 10 minut. Ponownie umyj komórki dwa razy przez pięć minut, każdy z jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr 5% albuminy surowicy bydlęcej na godzinę, aby zablokować niespecyficzne interakcje przeciwciał. Dodaj około 200 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwszorzędowych, aby przykryć szklane dno i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie usuń roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i umyj komórki trzy razy przez pięć minut każda jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Teraz dodaj sprzężony z fluorescencją roztwór przeciwciał drugorzędowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, wybarwić jądra 2,5 mikrograma na mililitr roztworu Hoechsta w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Na koniec, po umyciu komórek PBS, obserwuj barwienie białka S lub organelli przed uzyskaniem obrazów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Rysunek ten ilustruje wrażliwość produkcji SC2-VLP na różne ilości transfekcji plazmidu kodującego białko kolca. Miano SC2-VLP było najwyższe, gdy transfekowano 0,016 mikrograma plazmidu S i znacznie się zmniejszyło przy 0,16 i 1,6 mikrograma plazmidu S. Mutacja H1271 do E w białku kolca znacznie zmniejszyła miano SC2-VLP w porównaniu z typem dzikim. Mutacja E1262 do H doprowadziła do umiarkowanego zmniejszenia miana SC2-VLP, podczas gdy podwójna mutacja E1262 do H, H1271 do E całkowicie zniosła produkcję. Prążki białkowe S i S-2 o pełnej długości były zmniejszone w pasach E1262 do H i podwójnie zmutowanych, w porównaniu z typem dzikim. Wydajność pakowania S została również zmniejszona w mutantach E1262 do H i H1271 do E i prawie zniesiona w podwójnym mutancie. Liczebność VLP pozostała w dużej mierze niezmieniona u wszystkich mutantów typu dzikiego i S. Białko S typu dzikiego kolokalizowane z markerem cis-Golgiego GM130, ale nie z markerem ER Sec61 beta lub markerem ERGIC ERGIC 53. Białko S z mutacją H1271 do E wykazywało rozproszoną dystrybucję cytoplazmatyczną i brakowało kolokalizacji z GM130.