Name: Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę produkcji cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 w komórkach HEK-293T do badań cyklu życiowego wirusa. Ta technika umożliwia bezpieczne badanie zakażenia i składania wirusa bez laboratorium BSL-3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez program Startup Fund na Pekińskim Uniwersytecie Medycyny Chińskiej (BUCM) (90011451310011). Wyrażamy naszą wdzięczność wszystkim członkom laboratorium dr Ma w BUCM za nieocenioną dyskusję i pomoc w eksperymentach.

1. Generacja SC2-VLP
<ol>
	<li>Nasiona ~ 3,0 × 106 komórek HEK-293T na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm z kompletną pożywką DMEM, uzupełnioną 10% v/v FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. 
	UWAGA: Aby zapewnić wysoką wydajność transfekcji i optymalną produkcję SC2-VLP, komórki HEK-293T powinny być utrzymywane przy niskich liczbach przejścia ~10.</li>
	<li>Hodować komórkę HEK-293T w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez około 24 godziny i sprawdzić zbieg komórek pod mikroskopem. Kontynuuj, jeśli ~70% zlewa się.</li>
	<li>Rozcieńczyć 60 μl PEI z 1 mg/ml materiału podstawowego do 200 μl pożywką niezawierającą surowicy.</li>
	<li>Dodać 6,7 μg plazmidu N, 10 μg plazmidu Luc-T20, 0,016 μg plazmidu S i 3,3 μg plazmidu M-IRES-E do 200 μl pożywki wolnej od surowicy (patrz plik uzupełniający 1).</li>
	<li>Delikatnie dodać rozcieńczony PEI z kroku 1.3 do roztworu zawierającego plazmidy kodujące białka struktury wirusa z kroku 1.4 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To jest rozwiązanie do transfekcji.</li>
	<li>Ostrożnie upuść roztwór do transfekcji z kroku 1.5 na komórki HEK-293T i delikatnie zakręć płytką do hodowli tkankowej w celu dokładnego wymieszania.</li>
	<li>Zamiana pożywki do hodowli komórkowej 6 godzin po zakażeniu na kompletną pożywkę DMEM i inkubacja transfekowanych komórek HEK-293T w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Zbierz supernatant z zakażonych komórek HEK-293T, który zawiera SC2-VLPs, a następnie przefiltruj supernatant przez filtr strzykawkowy 0,45 μm w celu usunięcia resztek komórek. To jest SC2-VLP medium. 
	UWAGA: Próbowaliśmy wyprodukować SC2-VLP w liniach komórkowych HeLa, Vero E6 i Caco2, ale nie uzyskano mierzalnego miana wirusa, co wskazuje na specyficzność protokołu dla komórek HEK-293T.</li>
</ol>
2. Badanie skuteczności SC2-VLP
UWAGA: Linia komórkowa HEK-293T stabilnie wyrażająca ACE2 i TMPRSS2 została ustanowiona przy użyciu metody transdukcji lentiwirusowej14,15. Ekspresję białek zarówno ACE2, jak i TMPRSS2 potwierdzono za pomocą analizy western blot, zgodnie z protokołem podobnym do opisanego w kroku 3 (analiza składu SC2-VLP).
<ol>
	<li>Wysiew 4.0 × 104 komórek HEK-293T ze stabilną ekspresją ACE2 i TMPRSS2 na płytce 96-dołkowej i dodać 50 μl pożywki SC2-VLP z kroku 1.8.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Wyjąć pożywkę z płytki 96-dołkowej i przemyć raz 100 μl buforu PBS w temperaturze 37 °C, zawierającego 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4.</li>
	<li>Lizować komórki HEK-293T ACE2/TMPRSS2 za pomocą 20 μl pasywnego buforu do lizy, delikatnie kołysząc próbkę przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Bufor do lizy zawiera 25 mM tris-fosforanu (pH 7,8), 2 mM DTT, 2 mM kwasu 1,2-diaminocykloheksano-N,N,N′,N′-tetraoctowego, 1,25 mg/ml lizozymu, 2,5 mg/ml BSA, 10% glicerolu i 1% Triton X-100).</li>
	<li>Wirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 4 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w wirówce do mikropłytek z chłodzeniem, a następnie natychmiast przenieść płytkę do łaźni lodowej.</li>
	<li>Pobrać 100 μl odtworzonego buforu do oznaczania lucyferazy na nieprzezroczystą białą 96-dołkową płytkę i dodać 20 μl lizatu z kroku 2.5. Krótko je wymieszaj, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.</li>
	<li>Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek o następujących parametrach: Tryb detekcji: Luminescencja; Zakres długości fali: Pełne spektrum; Format płytki: 96-dołkowa standardowa nieprzezroczysta płytka; Czas integracji: 200 ms.</li>
</ol>
3. Badanie składu SC2-VLP
<ol>
	<li>Dodać 1,36 ml roztworu PEG 8000, zawierającego 50% PEG 8000 i 2,2% NaCl, do 10 ml pożywki SC2-VLP z kroku 1.8.</li>
	<li>Przechowywać mieszaninę na wytrząsarce orbitalnej i powoli mieszać roztwór w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Odwirować roztwór w temperaturze 4 °C, 2 000 × g przez 30 minut i zebrać osad SC2-VLP do analizy western blot16. 
	UWAGA: W przypadku analizy western blot wszystkie informacje dotyczące przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>
4. Analiza lokalizacji subkomórkowej S i jego mutantów w komórkach wytwarzających SC2-VLP
<ol>
	<li>Wysiew ~3,0 × 106 komórek HEK-293T równomiernie w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem o średnicy 15 mm, a następnie pozwól komórkom przylegać i rosnąć do ~70% zbiegu przed transfekcją.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę transfekcji zgodnie z opisem w krokach od 1.3 do 1.7 i zmodyfikować tylko ilości plazmidu w następujący sposób: plazmid N: 1,3 μg, plazmid Luc-T20: 2 μg, plazmid S: 0,0032 μg i plazmid M-IRES-E: 0,66 μg.</li>
	<li>Delikatnie umyj naczynie hodowlane dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS, a następnie dodaj 1 ml 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd (PFA) w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.</li>
	<li>Myj komórki przez 2 x 5 minut 1 ml PBS w temperaturze pokojowej, a następnie przepuszczaj komórki, dodając 1 ml 0,25% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Myj komórki przez 2 x 5 minut 1 ml PBS w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 1 ml 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby zablokować niespecyficzne interakcje przeciwciał.</li>
	<li>Dodać ~200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (tyle, aby przykryć szklane dno) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Pierwszorzędowe roztwory przeciwciał przygotowuje się przez rozcieńczenie w 5% BSA rozpuszczonym w PBS w następujących proporcjach rozcieńczenia: mysie przeciwciało anty-S w stosunku 1:200, królicze przeciwciało anty-Sec61β w stosunku 1:200, królicze przeciwciało anty-GM130 w stosunku 1:200 i królicze przeciwciało anty-ERGIC53 w stosunku 1:200. 5% roztwór BSA/PBS służył zarówno jako rozcieńczalnik, jak i bufor blokujący, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie podczas kolejnych procedur barwienia immunofluorescencyjnego.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego, a następnie przemywać komórki przez 3 x 5 minut 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać sprzężony z fluorescencją roztwór przeciwciał drugorzędowych w RT przez 1 godzinę, a następnie przemywać komórki przez 3 x 5 minut 1 ml PBS w RT. 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w ciemności lub przy minimalnym nasłonecznieniu, aby zapobiec fotowybielaniu koniugatów fluorescencyjnych i zachować integralność sygnału. Dwa typy przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorescencją, które pochodzą od myszy lub królika, są wykorzystywane do barwienia białka S lub białek markerowych organelli komórkowych.</li>
	<li>Wybarwić jądra 2,5 μg/ml roztworu Hoechsta w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie przemyć komórki przez 3 x 5 minut 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Obserwuj barwienie białka S lub organelli i uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego o następujących parametrach: tryb PMT ustawiony na VBF (bez uśredniania, sekwencyjne skanowanie linii) z automatyczną aperturą konfokalną. Dla kanału 1 (FITC) należy użyć lasera 488 nm o mocy 25% z emisją 500 - 548 nm, HV 525 V, wzmocnieniu 1x i przesunięciu 5%. W przypadku kanału 2 (Alexa Fluor 594) należy użyć lasera 594 nm o mocy 25% z emisją 610 - 670 nm, HV 500 V, wzmocnieniu 1x i przesunięciu 5%. Dla kanału 3 (DAPI) użyj lasera 405 nm o mocy 25% z emisją 430 - 470 nm, HV 490 V, wzmocnieniu 1x i przesunięciu 5%.</li>
</ol>

<ol><li>Narayanan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+SARS-CoV-2+and+COVID-19+review%2C+Part+2%3A+host+extracellular+to+systemic+effects+of+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection.</a> Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).</li>
<li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+receptor+recognition+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2.</a> Nature. 581 (7807), 221-224 (2020).</li>
<li>Lan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+SARS-CoV-2+spike+receptor-binding+domain+bound+to+the+ACE2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor.</a> Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+SARS-CoV-2+membrane+protein+essential+for+virus+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of SARS-CoV-2 membrane protein essential for virus assembly.</a> Nat Commun. 13 (1), 4399(2022).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+N+protein+coordinates+viral+particle+assembly+through+multiple+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 N protein coordinates viral particle assembly through multiple domains.</a> J Virol. 98 (11), e0103624(2024).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">beta-coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535.e14 (2020).</li>
<li>Andrews, H. S., Herman, J. D., Gandhi, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Treatments for COVID-19.</a> Annu Rev Med. 75, 145-157 (2024).</li>
<li>Crawford, K. H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+and+reagents+for+pseudotyping+lentiviral+particles+with+SARS-CoV-2+spike+protein+for+neutralization+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays.</a> Viruses. 12 (5), 513(2020).</li>
<li>Sultana, R., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+SARS-CoV-2+virus-like+particle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of SARS-CoV-2 virus-like particle systems.</a> Virology. 601, 110285(2025).</li>
<li>Xu, R., Shi, M., Li, J., Song, P., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+SARS-CoV-2+virus-like+particles+by+mammalian+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of SARS-CoV-2 virus-like particles by mammalian expression system.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 862(2020).</li>
<li>Plescia, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+viral+budding+and+entry+can+be+modeled+using+BSL-2+level+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 viral budding and entry can be modeled using BSL-2 level virus-like particles.</a> J Biol Chem. 296, 100103(2021).</li>
<li>Cruz-Cardenas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pseudovirus-based+platform+to+measure+neutralizing+antibodies+in+Mexico+using+SARS-CoV-2+as+proof-of-concept%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept.</a> Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).</li>
<li>Syed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assessment+of+SARS-CoV-2-evolved+variants+using+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid assessment of SARS-CoV-2-evolved variants using virus-like particles.</a> Science. 374 (6575), 1626-1632 (2021).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Matsuyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+isolation+of+SARS-CoV-2+by+TMPRSS2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Enhanced isolation of SARS-CoV-2 by TMPRSS2-expressing cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (13), 7001-7003 (2020).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+and+optimizing+Western+blots+with+an+emphasis+on+chemiluminescent+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection.</a> Methods Enzymol. 463, 573-599 (2009).</li>
<li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+biology+and+replication%3A+implications+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (3), 155-170 (2021).</li>
<li>Yang, H., Rao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+SARS-CoV-2+and+implications+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (11), 685-700 (2021).</li>
<li>Katiyar, H., Arduini, A., Li, Y., Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+assembly%3A+Gaining+infectivity+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 assembly: Gaining infectivity and beyond.</a> Viruses. 16 (11), 1648(2024).</li>
<li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+structure+and+replication+characterized+by+in+situ+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography.</a> Nat Commun. 11 (1), 5885(2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+spike+host+cell+surface+exposure+promoted+by+a+COPI+sorting+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 spike host cell surface exposure promoted by a COPI sorting inhibitor.</a> Acta Pharm Sin B. 13 (7), 3043-3053 (2023).</li>
<li>Dey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+C-terminal+residue+controls+SARS-CoV-2+spike+trafficking+and+incorporation+into+VLPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A single C-terminal residue controls SARS-CoV-2 spike trafficking and incorporation into VLPs.</a> Nat Commun. 14 (1), 8358(2023).</li>
<li>Christie, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-virus+tracking+reveals+variant+SARS-CoV-2+spike+proteins+induce+ACE2-independent+membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-virus tracking reveals variant SARS-CoV-2 spike proteins induce ACE2-independent membrane interactions.</a> Sci Adv. 8 (49), eabo3977(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetable+elements+in+SARS-CoV-2+S2+subunit+for+the+design+of+pan-coronavirus+fusion+inhibitors+and+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targetable elements in SARS-CoV-2 S2 subunit for the design of pan-coronavirus fusion inhibitors and vaccines.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 197(2023).</li>
<li>Mi, D., Hu, J., Qian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+pseudotype+system+to+characterize+SARS-CoV-2+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A lentiviral pseudotype system to characterize SARS-CoV-2 glycoprotein.</a> Methods Mol Biol. 2610, 187-199 (2023).</li>
<li>Swann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+system+for+assembly+of+SARS-CoV-2+virus+like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Minimal system for assembly of SARS-CoV-2 virus like particles.</a> Sci Rep. 10 (1), 21877(2020).</li>
<li>Xia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+mediate+antibody-resistant+transmission+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles mediate antibody-resistant transmission of SARS-CoV-2.</a> Cell Discov. 9 (1), 2(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Prosta i skuteczna metoda modelowania cyklu życiowego SARS-CoV-2 w systemach hodowli komórkowych, bez ograniczeń laboratoriów BSL-3, stanowi kluczowy postęp w badaniach nad anty-SARS-CoV-2. Metoda SC2-VLP spełnia tę potrzebę, oferując solidną i dostępną platformę. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół metody SC2-VLP, przedstawiając krytyczne etapy eksperymentalne wytwarzania SC2-VLP. Ponadto podkreślamy jej wszechstronność i potencjalne zastosowania w pogłębianiu naszej wiedzy na temat biologii SARS-CoV-2 i uł...

Pandemia COVID-19 stała się jednym z najbardziej niszczycielskich globalnych kryzysów zdrowotnych we współczesnej historii, powodując miliony zgonów na całym świecie1. Odpowiedzialny za to wirus, SARS-CoV-2, przechodzi złożony cykl życiowy, który obejmuje kluczowe etapy, takie jak infekcja, replikacja genomu, montaż i wyjście. Proces infekcji rozpoczyna się, gdy białko kolca wirusa (S) wiąże się z receptorem komórki gospodarza, enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2), ułatwiając uwalnianie genomu wirusa do komórki gospodarza2,3. Wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA (RdRp) katalizuje następnie replikację genomowego RNA. To RNA, w kompleksie z białkiem nukleokapsydu (N), tworzy stabilną strukturę, która jest rozpoznawana przez białko błonowe (M). Białko M odgrywa kluczową rolę w składaniu wirusa poprzez rekrutację kompleksu RNA-N, S i białka otoczki (E)4,5. Po złożeniu wirion kończy swoją ewakuację przez niekanoniczny szlak transportowy, w którym pośredniczy lizosom6.
W odpowiedzi na pandemię, znaczne globalne zasoby zostały zmobilizowane do opracowania szczepionek, przeciwciał neutralizujących i leków przeciwwirusowych. Ocena tych interwencji miała zasadnicze znaczenie dla postępów w badaniach nad SARS-CoV-27. Jednak badanie żywego wirusa stanowi poważne wyzwanie logistyczne, ponieważ eksperymenty z udziałem wirusa muszą być przeprowadzane w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). Ograniczona dostępność urządzeń BSL-3 ograniczyła tempo badań mających na celu zrozumienie i zwalczanie SARS-CoV-2.
Aby sprostać tym wyzwaniom, w badaniach nad SARS-CoV-2 szeroko zastosowano dwa główne systemy - cząsteczki wirusopodobne (VLP) i pseudotypowanie lentiwirusowe - z których oba nie wymagają zabezpieczenia BSL-38. System VLP polega na kotransfekcji komórek z genami kodującymi białka strukturalne wirusa, w tym M, S, E i N, które razem generują cząsteczki wirusopodobne. Cząstki te naśladują strukturalne i funkcjonalne właściwości wirusa, co czyni je cennym narzędziem do badania kluczowych procesów w cyklu życiowym SARS-CoV-2, a nawet skutecznym antygenem do opracowywania szczepionek9,10,11.
Odwrotnie, system pseudotypowania lentiwirusa polega na zastąpieniu białka G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) w lentiwirusie białkiem S SARS-CoV-2, umożliwiając produkcję cząsteczek lentiwirusowych, które mogą zawierać geny reporterowe, takie jak lucyferazy lub GFP. System ten jest szczególnie przydatny do badania przeciwciał neutralizujących, które blokują interakcję S-ACE212. Jednak pseudotypowanie lentiwirusa nie odzwierciedla składania się lub wychodzenia wirusa SARS-CoV-2 ze względu na zastosowanie białek strukturalnych HIV, które pośredniczą w uwalnianiu cząstek przez błonę plazmatyczną.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, Syed i in. niedawno zidentyfikowali sygnał pakowania SARS-CoV-2 w swoim genomie RNA, co pokazuje specyficzność białka N w rozpoznawaniu genomu wirusa13. Łącząc ten sygnał pakowania z genami reporterowymi, możliwe jest skuteczne włączenie tych genów do cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 (SC2-VLPs)13. Strategia ta nie tylko replikuje procesy montażu i wychodzenia SARS-CoV-2, ale także pozwala na czuły pomiar etapów infekcji. W niniejszym opracowaniu przedstawiono eksperymentalną metodologię korzystania z systemu SC2-VLP i podkreślono kluczowe kwestie związane z przeprowadzeniem tego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermofisher</td><td>A5670402</td><td></td></tr><tr><td>Koza Przeciw Myszom IgG H& Przeciwciało L (Alexa Fluor 488)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>stosunek rozcieńczenia: IF 1:1000</td></tr><tr><td>Koza Anty-Królicza IgG H& Przeciwciało L (Alexa Fluor 594)</td><td>Abcam</td><td>ab150080</td><td>współczynnik rozcieńczenia: IF 1:1000</td></tr><tr><td>Linia komórkowa HEK-293T</td><td>Krajowa Infrastruktura Zasobów Linii Komórkowych (NICR)</td><td>NICR-293T-001</td><td>Aby zapewnić wysoką wydajność transfekcji i optymalną produkcję SC2-VLP, komórki HEK-293T powinny być utrzymywane przy niskich liczbach pasażowania (&le; P10).</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>Stężenie robocze: 2,5 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Lucyferazy Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>Luc-T20</td><td>Addgene</td><td>177941</td><td></td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty-GAPDH</td><td>Proteintech</td><td>60004-1-Ig</td><td>stosunek rozcieńczenia: WB 1:20 000</td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty-S RBD</td><td>Abclonal</td><td>A23771</td><td>stosunek rozcieńczenia: IF 1:200</td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermofisher</td><td>31985070</td><td>bezsurowicowa pożywka do transfekcji</td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3635</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenoimina (PEI)</td><td>Thermofisher</td><td>43896.01</td><td></td></tr><tr><td>Pasywny bufor do lizy Promega</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-ACE2 królika</td><td>Proteintech</td><td>21115-1-AP</td><td>stosunek rozcieńczenia: WB 1:1000</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-ERGIC53</td><td>Proteintech</td><td>13364-1-AP</td><td>stosunek rozcieńczenia: IF 1:200</td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-GM130 królik</td><td>Proteintech</td><td>11308-1-AP</td><td>stosunek rozcieńczenia: IF 1:200</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-S</td><td>Abcam</td><td>ab272504</td><td>stosunek rozcieńczenia: WB 1:1000</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-Sec61&beta;</td><td>Proteintech</td><td>15087-1-AP</td><td>Współczynnik rozcieńczenia: IF 1:200</td></tr><tr><td>Poliklonalny anty-TMPRSS2 królik</td><td>Abcam</td><td>ab109131</td><td>Stosunek rozcieńczenia: WB 1:1000</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Plazmid M-IRES-E</td><td>Addgene</td><td>177938</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 N plazmid</td><td>Addgene</td><td>177959</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 Nukleoproteina MAb</td><td>królika Abclonal A21042</td><td></td><td>Współczynnik rozcieńczenia: WB 1:4000</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 S plazmid</td><td>Addgene</td><td>177960</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne, HRP, Kozia anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>Stosunek rozcieńczenia: WB 1:5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe, HRP, Kozia anty-królicza IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>31430</td><td>Stosunek rozcieńczenia: WB 1:5000</td></tr><tr><td>Czytnik płytek SpectraMax i3x&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax i3x</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja systemu cząstek wirusopodobnych sars-cov-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Production of a SARS-CoV-2 Virus-Like-Particle System to Investigate Viral Life Cycles In Vitro

Metoda zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej z wirusopodobnymi cząsteczkami koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) oferuje potężne i dostępne narzędzie do badania cyklu życiowego SARS-CoV-2 bez potrzeby korzystania z laboratoriów o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3). System ten skutecznie naśladuje krytyczne etapy cyklu życia wirusa, w tym składanie, pakowanie genomu i wyjście, wykorzystując reporter lucyferazy połączony z sygnałem T20 w celu czułego i precyzyjnego wykrywania produkcji cząstek wirusa. SC2-VLP są generowane przez koekspresję białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym błony (M), nukleokapsydu (N), envelop (E) i spike (S), wraz z sygnałem pakowania RNA w komórkach HEK-293T. W przeciwieństwie do tradycyjnych systemów cząstek wirusopodobnych, metoda SC2-VLP zapewnia dokładną kwantyfikację i większą wierność naturalnemu cyklowi życia wirusa. Ponadto, w porównaniu z metodami pseudotypowania lentiwirusa, które ograniczają się do badania wnikania wirusa poprzez włączenie białka S do cząstek lentiwirusa opartych na HIV, system SC2-VLP stanowi bardziej wszechstronną platformę do badania wielu etapów biologii SARS-CoV-2. Chociaż ta metoda omija ryzyko związane z obsługą żywego wirusa i rozszerza dostępność. Metoda SC2-VLP stanowi znaczący postęp w badaniach nad lekami przeciwwirusowymi i opracowywaniu strategii terapeutycznych przeciwko SARS-CoV-2.

Etapy uwalniania i składania w cyklu życiowym SARS-CoV-2 były słabiej zbadane niż etapy infekcji i replikacji17,18. Przed opracowaniem metody SC2-VLP procesy te można było badać jedynie z wykorzystaniem żywego wirusa SARS-CoV-2, co ograniczało badania do laboratoriów poziomu BSL-313. Schemat SC2-VLP, przedstawiony na Rysunku 1, opisuje protokół eksperymentalny i ilustruje procesy zachodzące w tych etapach cykl...

Prezentujemy zoptymalizowany protokół in vitro do wytwarzania cząsteczek podobnych do wirusa SARS-CoV-2, które ściśle naśladują autentycznego wirusa. Takie podejście umożliwia badanie mechanizmów infekcji wirusowej, montażu i wychodzenia bez ograniczeń związanych z koniecznością posiadania laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

The severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus-like particle (SC2-VLP) method offers a powerful and accessible tool for studying ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu biologii wirusa SARS-CoV-2 i próbie znalezienia leków, w szczególności medycyny chińskiej, przeciwko SARS-CoV-2. Wszystkie badania nad żywym wirusem SARS-CoV-2 muszą być kontrolowane w laboratorium na trzecim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. A to eksperymentalne ograniczenie sprawia, że badanie SARS-CoV-2 jest możliwe tylko w przypadku kilku osób. Wirus SARS-CoV-2 podobnie jak praktyczna metoda badania SARS-CoV-2 możliwa bez ograniczenia bezpieczeństwa biologicznego poziomu trzeciego laboratorium, a lista będzie bardzo przydatną metodą.[Instruktor] Na początek wysiewaj około 3 milionów komórek HEK-293T na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 10 centymetrów z kompletnym podłożem DMEM, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny. Sprawdź płynność współczynnika komórkowego pod mikroskopem. Rozcieńczyć 60 mikrolitrów PEI z jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego pożywką bez surowicy, aby osiągnąć końcową objętość 200 mikrolitrów. Teraz weź 200 mikrolitrów pożywki bez surowicy i dodaj do niej 6,7 mikrograma plazmidu N, 10 m

production-sars-cov-2-virus-like-particle-system-to-investigate-viral

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Źródło: Hoenen, T., et al. Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes. J. Vis. Exp. (2014)W niniejszym filmie zaprezentowano sposób transfekcji ludzkich komórek tetracistronicznym plazmidem minigenomu imitującym genom wirusa Ebola wraz z plazmidami pomocniczymi. Wewnątrz komórek dochodzi do ekspresji białek wirusowych oraz lucyferazy, co prowadzi do montażu i pączkowania niepatogennych, zdolnych do...

Produkcja zawierających reporter cząstek wirusopodobnych wirusa Ebola zdolnych do transkrypcji i replikacji

Źródło: Chen, Z., et al. Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry. J. Vis. Exp. (2018)W niniejszym filmie zaprezentowano metodę kontrolowanej ekspresji białka kapsydu bakteriofaga Qβ w zmodyfikowanych szczepach E. coli. Powstałe białka ulegają samoroskładaniu w cząsteczki przypominające wirusy (VLP), które są następnie pozyskiwane do dalszej biokoniugacji.

Produkcja cząsteczek wirusopodobnych w zmodyfikowanych E. coli

Ten film pokazuje generowanie cząsteczek wirusopodobnych do grypy (VLP) w organizmie ssaków. Po ekspresji trzech eukariotycznych wektorów ekspresyjnych - kodujących różne białka strukturalne wirusa - w odpowiednich komórkach gospodarza ssaków, wyrażone białka wirusowe samoorganizują się w VLP na błonie plazmatycznej gospodarza i uwalniają się poprzez pączkowanie z powierzchni komórki.

Technika wytwarzania cząstek podobnych do wirusa grypy przez system ssaków

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Tetrarazystroniczne cząstki wirusopodobne zawierające replikację i transkrypcję (trVLP) reprezentują system modelowania cyklu życia, który pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, opierając się wyłącznie na składnikach wirusa Ebola.

Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Tutaj prezentujemy protokół generowania pseudotypowanych cząstek w ustawieniu BSL-2 zawierających białko kolca wysoce patogennych wirusów bliskowschodniego zespołu oddechowego i koronawirusów zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej. Te pseudotypowane cząstki zawierają gen reporterowy lucyferazy, który umożliwia ilościowe określenie wnikania wirusa do docelowych komórek gospodarza.

Produkcja pseudotypowanych cząstek do badania wysoce zjadliwych koronawirusów w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Ten protokół opisuje dynamikę infekcji wirusowych za pomocą rekombinowanego (r)SARS-CoV-2 z ekspresją lucyferazy i fluorescencji oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) u transgenicznych myszy K18 hACE2, aby przezwyciężyć potrzebę wtórnych podejść wymaganych do badania infekcji SARS-CoV-2 in vivo.

Obrazowanie na żywo i kwantyfikacja infekcji wirusowej u myszy transgenicznych K18 hACE2 przy użyciu rekombinowanego SARS-CoV-2 z ekspresją reporterową

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metodę produkcji cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 w komórkach HEK-293T do badań cyklu życiowego wirusa. Ta technika umożliwia bezpieczne badanie zakażenia i składania wirusa bez laboratorium BSL-3.

Produkcja systemu cząstek wirusopodobnych SARS-CoV-2 do badania cykli życiowych wirusa in vitro

Przeglądaj więcej filmów