Name: Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Naucz się ekstrakcji DNA z gatunków Mycobacterium za pomocą metody CTAB. Ta technika pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA o czystości 260/280 w zakresie 1,9–2,0, nadający się do sekwencjonowania całego genomu i badań genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają szczere podziękowania zespołowi genomiki gruźlicy: Nabili Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa oraz Robowi M Warrenowi za ich wkład w rozwój i optymalizację tego protokołu oraz za nieocenione wsparcie podczas całego badania. Prace te oraz zaangażowane osoby były wspierane grantami i finansowaniem od South African Medical Research Council (SAMRC), National Research Foundation (NRF) oraz Uniwersytetu w Stellenbosch (SU). Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu danych, analizie ani przygotowaniu manuskryptów.

Reprezentatywne wyniki zostały opracowane za zgodą komisji etyki REC: BES: BES, Uniwersytet w Stellenbosch (BES-2024-22504). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie wsewininy posiewki mykobakterii
UWAGA: W zależności od badanego gatunku, ten etap musi być przeprowadzony w laboratorium poziomu 2 (BSL-2) lub poziomu 3 (BSL-3). Czas inkubacji i warunki hodowli zależą również od potrzeb wzrostu gatunku mykobakterialnego ze względu na ich specyficzne tempo wzrostu i cechy fizjologiczne.
<ol>
	<li>Przygotuj 5 mL lub 8 mL hodowli bakteryjnej odpowiednio w płynnym medium Middlebrook 7H9 lub MGIT, uzupełnionym OADC i inkubuj w temperaturze 37 °C przez wymagany okres, aby umożliwić wzrost bakterii. Wolno rosnące grzybniki potrzebują 10-14 dni, natomiast szybko rosnące około 2-5 dni. UWAGA: Zawiesina komórek mykobakterii może być przygotowana przez zeskrobanie pętli kolonii do sterylnej podwójnie destylowanej wody, jeśli hodowla początkowa pochodzi z płyt agarowych (np. agar Middlebrook 7H10).</li>
	<li>Wlej płynną kulturę do probówek po 15 mL.</li>
	<li>Zabij hodowlę cieplną w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w inkubatorze.</li>
	<li>W przypadku Mycobacterium tuberculosis lub innych patogennych gatunków wymagających BSL-3, przenieś hodowle zabijane termicznie do laboratorium BSL-2.</li>
</ol>
2. Trawienie ściany komórkowej i ekstrakcja DNA
UWAGA: Po inaktywacji hodowli termicznej można bezpiecznie przeprowadzić następujące kroki w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Jeśli celem jest ekstrakcja do sekwencjonowania długiego odczytu lub alternatywnych zastosowań wymagających DNA o dużej masie cząsteczkowej, koniecznie stosuj końcówki pipety o szerokim przeciętnym przekształceniu, a na etapach wirów zastępuj wir inwersją lub mieszaniem pipet.
<ol>
	<li>Wiruj probówkę 15 mL w dawce 3220 x g przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń przezroczysty supernatant (upewnij się, że wszystkie materiały są usunięte).</li>
	<li>Dokładnie ponownie zawiesz pellet hodowli w 300 μL buforu Tris-EDTA (TE).</li>
	<li>Przelej ponownie zawiesinowany pellet do probówki 2 mL.</li>
	<li>Dodaj 100 μL lizozymu (10 mg/mL) i wymieszaj pipetowanie pipetowaniem w górę i w dół 5 razy, a następnie delikatnie stukaj w probówkę, aby zapewnić równomierną dyspersję.</li>
	<li>Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 °C na rotacyjnym inkubatorze przez noc (~16 h; krótszy czas inkubacji może obniżyć efektywność lizy i w konsekwencji prowadzić do niskiej wydajności DNA).</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj mieszankę 5 μL proteinazy K (10 mg/mL) oraz 70 μL 10% SDS. Na przykład, jeśli jest pięć próbek, przygotuj 350 μL 10% SDS i 25 μL Proteinazy K. Wymieszaj przez odwrócenie probówki, aby zapobiec powstawaniu piany.</li>
	<li>Dodaj 75 μL tej mieszaniny do każdej próbki.</li>
	<li>Mieszaj przez stukanie i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 minut w inkubatorze lub bloku grzewczym, z mieszaniem przerywanym przez inwersję.</li>
	<li>Dodaj 100 μL 5 M NaCl.</li>
	<li>Dodaj 100 μL roztworu CTAB/NaCl w temperaturze 65 °C. UWAGA: Podgrzej roztwór CTAB/NaCl do 65 °C przed zapewnieniem dokładności pipetowania, biorąc pod uwagę lepkość substancji w RT.</li>
	<li>Mieszaj przez stukanie, aż roztwór stanie się mleczny.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 minut w inkubatorze lub bloku grzewczym, z przerywanym mieszaniem przez inwersję.</li>
	<li>Dodaj do każdej próbki równą objętość (~ 675 μL) roztworu chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1) i wymieszaj przez stuknięcie. UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie wyparowym, ponieważ chloroform jest toksyczny w przypadku wdychania i wymaga ostrożnego obchodzenia.</li>
	<li>Wiruj próbki w temperaturze 12000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie zasysaj 550-600 μL fazy wodnej (górnej) do sterylnych probarek 1,5 mL i odpowiednio je oznaczyć. UWAGA: Uważaj, aby nie ruszyć innych warstw. Jeśli któreś warstwy zostaną przypadkowo uszkodzone, ponownie wiruj rurkę.</li>
</ol>
3. Wytrącanie i elucia DNA
<ol>
	<li>Dodaj równą objętość (550-600 μL) lodowatego izopropanolu i wymieszaj przez odwrócenie rurek. UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest wysokie, podczas mieszania może powstać biała wytrąca.</li>
	<li>Inkubuj rurki w temperaturze -20 °C przez 30 minut do 1 godziny. UWAGA: Dłuższe czasy inkubacji mogą zwiększyć wytrącenie DNA18 , ale mogą również prowadzić do współwydzielania soli. Dlatego inkubacja nocna może być przeprowadzona, jeśli spodziewane jest niskie stężenie DNA.</li>
	<li>Wiruj w najwyższej prędkości (~21130 x g) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić nierozpuszczalne DNA. UWAGA: Upewnij się, że przednia strona rurek 1,5 jest skierowana do wewnątrz wirnika wirówki. Na tym etapie DNA wytrąca się na dnie i wzdłuż tyłu rurek. Jest to ważne, aby nie zakłócić potencjalnie niewidocznego pelletu w kolejnym etapie. Biały osad lub osad może być widoczny, jeśli stężenie DNA jest wysokie. Brak granulki nie oznacza nieudanej ekstrakcji; Kontynuuj pozostałe kroki.</li>
	<li>Aspiruj supernatant z przedniej strony rurki, nie naruszając granulatu DNA ani nie dekantując go szybko, jednocześnie dbając o to, aby granulek pozostał nieruszony. UWAGA: Lepiej aspirować supernatant, jeśli hodowla początkowa jest mała i spodziewane jest niskie stężenie DNA.</li>
	<li>Dodaj 1000 μl lodowatego etanolu o 75%.</li>
	<li>Mieszaj, odwracając rurki kilka razy.</li>
	<li>Wirówka w 12000 × g przez 30 minut (w tej samej orientacji co w kroku 3).</li>
	<li>Wsysaj lub przelewaj cały etanol, nie naruszając granulki. UWAGA: Kroki 5-8 można powtórzyć, jeśli przewiduje się wysoką ilość koprecipitacji soli.</li>
	<li>Pozwól tubkom wyschnąć na powietrzu w RT przez noc lub przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Do każdej probówki dodaj 25-50 μL buforu TE (pH 8), aby ponownie zawiesować DNA. UWAGA: DNA może być ponownie zawieszone w wodzie buforowej Tris (10 mM, pH 8) lub w wodzie bez nukleazy, jeśli aplikacje w dalszej części rzeki są wrażliwe na EDTA.</li>
	<li>Pozwól, by pellet DNA ponownie zawiesił się przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni przed przeprowadzeniem oceny jakości.</li>
	<li>Przechowuj w -80 °C przez dłuższy czas.</li>
</ol>
4. Ilościowa identyfikacja DNA i kontrola jakości
UWAGA: Kontrola jakości DNA jest zazwyczaj wykonywana za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i elektroforezy żelowej. System ilościfikacji oparty na fluorescencji może być również używany do ilościowego określenia wyodrębnionego DNA.
<ol>
	<li>Metoda spektrofotometru<ol>
		<li>Zmierz stężenie DNA i określ jakość zgodnie z zaleceniami producenta. UWAGA: Próbka DNA powinna mieć stosunek 260/280 między 1,7 a 2,0. Wartość 1,8 jest zwykle uznawana za czystą dla DNA. Wartości poniżej tego zakresu wskazują na zanieczyszczenie białkiem pozostałym, guanidyną lub innymi odczynnikami, które silnie wchłaniają się na głębokości 280 nm lub w jej okolicy. Idealny jest stosunek 260/230 między 2,0-2,2. Jeśli stosunek jest niższy niż oczekiwano, może to wskazywać na obecność zanieczyszczeń wchłaniających się w 230 nm, takich jak EDTA, fenol i węglowodany. Sprawdź również wykresy absorpcji uzyskane dla próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforeza żelowa<ol>
		<li>Wykonaj elektroforezę żelowąagarozową 19 , aby ocenić integralność DNA i ustalić, czy doszło do fragmentacji lub degradacji.</li>
		<li>Aby wizualizować DNA w systemie dokumentacji żelu UV, użyj żelu agarozowego o zawartości 1,0% zawierającego barwnik SYBR Safe. Uruchom żel na 80 V przez 45 minut. UWAGA: Celem jest posiadanie wyraźnych, wyraźnych, wysokomolekularnych pasów powyżej najwyższego pasma drabiny DNA. Za każdym razem używaj nowego bufora 1× TAE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>FBouso, J. M., Planet, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+non-tuberculous+mycobacteria+whole+genomes+using+an+optimized+DNA+extraction+protocol+for+long-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing.</a> BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).</li>
<li>Daffé, M., Marrakchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+the+mycobacterial+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of the mycobacterial envelope.</a> Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).</li>
<li>Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonreplicating+persistence+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).</li>
<li>Mohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+DNA+isolation+method+for+detection+of+non-tuberculous+mycobacteria+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction.</a> Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).</li>
<li>Van Soolingen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+and+stability+of+insertion+sequences+in+Mycobacterium+tuberculosis+complex+strains%3A+Evaluation+of+an+insertion+sequence-dependent+DNA+polymorphism+as+a+tool+in+the+epidemiology+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).</li>
<li>Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from bacteria.</a> Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).</li>
<li>Van Embden, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+DNA+fingerprinting%3A+Recommendations+for+a+standardized+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology.</a> J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).</li>
<li>Wang, W. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates+and+construction+of+a+Beijing+lineage+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome.</a> Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).</li>
<li>Epperson, L. E., Strong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable%2C+efficient%2C+and+safe+method+to+prepare+high+quality+DNA+from+mycobacteria+and+other+challenging+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Tuberc+Other+Mycobact+Dis%22%5BJournal%5D)">A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells.</a> J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).</li>
<li>Warren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+Mycobacterium+tuberculosis+DNA+extraction+method+that+does+not+compromise+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity.</a> J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).</li>
<li>Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extraction+methods+for+Mycobacterium+bovis%2C+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium+subsp.+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium.</a> Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).</li>
<li>Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+different+DNA+isolation+methods+from+MGIT+culture+for+long-read+whole+genome+sequencing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).</li>
<li>Opperman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+avium+DNA+extraction%3A+Implications+for+NTM+identification+and+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22South+Afr+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing.</a> South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).</li>
<li>Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFroenicke%2C+L+%22DNA+Technol+Core%22">DNA Technol Core</a>. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).</li>
<li>Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFroenicke%2C+L+%22DNA+Technol+Core%22">DNA Technol Core</a>. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).</li>
<li>Dippenaar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+whole+genome+amplification+for+sequencing+minute+amounts+of+purified+Mycobacterium+tuberculosis+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA.</a> Sci Rep. 14, 9931(2024).</li>
<li>Doig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+heat-killing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+investigation+of+key+factors+of+nucleic+acid+precipitation+toward+optimized+DNA%2FRNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation.</a> Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).</li>
<li>Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+element+IS1081-associated+restriction+fragment+length+polymorphisms+in+Mycobacterium+tuberculosis+complex+species%3A+A+reliable+tool+for+recognizing+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG.</a> J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).</li>
<li>Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+heat+killing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).</li>
<li>Dippenaar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+potential+of+Oxford+Nanopore+Technologies+sequencing+for+Mycobacterium+tuberculosis+sequencing%3A+An+assessment+of+R10+flowcells+and+V14+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry.</a> PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+DNA+sequencing+to+quantify+Mycobacterium+tuberculosis+DNA+and+diagnose+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis.</a> Sci Rep. 12, 16972(2022).</li>
<li>Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics%3A+The+next+culture-independent+game+changer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics: The next culture-independent game changer.</a> Front Microbiol. 8, 1069(2017).</li>
<li>Marshall, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+identification+of+non-tuberculous+mycobacteria+from+environmental+samples%3A+A+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review.</a> Tuberculosis. 138, 102291(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Reprezentatywne wyniki pokazują użyteczność metody CTAB w ekstrakcji DNA z gatunków mykobakterii oraz w rozwiązywaniu wyzwań związanych z ekstrakcją DNA z tych organizmów. Mykobakterie są dobrze znane ze swoich złożonych i bogatych w lipidy ścian komórkowych2. Obecne wyniki podkreślają kilka kluczowych aspektów, które przyczyniają się do sukcesu tej techniki, ponieważ dostarcza ona nienaruszone DNA o wysokim stężeniu, wysokiej jakości, które powinno być odpowiednie do dalszych zastosowań, takich j...

Ekstrakcja wysokiej jakości DNA to fundamentalny etap biologii molekularnej, niezbędny do dalszych zastosowań, takich jak PCR, sekwencjonowanie całego genomu i inne badania genomowe. W przypadku Mycobacterium, rodzaju obejmującego zarówno gatunki patogenne, takie jak Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), jak i niepatogenne gatunki środowiskowe, takie jak Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), ekstrakcja DNA może być trudna ze względu na ich grube, bogate w lipidy i hydrofobowe ściany komórkowe 1,2,3. Ta wytrzymała ściana komórkowa wymaga stosowania specjalistycznych metod lizy do rozbicia komórek i skutecznego uwalniania DNA genomowego.
Metoda bromku cetylotrymetylamoniowego (CTAB) okazała się skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości DNA z różnych gatunków mykobakterii 4,5. CTAB, kationowy surfaktant, wiąże się z polisacharydami i innymi składnikami komórki, ułatwiając ich usunięcie podczas procesu ekstrakcji6. Nawet przy trudnych próbkach protokół oparty na CTAB zapewnia efektywną izolację nienaruszonego i czystego DNA, szczególnie w połączeniu z lizą enzymatyczną, obróbką cieplną oraz ekstrakcją rozpuszczalnikami organicznymi 7,8. Metoda CTAB odegrała kluczową rolę w efektywnej ekstrakcji DNA z gatunków mykobakterii, szczególnie w badaniach związanych z sekwencjonowaniem całego genomu, metagenomiką oraz diagnostyką molekularną, które wymagają czystego i wysokiej jakości materiału wejściowego DNA 9,10. W porównaniu z innymi technikami ekstrakcji DNA, takimi jak bead-beating czy komercyjne zestawy, przedstawiony tutaj protokół CTAB oferuje wyraźną przewagę w zachowaniu integralności DNA, co jest kluczowym czynnikiem dla długoodczytowego sekwencjonowania i zastosowań epigenetycznych. Chociaż wcześniejsze badania wykazały niższe wydajności DNA przy CTAB w porównaniu do metod zakłócania mechanicznego, podkreślają one również jego zdolność do minimalizowania ścinania DNA i utrzymania integralności DNA11,12. Aby zniwelować ograniczenia czystości i wydajności, obecny protokół został zoptymalizowany, skracając czas inkubacji i poprawiając spójność w różnych typach próbek. To udoskonalenie potwierdziły wyniki Oppermana i in., którzy wykazali, że DNA ekstrahowane przez CTAB z hodowli Mycobacterium avium ma wystarczające stężenie i jakość do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie rRNA 16S i testy liniowe, co dodatkowo wspiera zastosowanie protokołu CTAB jako wszechstronnego i skalowalnego narzędzia w badaniach mykobakterii, szczególnie w badaniach wymagających nienaruszonego DNA genomowego do zaawansowanych analiz molekularnych13. Dodatkowo, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zazwyczaj wymaga 100-1000 ng wysokiej jakości DNAgenomowego 14, a w przypadku sekwencjonowania długiego odczytu, takiego jak sekwencjonowanie PacBio, wymaga ≥5 μg wysokiej jakości DNA15, dlatego gdy potrzebne są duże ilości wysokiej jakości i nienaruszonego DNA, CTAB pozostaje efektywną metodą16.
Ustanowienie efektywnych, spójnych i skutecznych metod ekstrakcji DNA z mikroorganizmów trudnych do rozlewu jest konieczne, aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność we wszystkich laboratoriach, szczególnie w zakresie identyfikacji szczepów i badań epidemiologicznych 5,7. Protokół ten zawiera szczegóły dotyczące ekstrakcji DNA całego genomu z mykobakterii metodą CTAB. Obecny protokół ma na celu umożliwienie badaczom osiągania spójnych i wiarygodnych wyników w procesach pracy biologii molekularnej poprzez eliminowanie pułapek i pokonywanie wyzwań związanych z charakterystyczną ścianą komórkową mykobakterii17.

<table><tbody><tr><td>Końcówki pipety 1 mL</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; Końcówki pipety L</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% siarczan sodu dodecylowy (SDS)</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>71736-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe o pojemności 15 mL</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki 2 ml i probówki 1,5 ml</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; I pipete końcówki</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-PROPANOL, BIOREAGENT, DLA MOLEKULARNEGO PASMA I</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>I9516-1L&nbsp;</td><td>Przechowywać w -20 i stopniach; C</td></tr><tr><td>37 stopni; Inkubator C</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>S6546 - 100 ML</td><td></td></tr><tr><td>65 stopni; Inkubator C</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żel agarozowy</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System dokumentacji żelu UV Bio-Rad,</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (do probówek 15 ml lub 50 ml) oraz mikrofuge (do probówek 2 ml)</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHLOROFORM DO ANALIZY EMPARTA&reg; ACS</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>1070242500</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol chloroformowy/izoamylowy (24:1)</td><td></td><td></td><td>W okapu wymieszaj 384 ml chloroformu i 16 ml alkoholu izoamylowego</td></tr><tr><td>Rozwiązanie CTAB/NaCl</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>52370-100 G</td><td>Rozpuszcz 4,1 g NaCl w 80 ml wody destylowanej. Podczas mieszania dodaj 10 g CTAB. Roztwór cieplny w 65 stopniach; Inkubator C. Reguluj objętość do 100 ml z wodą destylowaną. Przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.</td></tr><tr><td>Drabinka DNA 1 Kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALKOHOL ETYLOWY, CZYSTY, 200 PROOF, DO MOL&</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>E7023-500ML</td><td>Wymieszaj 75 ml etanolu absolutnego i 25 ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>Lizozym (10 mg/ml)</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>10837059001</td><td>Rekonstytuacja liofilizowanego lizozymu (doprowadzony do temperatury pokojowej) za pomocą wody destylowanej do 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 media</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>M0178</td><td>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi przygotowania płynnego medium</td></tr><tr><td>MIDDLEBROOK OADC WZBOGACANIE 6 x 100 ml F&nbsp;</td><td>BD</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Medium wskaźnika wzrostu mykobakterii (MGIT)</td><td>BD</td><td>245122</td><td></td></tr><tr><td>System NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P10</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, recomb, PCR grd 2x250mg&nbsp;</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>3115801001</td><td>Rekonfunduj fiolkę liofilizowanej proteinazy K w wodzie destylowanej do 10 mg/ml. Zamrażaj aliquoty w probówkach o pojemności 2 ml przy -20 i stopniach; C</td></tr><tr><td>SYBR-safe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH buforowe Tris/EDTA (TE) 8,0</td><td>Merck (Sigma-Aldrich)</td><td>8890-OP lub 382499997</td><td></td></tr><tr><td>Wir</td><td>Każdy dostawca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Whole-Genome Deoxyribonucleic Acid Extraction from Mycobacterium Species via the Cetyltrimethylammonium Bromide Technique

Efektywna i niezawodna ekstrakcja DNA to podstawowy etap biologii molekularnej, dostarczający wysokiej jakości materiał genetyczny do dalszych zastosowań, takich jak PCR, sekwencjonowanie i analizy genomowe. Jednak unikalny skład ścian komórkowych mykobakterii, bogaty w lipidy i kwasy grzybnicze, stanowi poważne wyzwanie dla efektywnej izolacji DNA. Metoda bromku cetylotrymetylamoniu (CTAB) jest szeroko stosowana ze względu na skuteczność w ekstrakcji DNA o wysokiej czystości z gatunków mykobakterii, w tym zarówno szczepów szybko jak i wolno rosnących. Technika ta polega na enzymatycznym rozbiciu komórek bakteryjnych za pomocą lizoenzymu i proteinazy K, a następnie lizie składników komórkowych za pomocą CTAB, który selektywnie wiąże się i tworzy kompleks z polisacharydami i białkami. Oczyszczanie i koncentracja DNA uzyskuje się poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi oraz wytrącanie etanolem. Według naszych danych, protokół CTAB dostarcza dużych ilości DNA (200 - 1000 ng/μL) o wysokiej jakości i minimalnym zanieczyszczeniu, co udowodniono elektroforezą żelową i analizą NanoDrop. DNA wyodrębniane z różnych gatunków mykobakterii jest wysokiej czystości i nadaje się do różnych badań molekularnych. Badanie to demonstruje proceduralne kroki metody CTAB, podkreślając jej skuteczność w pokonywaniu unikalnych wyzwań związanych z ekstrakcją DNA mykobakterii.

Protokół ekstrakcji DNA metodą CTAB (Rysunek 1) został oceniony na różnych gatunkach grzybników, takich jak M. tuberculosis, M. abscessus i M. chelonea. Ekstrakcjonowano DNA i porównywano pod kątem wydajności, czystości i integralności wyodrębnionego DNA w różnych próbkach.
Stężenie DNA różniło się w poszczególnych gatunkach grzybniczych, w niektórych przypadkach wahając się od 190 do 600 ng/μL do >1000 ng/μL, co wskazuje, że CTAB wydoby...

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Efficient and reliable DNA extraction is a fundamental step in molecular biology, providing high-quality genetic material for downstream applications such ...

Nasze badania koncentrują się na genetycznej charakteryzacji gatunków grzybików oraz na złożonej naturze chorób grzybniczy u ludzi. Szczególny nacisk kładziemy na mykobakterie niegruźlicy i ich interakcje z makrofagami podczas współinfekcji z innymi gatunkami, zwłaszcza z mikrobakteriami gruźlicowymi. Dodatkowo koncentrujemy się na specjacji patogennych mykobakterii, identyfikacji genów związanych z wirulencją oraz polimorfizmie pojedynczego nukleotydu powiązanego z opornością na leki.Ze względu na grubą ścianę komórkową, lipidowe i hydrofobowe ściany komórkowe ekstrakcji DNA mykobakterii są wyzwaniem i wymagają specjalistycznych technik lizy, aby je rozłożyć i efektywnie uwalnić genomowe DNA. W naszym protokole zajmujemy się ekstrakcją DNA z gatunków mykobakterii za pomocą metody CTAB jako solidnej i skutecznej metody produkcji wysokiej jakości DNA odpowiedniej do wszystkich technik sekwencjonowania genomu oraz innych technik molekularnych. Na początek ciepło zabija cieczą pochłanianą w probówce 15-mililitrowej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie włóż probówkę 15 mililitrów do wirówki i obracaj w 3 220 G przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Używając sterylnej pipety, usuń przezroczysty supernatant, upewniając się, że wszystkie nośniki zostaną usunięte. Dokładnie zawiesz osad hodowli w 300 mikrolitrach buforu Tris-EDTA i przelej zawieszony pellet do rurki o pojemności 2 mililitrów.Następnie dodaj do probówki 100 mikrolitrów roztworu lizozymowego w stężeniu 10 miligramów na mililitr i wymieszaj pipetowanie, pipetując pipetowanie. Delikatnie stuknij w tubkę, aby zapewnić równomierną dyspersję, a następnie umieść ją w inkubatorze obrotowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Następnego dnia przygotować mieszaninę 5 mikrolitrów białkazy K w stężeniu 10 miligramów na mililitr oraz 70 mikrolitrów 10% SDS.Dodaj 75 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej próbki. Wymieszaj próbkę, stukając w probówkę i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, przerywając lub stukając w probówkę, aby wymieszać. Następnie do próbki należy dodać 100 mikrolitrów chlorku sodu o pojemności 5 molów, a następnie 100 mikrolitrów roztworu chlorku sodu CTAB podgrzanego do temperatury 65 stopni Celsjusza do próbki.Mieszaj próbkę przez stukanie, aż roztwór stanie się mleczny. Włóż probówkę do inkubatora w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut, przerywając lub stukając w tubkę, aby wymieszać. Teraz dodaj równą objętość, około 675 mikrolitrów roztworu alkoholu chloroformowego izoamylu w proporcji 24:1 do próbki i wymieszaj przez stuknięcie.Włóż próbkę do wirówki i obróć w temperaturze 12 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, używając pipety, ostrożnie zasysaj od 550 do 600 mikrolitrów wodnej fazy górnej do sterylnych rurek o pojemności 1,5 mililitra i odpowiednio je oznacz. Dodaj 550-600 mikrolitrów lodowatego izopropanolu do każdej probówki i wymieszaj zawartość, odwracając rurkę kilkakrotnie.Włóż tubkę do zamrażarki ustawionej na 20 stopni Celsjusza i inkubuj przez 30 minut do godziny. Następnie wiruj probówkę z najwyższą prędkością, około 21 130 G, przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić nierozpuszczalne DNA. Za pomocą pipety aspiruj supernatant z przedniej strony rurki, nie naruszając granulki DNA.Teraz dodaj 1 000 mikrolitrów lodowatego 75% etanolu do pelletu i wymieszaj próbkę, odwracając probówkę kilkakrotnie. Wiruj próbkę w 12 000 G przez 30 minut w tej samej orientacji, co wcześniej. Po wirowaniu zasysaj lub przelej cały etanol bez naruszania pelletu.Pozwól rurce wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc lub przez co najmniej 30 minut. Następnie dodaj od 25 do 50 mikrolitrów buforu Tris-EDTA przy pH 8, aby zawiesił DNA, i umieść probówkę na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po ocenie kontroli jakości umieść tubkę w zamrażarce ustawionej na 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.Wydajność DNA uzyskana metodą ekstrakcji CTAB wahała się od 190 nanogramów na mikrolitr do 600 nanogramów na mikrolitr. Stosunek absorpcji 260/280 mieścił się w przedziale od 1,9 do 2,0, a 260/230 od 1,8 do 2,2, co wskazuje na DNA o wysokiej czystości. Wykryto pojedynczy pik absorpcji na 260 nanometrach.Agarozowa elektroforeza wysokiej jakości wykazała wyraźny, nienaruszony pas DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z minimalną degradacją. U niektórych gatunków mycobacterium niegruźlicy wydajność DNA wynosiła mniej niż 50 nanogramów na mikrolitr, a wskaźniki czystości spadały poniżej idealnego zakresu, co wskazuje na zanieczyszczenie.

whole-genome-deoxyribonucleic-acid-extraction-from-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Profil metabolomiczny Mycobacterium tuberculosis jest określany po hodowli w pożywkach płynnych. Warunki mogą być modyfikowane w celu zbadania wpływu suplementów odżywczych, utleniaczy oraz leków przeciwgruźliczych na profil metaboliczny tego mikroorganizmu. Procedura przygotowania ekstraktu jest odpowiednia zarówno dla analiz NMR 1D 1H, jak i 2D 1H-13C.

Przygotowanie próbek ekstraktów z Mycobacterium tuberculosis do metabolomicznych badań metodą rezonansu magnetycznego jądra

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

W tym miejscu przedstawiamy metodę mikromacierzy DNA do identyfikacji gatunków prątków , która poprawi dokładność diagnostyczną i skuteczność powiązanych chorób do użytku klinicznego.

Identyfikacja gatunków prątków za pomocą metody mikromacierzy DNA

Naucz się ekstrakcji DNA z gatunków Mycobacterium za pomocą metody CTAB. Ta technika pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA o czystości 260/280 w zakresie 1,9–2,0, nadający się do sekwencjonowania całego genomu i badań genetycznych.

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

Przeglądaj więcej filmów