Name: Biodruk hydrożelowych plastrów guza jako model 3D chłoniaka z komórek płaszcza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę biodruku hydrożelowych plastrów guza do badania chłoniaka z komórek płaszcza. Model 3D z alginatem i kolagenem poprawia fizjologiczną relewantność w porównaniu do kultur 2D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kerstin Willecke za doskonałą pomoc techniczną i Yang Zhangowi za cenną pomoc w analizie obrazu 3D.

Praca z pierwotnymi komórkami MCL musi zostać zatwierdzona przez lokalną komisję etyczną. W tym badaniu komisja bioetyczna Wydziału Lekarskiego, Uniwersytetu Eberharda Karlsa i Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze zatwierdziła pobranie i opracowanie próbek od pacjentów i zdrowych dawców (numer projektu 159/2011BO2) i uzyskano świadomą pisemną zgodę pacjentów zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zastosowane tutaj pierwotne komórki MCL zostały wyizolowane z całych węzłów chłonnych pacjenta z MCL, a zatem obejmowały nie tylko komórki MCL, ale także inne komórki, takie jak komórki odpornościowe i fibroblasty.
1. Przygotowanie zawiesiny żelatynowej do kąpieli podtrzymującej
UWAGA: Zawiesina żelatynowa będzie służyć jako kąpiel podporowa podczas procesu biodruku 3D. Indukuje sieciowanie biotuszu, umożliwiając tworzenie struktury 3D. Przygotowanie zawiesiny żelatynowej musi odbywać się w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli komórkowych.
<ol>
	<li>Przygotować 4,5% (w/v) roztwór żelatyny w 10 mM HEPES i 11 mM CaCl2 , rozpuszczając 6,75 g proszku żelatyny w 1,5 ml 1 M HEPES, 15 ml 110 mM CaCl2 i 133,5 ml sterylnego H2O w sterylnym słoiku Mason z pokrywką. Upewnij się, że słoik Mason nadaje się do mieszania w mikserze o wysokiej wydajności.</li>
	<li>Inkubować roztwór w temperaturze 37°C przez 4 godziny lub do momentu, gdy po zmieszaniu roztworu nie zaobserwuje się rozmazów, co oznacza, że żelatyna jest całkowicie rozpuszczona. Schłodzić żelatynę w temperaturze 4°C przez noc lub przez co najmniej 12 godzin.</li>
	<li>Przygotować sterylny bufor do przemywania składający się z 10 mM HEPES i 14,4 mM CaCl2. Wstępnie schłodzić bufor do płukania do 4°C.</li>
	<li>Zestaloną 4,5% żelatynę rozbij na kilka kawałków za pomocą sterylnej łyżki.</li>
	<li>Napełnij słoik Mason zawierający 4,5% żelatyny całkowicie wstępnie schłodzonym buforem do mycia, upewniając się, że bufor pozostaje zimny przez cały proces przygotowania zawiesiny żelatyny.</li>
	<li>Słoik Mason zawierający żelatynę należy zamrozić w temperaturze -20°C przez 45-60 minut, aż zawiesina żelatyny osiągnie temperaturę 0°C, ale jeszcze nie zacznie tworzyć kryształków lodu. Użyj termometru, aby monitorować temperaturę.</li>
	<li>Przymocuj pokrywę miksera i ostrze do słoika Mason, a następnie zamontuj słoik Mason na mikserze. Mieszaj zawiesinę żelatynową przez 120 sekund, używając ustawienia pulsacyjnego. UWAGA: W przypadku korzystania z innego typu blendera może być konieczne dostosowanie ustawień blendera.</li>
	<li>Przenieść zmieszaną zawiesinę do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 50 ml. Wirować przy 3 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Upewnić się, że zawiesina jest rozdzielona na stałą zawiesinę żelatynową na dole i płynny bufor do płukania na górze.</li>
	<li>Wykonaj następujący krok na lodzie: Umyj zawiesinę żelatyny. Zassać górną warstwę cieczy, próbując usunąć pęcherzyki widoczne na wierzchu bufora do mycia. Do probówki dodać 20 ml świeżego buforu do przemywania o temperaturze 4°C. Zwirować probówkę, aby wymieszać zawiesinę żelatyny z buforem do mycia.</li>
	<li>Powtórzyć proces wirowania i mycia co najmniej 3 razy lub do momentu, gdy na górze bufora do płukania nie będą widoczne żadne pęcherzyki. Po ostatnim myciu usuń resztki buforu do płukania przez aspirację. Zawiesina żelatynowa może być przechowywana w temperaturze 4°C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie biotuszu z komórkami
<ol>
	<li>Przygotuj sterylny 5% roztwór alginianu na 1-2 dni przed drukowaniem. Dodaj 1 g alginianu do 20 ml sterylnego PBS w probówce o pojemności 50 ml. Aby zapobiec pozostałościom suchego proszku alginianowego, dodawaj PBS małymi porcjami, wirując między dodatkami. Roztwór inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka godzin lub przez noc na walce rurkowej w temperaturze pokojowej. Po całkowitym rozpuszczeniu alginianu należy przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
	<li>W przypadku pracy z linią komórkową MCL należy hodować komórki w zawiesinie w kolbie T75. W dniu drukowania upewnij się, że 1,4 x 107 komórek jest dostępnych do przygotowania 1 ml biotuszu, co da 9-10 hydrożelowych plastrów guza.</li>
	<li>W przypadku pracy z pierwotnymi komórkami MCL komórki nie muszą być hodowane w hodowli zawiesinowej przed biodrukowaniem. Rozmrażaj kriokonserwowane pierwotne komórki MCL bezpośrednio przed biodrukowaniem. Przenieść pierwotne komórki MCL do probówki o pojemności 50 ml z pożywką hodowlaną. Aby usunąć pozostałą pożywkę zamrażającą, należy natychmiast odwirować probówkę o sile 340 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml świeżej pożywki w celu zliczenia komórek.</li>
	<li>W dniu drukowania przygotuj biotusz dostosowany do interesujących Cię komórek. W przypadku komórek Jeko-1 przygotuj biotusz składający się z 0,5% (w/v) alginianu, 20% (v/v) kolagenu typu I, 1x RPMI i 2 mM HEPES. Wymieszaj 100 μl 5% alginianu, 200 μl kolagenu typu I, 100 μl 10x RPMI, 200 μl 10 mM HEPES i 350 μl PBS z 1 ml biotuszu. Komórki zostaną dodane w kroku 2.6.</li>
	<li>W przypadku pierwotnych komórek MCL przygotuj biotusz składający się z 0,5% (w/v) alginianu, 20% (v/v) kolagenu typu I, 1x RPMI i 0,5 mM HEPES. Wymieszaj 100 μl 5% alginianu, 200 μl kolagenu typu I, 100 μl 10x RPMI, 50 μl 10 mM HEPES i 500 μl matrycy błony podstawnej na 1 ml biotuszu. Komórki zostaną dodane w kroku 2.6. W przypadku pracy z linią komórkową MCL przenieś zawiesinę komórkową z kolby hodowlanej do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wymieszaj komórki z 0,4% błękitem trypanowym w stosunku 1:1. Policz żywe komórki (niebarwione) za pomocą licznika komórek lub komory Neubauera. Oblicz objętość zawiesiny komórek na 1 ml biotuszu, co odpowiada 1,4x107 komórek. Przenieś obliczoną objętość do nowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 340 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w przygotowanym biotuszu, aby wytworzyć końcowy biotusz obciążony komórkami. UWAGA: Oszacowano, że osad komórkowy ma objętość 50 μL podłoża. Razem z biotuszem przygotowanym w kroku 2.4 otrzymamy 1 ml biotuszu.</li>
</ol>
3. Bioprinting w kąpieli
UWAGA: Jeśli to możliwe, przeprowadź proces drukowania 3D w sterylnym środowisku, takim jak pod kapturem do hodowli komórkowych. Zastosowana drukarka 3D została zmodyfikowana do drukowania FRESH poprzez dodanie przedłużacza pompy strzykawkowej, jak opisano w Hinton et al.20.
<ol>
	<li>Włącz biodrukarkę i podłącz ją do oprogramowania drukarki 3D. Otwórz plik .stl zawierający plan hydrożelowych plastrów guza. Jednocześnie można wydrukować do 5 plasterków. Upewnij się, że każdy hydrożelowy plasterek guza ma średnicę 8 mm i wysokość 1,5 mm. Ustaw gęstość wypełnienia na 85%. Umieść głowicę drukarki w położeniu początkowym. UWAGA: Plik STL został zaprojektowany przy użyciu programu Fusion 360 i można go znaleźć w Dodatkowym pliku kodowania 1. Do druku 3D wykorzystano oprogramowanie Cura w wersji 15.04.5.</li>
	<li>Przenieść wcześniej przygotowaną zawiesinę żelatyny na szalkę Petriego o średnicy 35 mm, aż będzie do połowy pełna. Upewnij się, że w zawiesinie żelatynowej nie pozostały żadne szczeliny powietrzne. Wyciągnij nadmiar wody z gnojowicy za pomocą jednorazowych chusteczek precyzyjnych, aby wytworzyć żelatynową kąpiel podtrzymującą, która ma konsystencję pasty i utrzymuje kształt do momentu przyłożenia wystarczającej siły.</li>
	<li>Przenieś biotusz z komórkami do szklanej strzykawki o pojemności 2,5 ml i podłącz ją do dyszy 0,8 mm. Odwrócić strzykawkę i ostrożnie usunąć nadmiar powietrza i pęcherzyki powietrza. Po przygotowaniu strzykawki należy ją włożyć do biodrukarki. Korzystając z oprogramowania drukarki 3D, wytłaczaj biotusz, aż zacznie on być wyrzucany z dyszy. Zetrzyj wyrzuconą kroplę biotuszu za pomocą jednorazowej precyzyjnej chusteczki naukowej, aby zapobiec zatkaniu dyszy.</li>
	<li>Umieścić żelatynową kąpiel wspomagającą tuż pod dyszą strzykawki. Opuść głowicę drukarki, aż dysza znajdzie się wewnątrz zawiesiny żelatyny, 2 mm nad dnem wanny wsporczej.</li>
	<li>Rozpocznij proces drukowania za pomocą oprogramowania drukarki 3D.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu drukowania usuń nadmiar zawiesiny żelatynowej z dyszy, aby zapobiec zatkaniu. Wyjmij kąpiel podtrzymującą zawierającą hydrożelowe plastry guza i przykryj ją pokrywką, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Inkubować kąpiel podporową zawierającą wydrukowane hydrożelowe plastry guza w temperaturze 37 °C, aby umożliwić stopienie żelatyny. Ten krok spowoduje uwolnienie wydrukowanych hydrożelowych plastrów guza z kąpieli podtrzymującej.</li>
	<li>Podgrzać wstępnie bufor do przemywania i pożywkę do hodowli komórkowych do temperatury 37 °C. Podczas gdy żelatyna topi się, przygotuj 6-dołkową płytkę do mycia hydrożelowych plastrów guza. Napełnić dwie studzienki 10 mM HEPES, 14,4 mM buforem płuczącym CaCl2 (ten sam bufor, który służy do przemywania zawiesiny żelatyny) i dwie studzienki pożywką do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Gdy żelatyna się rozpuści, użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść hydrożelowe plastry guza do buforu do mycia. Myj plastry przez 1 minutę każda, najpierw w dwóch studzienkach zawierających bufor do mycia, a następnie w dwóch studzienkach zawierających pożywkę. Wypełnione komórkami hydrożelowe plastry guza są teraz gotowe do hodowli.</li>
	<li>Zachowaj pozostały biotusz, aby powtórzyć proces drukowania.</li>
</ol>
4. Hodowla i leczenie plastrów guza hydrożelowego
<ol>
	<li>Aby wyhodować plastry hydrożelu, przenieś je na wspornik filtra (wielkość porów 0,4 μm) umieszczony wewnątrz płytki 6-dołkowej. Hodowla do 5 plastrów hydrożelu na jednym nośniku filtra. Dodać 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych poniżej wspornika filtra. Dodaj kroplę pożywki na hydrożelowe plastry guza, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>W leczeniu farmakologicznym hydrożelowych plastrów guza należy dodać żądaną ilość leku do pożywki do hodowli komórkowych. W tym przypadku hydrożelowe plastry guza traktowano 0,33 μM-27 μM doksorubicyną przez 48 godzin lub 72 godziny. Zawsze hoduj zestaw plastrów bez traktowania jako kontroli.</li>
	<li>Umieścić 6-dołkową płytkę z hydrożelowymi plastrami guza w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na żądany okres hodowli.</li>
</ol>
5. Analiza żywotności komórek za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego
<ol>
	<li>Aby ocenić żywotność komórek po hodowli lub leczeniu, rozpuść hydrożelowe plastry guza. Przenieś hydrożelowy plasterek guza do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl na plaster rozpuszczalnego buforu zawierającego 30 mM EDTA, 55 mM cytrynianu sodu i 150 mM chlorku sodu (pH 6,8). Pipetować w górę i w dół, aż hydrożel całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 340 x g przez 5 minut. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki na rozpuszczony plasterek hydrożelu.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórkową w stosunku 1:1 z 0,4% błękitu trypanowego. Policz żywe (niebarwione) i martwe (barwione) komórki za pomocą licznika komórek lub komory Neubauera. Zapisz liczbę żywych i martwych komórek do dalszej analizy.</li>
</ol>
6. Czterokolorowe obrazowanie fluorescencyjne 3D na żywo
UWAGA: Zastosowane tutaj czterokolorowe barwienie umożliwia różnicowanie między żywymi komórkami (TMRM-dodatnimi), komórkami apoptozowymi (dodatnim substratem kaspazy fluorogenicznej-3) i martwymi komórkami (PicoGreen-dodatnimi)21,22,23. Jądra są wykrywane za pomocą DRAQ5. Jednak protokół ten można dostosować do dowolnego innego fotostabilnego, specyficznego barwnika fluorescencyjnego w celu wykrycia biomarkerów, struktur komórkowych lub wybranych typów komórek. Przed barwieniem upewnij się, że mikroskop jest w stanie wykryć długości fal fluoroforów używanych do barwienia.
<ol>
	<li>W przypadku czterokolorowego barwienia hydrożelowego plastra guza należy przygotować roztwór barwiący, dodając TMRM, DRAQ5 i fluorogenny substrat kaspazy-3 do 1 ml pożywki do hodowli komórkowych o końcowym stężeniu odpowiednio 0,5 μM, 5 μM i 2 μM.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej szpatułki przenieś hydrożelowy plasterek guza na szklane szkiełko nakrywkowe w komorze. Dodaj przygotowany roztwór barwiący na wierzch plastra hydrożelu, aż zostanie całkowicie pokryty. Inkubować próbkę przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Po wstępnej inkubacji zebrać roztwór barwiący pokrywający hydrożelowy wycinek guza i dodać 0,7 μl/ml PicoGreen. Odpipetować roztwór barwiący z powrotem do plastra hydrożelu i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji ostrożnie usuń nadmiar pożywki, pozostawiając wystarczającą ilość roztworu barwiącego, aby plasterek hydrożelu był wilgotny.</li>
	<li>Natychmiast przeanalizuj plasterek za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby zapobiec fototoksyczności i fotowybielaniu, zminimalizuj zastosowaną dawkę fotonów, zmniejszając intensywność lasera i czas wzbudzenia. Widma wzbudzenia/emisji barw opisanych powyżej można znaleźć w tabeli 1.</li>
	<li>Aby uzyskać przegląd rozmieszczenia komórkowego komórki w hydrożelu, należy uchwycić przekroje z. Jeśli podczas obrazowania zostały wykonane wycinki Z, wygeneruj rekonstrukcje 3D hydrożelowych wycinków guza za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Rekonstrukcje te pozwolą na dokładną analizę rozmieszczenia przestrzennego i statusu komórkowego komórek w hydrożelowych wycinkach guza.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami i skryptem zawartymi w Pliku Uzupełniającym 1 i Pliku Uzupełniającym 2 , aby przeprowadzić segmentację i rekonstrukcję komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Jain, P., Wang, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma+in+2022-a+comprehensive+update+on+molecular+pathogenesis%2C+risk+stratification%2C+clinical+approach%2C+and+current+and+novel+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments.</a> Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li>
<li>Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+targeting+Bruton%27s+tyrosine+kinase+in+cancers%3A+Drug+development+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances.</a> Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1%2F2+study+of+zilovertamab+and+ibrutinib+in+mantle+cell+lymphoma+%28mcl%29+or+chronic+lymphocytic+leukemia+%28cll%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll).</a> J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).</li>
<li>Roué, G., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+drug+resistance+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Management of drug resistance in mantle cell lymphoma.</a> Cancers. 12 (6), 1565(2020).</li>
<li>Araujo-Ayala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+patient-derived+3d+model+recapitulates+mantle+cell+lymphoma+lymph+node+signaling%2C+immune+profile%2C+and+in+vivo+ibrutinib+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses.</a> Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).</li>
<li>Bryant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intermediate-grade+%28mantle+cell%29+and+low-grade+%28small+lymphocytic+and+marginal+zone%29+human+non-Hodgkin%27s+lymphomas+xenotransplanted+in+severe+combined+immunodeficiency+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models.</a> Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).</li>
<li>Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+cell+culture+in+alginate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">3d cell culture in alginate hydrogels.</a> Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).</li>
<li>Hickman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models+of+cancer+for+pharmacology+and+cancer+cell+biology%3A+Capturing+tumor+complexity+in+vitro%2Fex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.</a> Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).</li>
<li>Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+models%3A+A+novel+approach+for+lymphoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).</li>
<li>Saba, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+of+B-cell+receptor+signaling+and+canonical+nf-%CE%BAb+activation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma.</a> Blood. 128 (1), 82-92 (2016).</li>
<li>Chiron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+targeted+therapies+to+overcome+microenvironment-dependent+expansion+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma.</a> Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).</li>
<li>Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+macrophages%3A+The+cancer+fighters+within+the+tumour+microenvironment+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma.</a> Front Immunol. 15, 1373269(2024).</li>
<li>Nygren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+levels+are+prognostic+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma.</a> Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).</li>
<li>Medina, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+protect+mantle+cell+lymphoma+cells+from+spontaneous+and+drug-induced+apoptosis+through+secretion+of+b-cell+activating+factor+and+activation+of+the+canonical+and+non-canonical+nuclear+factor+%CE%BAb+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways.</a> Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).</li>
<li>Jindal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cers6-as1%2Ffgfr1+axis+as+synthetic+vulnerability+to+constrain+stromal+cells+supported+proliferation+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma.</a> Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).</li>
<li>Nie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+patient-derived+organoid+culture+platform+for+mantle+cell+lymphoma+drug+sensitivity+and+car+t+cell+anti-tumor+activity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay.</a> Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Van Der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+Taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).</li>
<li>Porter, A. G., Jänicke, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+caspase-3+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differentiat%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of caspase-3 in apoptosis.</a> Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).</li>
<li>Huseynov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+mantle+cell+lymphoma+in+transplant+non-eligible+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Transfus+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients.</a> Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).</li>
<li>Augustine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+bioprinted+cancer+models%3A+Revolutionizing+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy.</a> Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).</li>
<li>Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedded+3d+bioprinting+%E2%80%93+an+emerging+strategy+to+fabricate+biomimetic+%26+large+vascularized+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs.</a> Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).</li>
<li>Seaman, K., Sun, Y., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cancer-on-a-chip+tissue+models+to+dissect+the+tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Med-X%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment.</a> Med-X. 1 (1), 11(2023).</li>
<li>Davies, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+tumour+biology+in+vitro%3A+Histological+and+molecular+characterisation+of+precision+cut+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices.</a> Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Millipore+PICM03050%3A+Millicell+Standing+Cell+Culture+Inserts+Data+Sheet%22">Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet</a>. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).</li>
<li>Lamaison, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3d+culture+model+recapitulates+primary+fl+b-cell+features+and+promotes+their+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival.</a> Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).</li>
<li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+molecular+organization+of+lymph+node+T+cell+cortex%3A+A+labyrinthine+cavity+bounded+by+an+epithelium-like+monolayer+of+fibroblastic+reticular+cells+anchored+to+basement+membrane-like+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix.</a> Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).</li>
<li>German, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plug-and-play+lymph+node-on-chip%3A+Secondary+tumor+modeling+by+the+combination+of+cell+spheroid%2C+collagen+sponge%2C+and+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+From+discovery+and+ecm+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliver+Rev%22%5BJournal%5D)">Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research.</a> Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+evaluation+of+the+morphometric+patterns+of+lymph+nodes+of+the+head+and+neck+in+young+and+middle-aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals.</a> Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+its+therapeutic+potential+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).</li>
<li>Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+extracellular+matrix+biology+for+tumor+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Personalized+Med%22%5BJournal%5D)">Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery.</a> J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).</li>
<li>Ahmad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+of+extracellular+matrix+and+drug+correlations+in+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Pharma+Sci%22%5BJournal%5D)">Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management.</a> Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).</li>
</ol>

Badanie to było wspierane przez Fundację Roberta-Boscha oraz Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Sztuki Badenii-Wirtembergii (3R-Network BW).

Hydrożelowe plastry guza opisane w tym protokole oferują model MCL, który naśladuje strukturę węzłów chłonnych, umożliwiając badanie przeżycia komórek MCL i odpowiedzi na lek w mikrośrodowisku guza 3D generowanym przez biodrukowanie.
Najczęściej stosowane metody biodruku opierają się na ekstruzji, gdzie biotusz jest wyrzucany przez system dozujący. Na przykład w druku atramentowym biotusze są szybko sieciowane po osadzaniu, tworząc struktury3D 25. Takie podejście wiąże się jednak z ograniczeniami, szczególnie pod względem lepkości użytych materiałów i możliwości układania warstw. W przeciwieństwie do tego, wbudowany biodruk 3D oparty na strzykawce, taki jak FRESH bioprinting używany w tym protokole, stosuje podejście żel w żelu. Pozwala to na drukowanie biotuszy o niskiej lepkości, takich jak kolagen, w stabilne konstrukty, co umożliwia naśladowanie złożonego mikrośrodowiska guza20,26. Podczas gdy drukarki 3D opracowane specjalnie do biodruku mogą być drogie, przedstawiona tutaj metoda oferuje bardziej dostępny punkt wejścia. Można go dostosować do standardowych drukarek ekstruzyjnych ze stosunkowo prostymi modyfikacjami. Modyfikacje te można wydrukować w 3D za pomocą niedrogich filamentów, a projekty są dostępne jako zasoby typu open source, na przykład przez Hinton i wsp.20. Należy jednak pamiętać, że przygotowanie hydrożelowej kąpieli podporowej dla FRESH bioprinting jest bardzo wrażliwe na temperaturę i wymaga szczególnej uwagi podczas przygotowywania gnojowicy.
Często drukowane w 3D modele nowotworów są hodowane w systemach pływających, pozbawionych gradientu tlenu in vivo 25, lub w mikroprzepływowych kulturach chipowych27, które wychwytują wysoki stopień złożoności, ale mają niską przepustowość i wymagają dużej konserwacji. Przeszkody te można pokonać za pomocą opisanych tutaj hydrożelowych plastrów guza. Konfiguracja hodowli do pięciu hydrożelowych wycinków guza na granicy faz powietrze-ciecz wywodzi się z hodowli precyzyjnie pociętych plastrów guza litego28. Membrana wspornika filtra zastosowana w tym protokole składa się z membrany z politetrafluoroetylenu (PFTE) o wielkości porów 0,4 μm, która umożliwia wymianę składników odżywczych, ale zapobiega przyłączaniu się komórek lub migracji komórek29. Kultura na membranie PTFE zapewnia fizyczne wsparcie dla plastrów, aby utrzymać ich stabilność i zapobiec ich pękaniu lub rozpadowi. Dodatkowo zapewniają granicę faz powietrze-ciecz, dostarczając tlen głównie z powietrza powyżej i składniki odżywcze z medium poniżej filtra30. W ten sposób system uwzględnia czasoprzestrzenne zmiany w dostarczaniu składników odżywczych, proliferacji komórek i natlenianiu, które mogą wystąpić in vivo25. Hodowane w hydrożelowych wycinkach guza na podłożu filtra, pierwotne komórki MCL utrzymywały żywotność ponad 40% przez 4 dni, co było lepsze niż żywotność obserwowana w hodowli zawiesiny 2D (Figura 3A, Figura uzupełniająca 2). Dalsze badania powinny dotyczyć tego, czy przedłużoną żywotność można osiągnąć przez dodanie cytokin lub współhodowlę z fibroblastami wykazującymi ekspresję CD40L, jak opisano w sferoidach i organoidach pierwotnego guza chłoniaka z komórek B 6,19,30 lub kokulturach pierwotnych komórek MCL z komórkami L fibroblastów eksprymujących CD40L14. Należy rozważyć włączenie takich podejść do hydrożelowych wycinków guza w celu poprawy hodowli pierwotnych komórek MCL, a także podobieństwa do natywnego mikrośrodowiska.
Węzły chłonne zawierają dobrze rozwiniętą sieć włókien macierzy zewnątrzkomórkowej. Ze względu na swój wzór znane są jako włókna siatkowate. Głównie włókna te składają się z kolagenu i składników specyficznych dla błony podstawnej 31,32,33. Aby wygenerować matrycę przypominającą sytuację in vivo w węzłach chłonnych, biotusz używany do generowania hydrożelowych plastrów guza składa się z kolagenu typu I i Matrigel, który składa się z czterech głównych białek ECM błony podstawnej: lamininy, kolagenu IV, enaktyny i perlekanu34. Ponadto alginian jest dodawany do biotuszu w celu ustabilizowania hydrożelowych plastrów guza, co pozwala na przedłużoną hodowlę i transport z jednego naczynia do drugiego za pomocą szpatułki. Testowanie różnych hydrożeli zawierających kolagen i alginian wykazało najwyższą żywotność komórkową w połączeniu ze stabilnym i trwałym plastrem hydrożelu przy użyciu biotuszu z 0,5% alginianu i 20% kolagenu (dane nie pokazane). Oprócz składników, hydrożelowa średnica plastra guza wynosząca 0,8 cm bardziej przypomina średnią średnicę węzłów chłonnych wynoszącą 1 cm35. Obrazowanie 3D na żywo hydrożelowych plastrów guza wykazało ponadto równomierne rozmieszczenie komórek (ryc. 2C).
W tym przypadku zdolność do leczenia plastrów hydrożelu lekami wykazano poprzez leczenie doksorubicyną, która jest częścią terapii R-CHOP (rytuksymab, cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon), standardowej terapii dla starszych podgrup pacjentów z MCL24. W porównaniu z kulturami 2D, wpływ mikrośrodowiska guza na efekty leczenia można badać w hydrożelowych plastrach guza. Jak pokazano na rycinie 3, komórki Jeko-1 hodowane w plastrach hydrożelu były bardziej odporne na leczenie doksorubicyną niż komórki hodowane 2D. Jest to zgodne z obserwacjami, że macierz zewnątrzkomórkowa może wpływać na reakcje na leki i często zwiększać oporność na leki poprzez modulowanie sztywności guza36, komunikację komórka-komórka37 i dostarczanie leków38. Ponadto analiza cytometrii przepływowej, a także barwienie immunohistochemiczne lub multipleksowe immunofluorescencyjne, mogą dać głębszy wgląd w odpowiedź na leczenie pojedynczych komórek w hydrożelowych wycinkach guza.
Podsumowując, protokół ten opisuje wytwarzanie i hodowlę hydrożelowych plastrów guza, które reprezentują model węzłów chłonnych 3D naśladujący natywną trójwymiarową strukturę węzłów chłonnych. Ma potencjał do rozszerzenia zastosowania z komórek MCL na inne wskazania do chłoniaka pierwotnego.

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest rzadkim i agresywnym chłoniakiem nieziarniczym z komórek B pochodzącym ze strefy płaszcza węzłów chłonnych1. Strefa płaszcza składa się z pierścienia małych limfocytów otaczających centrum zarodkowe pęcherzyka komórek B. Zazwyczaj MCL wykazuje agresywny przebieg kliniczny, z częstymi nawrotami po początkowej chemioterapii. Dzięki lepszemu zrozumieniu powstawaniachoroby1 i opracowaniu nowych metod leczenia, w tym immunochemioterapii2,inhibitorów kinazy tyrozynowej Brutona3 lubkoniugatów przeciwciało-lek4, opcje leczenia pacjentów z MCL doprowadziły do poprawy wskaźników odpowiedzi i wydłużenia czasu przeżycia wolnego od progresji. Jednak oporność na leki i nawroty choroby nadal sprawiają, że choroba jest nieuleczalna5. Częściowo wynika to z jego niejednorodności i wpływu mikrośrodowiska guza na rozwój guza i lekooporność6. Wyzwaniem w badaniu MCL jest trudność w hodowli pierwotnych komórek MCL w hodowli zawiesinowej7, ponieważ komórki ulegają spontanicznej apoptozie ex vivo 4,5. Podkreśla to potrzebę alternatywnych podejść do lepszego modelowania MCL w modelach przedklinicznych.
In vivo nowotwory są trójwymiarowymi (3D) strukturami złożonymi z różnych składników komórkowych, w tym komórek nowotworowych, komórek odpornościowych i komórek zrębu, a także składników niekomórkowych, takich jak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). ECM, który składa się z makrocząsteczek, takich jak kolagen i laminina, tworzy złożoną włóknistą siatkę elastycznych włókien, która jest wysoce hydrofilowa, tworząc środowisko podobne do żelu 2,8,9,10. Aby lepiej odtworzyć te warunki in vivo nowotworów ex vivo, opracowano różne modele 3D. W ostatnich latach modele te stały się kluczowe dla badań farmakologicznych i biologicznych nowotworów, koncentrując się głównie na guzach litych11.
Do tej pory dziedzina ta pozostaje słabo zbadana w chłoniakach, ponieważ hematologiczne komórki rakowe mają zdolność wzrostu zarówno w zawiesinie, jak i w otoczeniu zrębu, takim jak węzły chłonne, szpik kostny lub wtórne tkanki limfatyczne12. In vivo komórki MCL rozprzestrzeniają się ze strefy płaszcza węzłów chłonnych do krwi lub szpiku kostnego, chociaż rozmnażają się głównie w węzłach chłonnych, z których pochodzą13,14. W węzłach chłonnych komórki MCL są otoczone limfocytami T, makrofagami i mezenchymalnymi komórkami zrębu, z których wszystkie kontrolują przeżycie lub odpowiedź komórek MCL na leki 14,15,16,17,18. Co więcej, przesłuch mikrośrodowiska MCL i guza, a także porowatość i właściwości mechaniczne są ważnymi czynnikami, które mogą wpływać na odpowiedzi na leki i oporność 6,14. W związku z tym do badania pierwotnego MCL wymagane są standaryzowane i powtarzalne modele 3D guza MCL, które symulują natywne mikrośrodowisko. Do tej pory ustalono głównie modele komórkowe, takie jak sferoidy lub organoidy pierwotnych komórek MCL 6,19. Z powodzeniem zwiększają żywotność i długoterminową hodowlę pierwotnych komórek MCL. Jednak macierz zewnątrzkomórkowa jest niedostatecznie reprezentowana w tych modelach. W tym kontekście zaawansowany biodruk 3D oferuje obiecujące podejście. Dzięki bezpośredniemu składaniu żywych komórek i hydrożeli, technologia ta umożliwia generowanie fizjologicznie istotnych modeli węzłów chłonnych 3D na bazie hydrożelu.
W tym miejscu stworzono biodrukowany model 3D MCL w postaci hydrożelowych plastrów guza wraz ze zoptymalizowaną metodą hodowli. Komórki są osadzane w plastrach hydrożelu na bazie kolagenu typu I, alginianu i Matrigelu poprzez odwracalne zatapianie zawieszonych hydrożeli w dowolnym kształcie (FRESH) bioprinting20. Hydrożelowe plastry guza są hodowane na podłożu filtrującym, co pozwala komórkom MCL rosnąć w otoczeniu, które ściśle odzwierciedla warunki in vivo węzła chłonnego.
Protokół ten zawiera szczegółowy opis wytwarzania, hodowli i analizy komórek MCL w hydrożelowych wycinkach guza. Wykorzystując czterokolorowe obrazowanie fluorescencyjne 3D na żywo, można śledzić żywotność lub odpowiedź na lek pojedynczych komórek wewnątrz hydrożelowego wycinka guza. Pierwotne komórki MCL wykazały lepszą przeżywalność, gdy były hodowane w hydrożelowych wycinkach guza. Model ten stanowi narzędzie do badania biologii MCL i odpowiedzi na leczenie, torując drogę do zrozumienia wpływów mikrośrodowiskowych i zmienności pacjentów z MCL.

<table><tbody><tr><td>&mikro;-slide 8-dołkowe szklane dno</td><td>ibidi GmbH</td><td>80827</td><td>Szkiełka ze szklanym dnem stosowane do obrazowania na żywo plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>10 kanałów PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>9150.1</td><td>Składnik biotuszu</td></tr><tr><td>10X RPMI-1640 Średni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Czynnik R1145</td><td>Składnik biotuszu</td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna 2,5 ml Model 1002 TLL</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>Strzykawka do biodruku</td></tr><tr><td>Drukarka do wytłaczania 3D, PrintrBot Simple</td><td>Drukarka Printrbot</td><td></td><td>Samomodyfikacja umożliwiająca drukowanie biotuszy</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Th. Geyer GmbH & Co.KG</td><td>7696790</td><td>Kultura plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>Butelkowe systemy filtracji próżniowej, membrana PES, 500 ml, 0,22 &mikro; m wielkość porów, 70&nbsp; membrana o średnicy mm</td><td>Corning Inc.</td><td>513-3355</td><td>Sterylna filtracja</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia odwodniony</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>Zobacz materiał T885.2</td><td>Składnik buforu do przemywania i zawiesiny żelatynowej</td></tr><tr><td>Kolagen I ze szczura</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS354249</td><td>Składnik biotuszu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Cura w wersji 15.04.5 do druku 3D</td><td>Ultimaker (Mistrz)</td><td></td><td>Oprogramowanie używane do druku 3D</td></tr><tr><td>DRAQ5 powiedział:</td><td>Biostatus Sp. z o.o.</td><td>DR50050</td><td>Barwienie do obrazowania na żywo plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) sól disodowa dwuwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>Składnik buforu do rozpuszczania alginianów</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek EVE</td><td>Nano EnTek Inc.</td><td>10027-452</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Bakteriologiczne szalki Petriego Falcon z pokrywką, średnica 35 mm</td><td>Sokół</td><td>351008</td><td>Wypełniony zawiesiną żelatynową w celu utworzenia kąpieli podporowej do biodruku</td></tr><tr><td>Probówki Falcon, 50 ml</td><td>Sarstedt AG & Co.KG</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0615 powiedział:</td><td>Suplement pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Klasa g1890</td><td>Główny składnik zawiesiny żelatynowej</td></tr><tr><td>HEPES, wolny kwas, klasa biologii molekularnej</td><td>Merck KGaA</td><td>CAS 7365-45-9</td><td>Składnik buforu do przemywania i zawiesiny żelatynowej</td></tr><tr><td>Linia komórkowa MCL Jeko-1</td><td>Kontroler ATCC (Kontroler T</td><td>CRL-3006</td><td>Linia komórkowa MCL</td></tr><tr><td>Chusteczki KIMTECH Science Precision</td><td>Korporacja Kimberly Clark</td><td>7551</td><td>Służy do odprowadzania nadmiaru wody z zawiesiny żelatynowej i usuwania kropelek z dyszy drukarki 3D</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS X w wersji 3.5.7.23225</td><td>Księga Leica</td><td></td><td>Oprogramowanie wykorzystywane do rekonstrukcji 3D</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Księga Leica</td><td>TCS SP8</td><td>Mikroskop konfokalny do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>Mason Jar Zwykły Kufel 16 Oz</td><td>Korporacja Piłkarska</td><td>G001 powiedział:</td><td>Słoik, w którym przygotowuje się zawiesinę żelatynową</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrix Podstawna membrana</td><td>Corning Inc.</td><td>356231</td><td>Składnik biotuszu</td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórek milikomórkowych, 0,4 i mikro; m Wielkość porów</td><td>Merck KGaA</td><td>PICMORG 50</td><td>Wspornik filtra do plastrów hydrożelowych</td></tr><tr><td>NucView 405 Podłoże kaspazy-3, 1 mM w 1x PBS</td><td>Biot</td><td>10405</td><td>Barwienie do obrazowania na żywo plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>Blender z serii Oster Professional</td><td>Oster</td><td>Zobacz materiał BPST02-B00</td><td>Mieszalnik do wytwarzania zawiesiny żelatynowej</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptamycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140163</td><td>Suplement do pożywki do hodowli komórkowych MCL</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>Zobacz materiał P7589 TGL</td><td>Barwienie do obrazowania na żywo plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>Rotina 35 R</td><td>Hettich powiedział:</td><td>24573</td><td>Wirowanie komórek</td></tr><tr><td>Wirówka ROTINA 38/38R</td><td>Hettich powiedział:</td><td>Z720109</td><td>Odwirowanie zawiesiny żelatynowej</td></tr><tr><td>RPMI-1640+GlutaMAX</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>61870036</td><td>Baza pożywki dla komórek MCL</td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Współpraca z FMC</td><td>GQ9109901</td><td>Składnik biotuszu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06404</td><td>Składnik buforu do rozpuszczania alginianów</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>3580.1</td><td>Składnik buforu do rozpuszczania alginianów</td></tr><tr><td>Kaniule Sterican 21G 0,8x22 mm</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td>Dysza do druku 3D</td></tr><tr><td>Nadchloran tetrametylorodaminy metyloestrowej (TMRM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T5428</td><td>Barwienie do obrazowania na żywo plastrów hydrożelu</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał T8154 TGL</td><td>Bejca do analizy rentowności</td></tr><tr><td>Wodoodporny termometr</td><td>Firma VWR</td><td>620-2099</td><td>Termometr do monitorowania temperatury zawiesiny żelatynowej</td></tr></tbody></table>

biodruk hydrożelowych plastrów guza jako model 3d chłoniaka z komórek płaszcza

Bioprinting of Hydrogel Tumor Slices as a 3D Model for Mantle Cell Lymphoma

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest rzadkim, agresywnym nowotworem z komórek B, który często dochodzi do nawrotów i wykazuje ograniczoną odpowiedź na konwencjonalną chemioterapię. Głównym wyzwaniem w badaniach MCL jest hodowla pierwotnych komórek MCL ex vivo, ponieważ komórki mają tendencję do spontanicznej apoptozy, gdy są hodowane w hodowli zawiesinowej 2D. Chociaż modele 3D są znane z tego, że lepiej odsumowują sytuację in vivo guzów litych, ich zastosowanie jest nadal słabo zbadane w chłoniakach. Opracowanie modeli 3D, które odtwarzają warunki in vivo MCL w węźle chłonnym, może zwiększyć ich przeżywalność, ułatwić badanie przesłuchów mikrośrodowiska MCL i guza oraz naśladować odpowiedź na lek in vivo . Tutaj stworzono wydrukowany w 3D model MCL w postaci hydrożelowych plastrów guza wraz ze zoptymalizowaną metodą hodowli. Opracowano standaryzowany proces z wykorzystaniem linii komórkowych MCL lub pierwotnych komórek MCL, w których komórki są zanurzane w hydrożelu zawierającym alginian, kolagen typu I i macierz błony podstawnej poprzez biodrukowanie w kąpieli podporowej żelatyny. Powstałe hydrożelowe plastry guza MCL są hodowane na podłożu filtrującym, aby utrzymać ich stabilność przez cały okres hodowli. Leczenie farmakologiczne może być stosowane do systemu. Odpowiedź pojedynczych komórek wewnątrz hydrożelowego plastra guza można śledzić za pomocą czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego 3D na żywo. Pierwotne komórki MCL wykazały stabilną żywotność, gdy były hodowane w hydrożelowych wycinkach guza. Protokół ten zawiera szczegółowy opis wytwarzania, hodowli i analizy komórek MCL w hydrożelowych wycinkach guza. Dzięki dokładnemu naśladowaniu mikrośrodowiska guza i wykorzystaniu kultury na granicy faz powietrze-ciecz, prezentowany model zwiększa znaczenie fizjologiczne w porównaniu z tradycyjną hodowlą 2D. Oferuje on znaczny potencjał w zakresie postępu zarówno biologicznych, jak i terapeutycznych badań nad MCL.

Hydrożelowe plastry guza zawierające komórki MCL zostały wygenerowane zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Etapy przepływu pracy dla drukowania 3D i hodowli hydrożelowych plastrów guza pokazano na rysunku 1A. Zastosowana drukarka 3D została zmodyfikowana pod kątem druku FRESH poprzez dodanie przedłużacza pompy strzykawkowej, jak opisano w Hinton et al.20 (Rysunek 1B). Jednocześnie wydrukowano do pięciu warstw (rysunek 1C) i wyhodowano je na jednym nośniku filtra (rysunek 1D). Pożywka została dodana poniżej wspornika filtra, aby zapewnić dopływ składników odżywczych do hydrożelowych plastrów guza. Kroplę pożywki dodano na wierzch każdego hydrożelowego plastra guza, aby zapobiec ich wysychaniu. Przegląd pięciu hydrożelowych wycinków guza hodowanych na jednym nośniku filtra pokazano na rysunku 1E, wraz z obrazami z bliska wycinka hydrożelu. Podczas 3-dniowego okresu hodowli hydrożelowe plastry guza były stabilne i utrzymywały swoją strukturę (ryc. 2A). Bezpośrednio po wydrukowaniu pęcherzyki powietrza były obecne w hydrożelowych plastrach guza, ale zniknęły podczas hodowli (ryc. 2A).
Żywotność linii komórkowej MCL Jeko-1 hodowanej w hydrożelowych plastrach guza (3D) w porównaniu z komórkami Jeko-1 hodowanymi w hodowli zawiesinowej (2D) oceniano za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego (Figura 2B). Po 3 dniach hodowli 80% komórek było zdolnych do życia, w porównaniu z początkową żywotnością 88% komórek Jeko-1 przed drukowaniem. Komórki Jeko-1 hodowane w 2D utrzymały początkową żywotność na poziomie 88%. Nie stwierdzono istotnej różnicy między komórkami Jeko-1 hodowanymi w 2D i 3D. Aby ocenić, czy komórki Jeko-1 namnażają się w plastrach hydrożelu, określono średnią liczbę komórek Jeko-1 na plasterek hydrożelu (Figura 2C). Podczas gdy 5x105 komórek Jeko-1 znajdowało się w każdym wycinku bezpośrednio po wydrukowaniu (d0), liczba ta prawie podwoiła się do 9,3x105 komórek po 3 dniach hodowli.
Rozmieszczenie i status komórek Jeko-1 hodowanych w plastrach hydrożelu oceniano za pomocą czterokolorowego obrazowania fluorescencji na żywo (ryc. 2D) bezpośrednio po wydrukowaniu lub po 3 dniach hodowli. Po wydrukowaniu rekonstrukcje 3D plastrów hydrożelu Jeko-1 wykazały jednorodny rozkład komórek. Większość komórek była dodatnia dla TMRM, markera potencjału błony mitochondrialnej22. Mniejszość komórek była dodatnia pod względem aktywności kaspazy-3, markera indukcji apoptozy23, a także markera martwych komórek PicoGreen21. Po 3 dniach hodowli zaobserwowano wzrost liczby komórek wraz z tworzeniem się klastrów komórkowych. Większość komórek pozostała TMRM-dodatnia, podczas gdy tylko kilka komórek wybarwionych pozytywnie pod kątem aktywności kaspazy-3 lub PicoGreen (Figura 2C).
Aby przeanalizować, czy komórki MCL w plastrach hydrożelu reagują na chemioterapeutyki, komórki Jeko-1 hodowane w hodowli zawiesinowej (2D) lub w plastrach hydrożelowych (3D) traktowano chemioterapeutykiem doksorubicyną, który jest częścią standardowego leczenia pacjentów z MCL24. Ogólna struktura plastrów hydrożelu została zachowana podczas leczenia doksorubicyną (ryc. 3A). Żywotność komórek Jeko-1 hodowanych w plastrach hydrożelu zmniejszała się w zależności od dawki w odpowiedzi na leczenie doksorubicyną. IC50 doksorubicyny w komórkach Jeko-1 był zwiększony, gdy komórki hodowano w plastrach hydrożelu (IC50 = 5,8 μM) w porównaniu z komórkami Jeko-1 hodowanymi w hodowli zawiesinowej 2D (IC50 = 2,0 μM; Rysunek 3B). Czterokolorowe obrazowanie fluorescencji na żywo wykazało zmniejszony TMRM i zwiększony sygnał PicoGreen w komórkach Jeko-1 hodowanych w plastrach hydrożelu w odpowiedzi na leczenie doksorubicyną, potwierdzając zmniejszenie żywotności wywołane leczeniem. Obrazy uzyskane z czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego na żywo zostały zrekonstruowane w 3D, podzielone na segmenty na podstawie sygnału jąder DRAQ5 i przeanalizowane przy użyciu skryptu Python opisanego w pliku uzupełniającym 1. Przykładowa maska segmentacji jest pokazana na rysunku uzupełniającym 1. Numer komórki zidentyfikowany na podstawie sygnału DRAQ5 został wykorzystany do określenia całkowitej liczby komórek. Liczba komórek dodatnia dla aktywności TMRM, PicoGreen i kaspazy-3 została wykorzystana do identyfikacji odsetka odpowiednio komórek żywotnych, martwych lub apoptotycznych. Oznaczanie ilościowe czterokolorowego barwienia żywą fluorescencją komórek Jeko-1 hodowanych w plastrach hydrożelu przez 3 dni z lub bez doksorubicyny 9 μM wykazało porównywalną żywotność do testu wykluczenia błękitu trypanowego (Tabela 2).
Oprócz ustalonych linii komórkowych MCL, pierwotne komórki MCL trzech różnych pacjentów z MCL hodowano albo w hodowli zawiesinowej 2D, albo w plastrach hydrożelu 3D (Figura 4, Figura uzupełniająca 2). Jak potwierdził patolog, wszystkie trzy MCL (pacjent 1-3) miały klasyczną/powszechną morfologię ze wskaźnikami Ki67 wynoszącymi 20%-50%. Pierwotne komórki MCL obejmowały wszystkie typy komórek wyizolowane z węzłów chłonnych pacjenta z MCL, a zatem zawierały nie tylko komórki MCL, ale także inne typy komórek odpornościowych lub komórek zrębu. Żywotność pierwszorzędowych plastrów hydrożelu MCL oceniano za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy. Po 4 dniach hodowli pierwotne komórki MCL w plastrach hydrożelu utrzymały żywotność 43,6% (45,7% w dniu 3) w porównaniu z wyjściową żywotnością 71,0% przed drukowaniem (Figura 4A). Oznacza to zwiększoną żywotność w porównaniu z komórkami hodowanymi w zawiesinie (2D), które miały przeżycie 19,6% po czterech dniach hodowli (28,4% w dniu 3). Żywotność tę zwizualizowano za pomocą czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego na żywo, w którym większość komórek była TMRM dodatnia i żywotna, podczas gdy subpopulacja była dodatnia pod względem aktywności kaspazy-3 i PicoGreen, co wskazuje odpowiednio na apoptozę i śmierć komórki (Figura 4B). Dane ilościowe przedstawione na rysunku 4B przedstawiono w tabeli 2. Komórki pierwotne od dwóch kolejnych pacjentów z MCL wykazały zwiększoną przeżywalność komórek podczas hodowli w wycinkach hydrożelu (3D) w porównaniu z odpowiednią kulturą zawiesinową 2D (rysunek uzupełniający 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Przebieg pracy druku 3D hydrożelowych plastrów guza. (A) Przepływ pracy druku 3D i hodowli komórek w hydrożelowych plastrach guza. (B) Konfiguracja drukarki używana do biodruku 3D plastrów hydrożelu w kąpieli żelatynowej w kąpieli podtrzymującej. (C) Wydrukowanie planu w oprogramowaniu drukarki 3D. Drukowano do pięciu plastrów hydrożelu jednocześnie. (D) Schematyczne przedstawienie kultury plastrów hydrożelowych. Plastry hydrożelu hodowano na podłożu filtracyjnym w płytce 6-dołkowej. Kropla pożywki została dodana na wierzch każdego plastra hydrożelu, aby utrzymać ich wilgotność. Na jednym nośniku filtra można hodować do pięciu plastrów hydrożelu. (E) Wydrukowane w 3D plastry hydrożelu hodowane na podłożu filtra, jak pokazano na obrazie przeglądowym lub na obrazach z bliska. Paski skali reprezentują 5 mm, 1 mm lub 200 μm, jak wskazano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Hodowla linii komórkowej chłoniaka z komórek płaszcza (MCL) w wydrukowanych w 3D wycinkach hydrożelu. (A) Zbliżenie reprezentatywnego wycinka hydrożelu zawierającego linię komórkową MCL Jeko-1 po wydrukowaniu (d0) lub po 3 dniach hodowli (d3). Podziałka odpowiada 1 mm. (B) Żywotność komórek Jeko-1 hodowanych w zawiesinie (2D) lub w plastrach hydrożelu (3D) przez 2 dni, zgodnie z oceną za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy. Pokazano średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biodruku. (C) Liczba komórek Jeko-1 zawartych w każdym plastrze hydrożelu bezpośrednio po wydrukowaniu (d0) lub po okresie do 3 dni hodowli (d1-d3). Pokazano średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów biodruku. Nie zaobserwowano różnicy istotnej statystycznie (b.s., p &gt; 0,05, test Manna-Whitneya). (D) Trójwymiarowa rekonstrukcja plastrów hydrożelu Jeko-1 w dniu drukowania (d0) lub po 3 dniach hodowli (d3). Model został wygenerowany z z-stosów czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego 3D na żywo. Żywe komórki są pokazane na czerwono (TMRM), komórki apoptotyczne na żółto (aktywność enzymatyczna kaspazy-3), martwe komórki na zielono (PicoGreen), a jądra na niebiesko (DRAQ5). Podziałka odpowiada 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig3.jpg"> 
Rycina 3: Leczenie farmakologiczne linii komórkowej chłoniaka z komórek płaszcza (MCL) w wycinkach hydrożelu. (A) Zbliżenie reprezentatywnego wycinka hydrożelu zawierającego linię komórkową MCL Jeko-1 traktowaną 3 μM doksorubicyną przez 3 dni (d3). Pasek skali reprezentuje 1 mm. (B) Komórki Jeko-1 hodowane w zawiesinie (2D) lub w plastrach hydrożelu (3D) traktowano zwiększonym stężeniem chemioterapeutyku doksorubicyny przez 2 dni. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Przedstawiono średnią ± SD z czterech niezależnych eksperymentów biodrukarskich. (C) Trójwymiarowa rekonstrukcja plastrów hydrożelu Jeko-1 traktowanych 9 μM doksorubicyną (Doxo) przez 3 dni (d3). Model został wygenerowany z z-stosów czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego 3D na żywo. Żywe komórki są pokazane na czerwono (TMRM), komórki apoptotyczne na żółto (aktywność enzymatyczna kaspazy-3), martwe komórki na zielono (PicoGreen), a jądra na niebiesko (DRAQ5). Podziałka odpowiada 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68417/68417fig4.jpg"> 
Rysunek 4: Hodowla pierwotnych komórek MCL w wydrukowanych w 3D plastrach hydrożelu. (A) Żywotność pierwotnych komórek MCL hodowanych w zawiesinie (2D) lub w plastrach hydrożelu (3D) przez okres do 4 dni, oceniana za pomocą testu wykluczającego trypan niebieski. Pokazano średnią wykonalność jednego eksperymentu. (B) Trójwymiarowa rekonstrukcja pierwotnych komórek MCL hodowanych w plastrach hydrożelu (3D) przez 3 dni. Stosy Z wygenerowano z plastrów hydrożelu wybarwionych czterokolorowym barwieniem na żywo i przeanalizowano za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Żywe komórki są pokazane na czerwono (TMRM), komórki apoptotyczne na żółto (aktywność enzymatyczna kaspazy-3), martwe komórki na zielono (PicoGreen), a jądra na niebiesko (DRAQ5). Podziałka odpowiada 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/68417fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plama</td>
			<td>TMRM powiedział:</td>
			<td>DRAQ5 powiedział:</td>
			<td>NucView405 Podłoże kaspazy-3</td>
			<td>PicoZielony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wzbudzenie/emisja</td>
			<td>548 nm/574 nm</td>
			<td>647 nm/681 nm</td>
			<td>429 nm/ 469 nm</td>
			<td>488 nm/ 520 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Maksima wzbudzenia/emisji barwników stosowanych do czterokolorowego obrazowania fluorescencyjnego 3D na żywo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Próbka</td>
			<td colspan="3">% komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (Żywe komórki)</td>
			<td>PicoGreen (Martwe komórki)</td>
			<td>Kaspaza-3 (komórki apoptotyczne)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Ctrl</td>
			<td>83</td>
			<td>23.6</td>
			<td>18.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 Doxo 9 μM</td>
			<td>27.6</td>
			<td>81.3</td>
			<td>86.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierwotny pacjent z MCL 1</td>
			<td>75.2</td>
			<td>31.1</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Kwantyfikacja rekonstrukcji 3D czterokolorowego barwienia na żywo hydrożelowych plastrów guza hodowanych. Hydrożelowe plastry guza hodowano przez 3 dni i zawierały one komórki Jeko-1 hodowane z lub bez leczenia 9 μM doksorubicyną lub pierwotnymi komórkami MCL (pacjent 1).
Rysunek uzupełniający 1: Identyfikacja komórek na podstawie rekonstrukcji 3D czterokolorowego barwienia na żywo. Rekonstrukcje 3D obrazu konfokalnego oznaczonego DRAQ5 uzyskane z (A) czterokolorowego barwienia na żywo i (B) segmentowanego obrazu na tym kanale, wygenerowanego przy użyciu potoku analizy obrazowania Python. Podziałka reprezentuje 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%201.tiff" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Hodowla pierwotnych komórek MCL pacjentów 2 i 3 w hydrożelowych plastrach guza.Żywotność pierwotnych komórek MCL (A) pacjenta 2 lub (B) pacjenta 3 hodowanych w zawiesinie (2D) lub w plastrach hydrożelu (3D) przez okres do 4 dni, oceniana za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego. Pokazano średnią wykonalność jednego eksperymentu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/JoVE_Suppl_Figure%202.tiff" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Plik uzupełniający 1: Instrukcje dotyczące analizy rekonstrukcji 3D uzyskanych z czterokolorowego barwienia na żywo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_1_proof%20read%20version.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Skrypt Pythona do analizy rekonstrukcji 3D uzyskanych z czterokolorowego barwienia na żywo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Supplementary_File_2.ipynb%20" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowe kodowanie F ile 1: Plik Stl. zawierający plan hydrożelowych plastrów guza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68417/Hydrogel%20slice%208mm%201.5mm.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten zawiera szczegółowy opis wytwarzania, hodowli i analizy chłoniaka z komórek płaszcza w wydrukowanych w 3D hydrożelowych plastrach guza.

Biodruk hydrożelowych plastrów guza jako model 3D chłoniaka z komórek płaszcza

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare, aggressive B-cell neoplasm that frequently relapses and only shows a limited response to conventional chemotherapy. ...

Opracowaliśmy biodrukowany model na bazie hydrożelu, aby odtworzyć warunki chłoniaka z komórek płaszcza u pacjentów, dzięki czemu możemy lepiej badać, w jaki sposób przeżywa on i reaguje na leczenie. Wyzwanie polega na znalezieniu najlepszego sposobu biodruku, hodowli i analizy modeli 3D zaprojektowanych specjalnie dla chłoniaków. Ze względu na lekooporność i nawroty chłoniaki z komórek płaszcza nadal nie są uleczalne.Nasz model może pomóc zrozumieć, w jaki sposób heterogeniczność guza i mikrośrodowisko wpływają na reakcje na leki. W porównaniu z innymi modelami 3D chłoniaka z komórek płaszcza, nasz model naśladuje sieć włókien macierzy zewnątrzkomórkowej w węźle chłonnym za pomocą biotuszu zawierającego kolagen i Matrigel. Prezentowany model zwiększa znaczenie fizjologiczne w porównaniu z tradycyjnymi systemami hodowli komórkowych 2D.Ma ona potencjał, aby przyspieszyć zarówno biologiczne, jak i terapeutyczne badania chłoniaków z komórek płaszcza. Na początek zbierz materiały, aby przygotować biotusz dostosowany do interesujących komórek. W przypadku chłoniaka z komórek płaszcza lub komórek MCL Jeko-1 wymieszaj alginian i kolagen w odpowiednim buforze, aby uzyskać jeden mililitr biotuszu.Przenieść zawiesinę komórek MCL z kolby hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Wymieszaj komórki z 0,4% roztworem błękitu trypanowego w stosunku 1:1. Korzystając z licznika komórek lub komory Neubauera, policz żywotne niebarwione komórki i oblicz objętość zawiesiny komórek odpowiadającą 14 milionom komórek na jeden mililitr biotuszu.Przenieś obliczoną objętość do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj probówkę o masie 340 g przez pięć minut. Po odwirowaniu usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w przygotowanym biotuszu, aby wytworzyć końcowy biotusz obciążony komórkami. Włącz biodrukarkę i podłącz ją do oprogramowania drukarki 3D.Otwórz plik STL zawierający plan hydrożelowego plastra guza za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że każdy plasterek hydrożelu ma średnicę ośmiu milimetrów i wysokość 1,5 milimetra. Następnie ustaw gęstość wypełnienia na 85% i ustaw głowicę drukarki w położeniu początkowym.Teraz przenieś zawiesinę żelatyny na 35-milimetrową szalkę Petriego, aż będzie do połowy pełna. Użyj jednorazowych chusteczek precyzyjnych, aby usunąć nadmiar wody i wyeliminować wszelkie szczeliny powietrzne w żelatynie, tworząc stabilną kąpiel podtrzymującą. Załaduj biotusz obciążony komórkami do szklanej strzykawki o pojemności 2,5 mililitra i zamocuj dyszę o średnicy 0,8 milimetra.Odwróć strzykawkę i powoli wyrzuć pęcherzyki powietrza, a następnie włóż przygotowaną strzykawkę do biodrukarki. Korzystając z oprogramowania drukarki 3D, wyciśnij niewielką ilość biotuszu, aby sprawdzić przepływ. Zetrzyj wytłaczaną kroplę jednorazową precyzyjną chusteczką, aby uniknąć zatkania dyszy.Następnie umieść żelatynową kąpiel podporową pod dyszą strzykawki i opuść głowicę drukarki, aż dysza znajdzie się dwa milimetry nad dnem żelatynowej kąpieli nośnej. Rozpocznij proces drukowania za pomocą oprogramowania drukarki 3D. Po zakończeniu drukowania usuń nadmiar zawiesiny żelatynowej z dyszy za pomocą jednorazowej precyzyjnej chusteczki, aby zapobiec zatkaniu.Wyjmij szalkę Petriego zawierającą żelatynową kąpiel wspomagającą z wydrukowanymi hydrożelowymi plastrami guza i przykryj ją sterylną pokrywką. Umieść przykrytą kąpiel podporową w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza, aby żelatyna mogła się stopić i uwolnić wydrukowane hydrożelowe plastry guza. Następnie podgrzej bufor do płukania i pożywkę do hodowli komórkowych do 37 stopni Celsjusza.Podczas gdy żelatyna topi się, przygotuj sześciodołkową płytkę, wypełniając dwie studzienki 10-milimolowym buforem do płukania HEPES i 14,4 milimolowym chlorkiem wapnia, a dwie studzienki wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli komórkowych. Gdy żelatyna się rozpuści, użyj sterylnej szpatułki, aby ostrożnie przenieść hydrożelowe plastry guza do pierwszej z studzienek wypełnionych buforem do mycia. Po umyciu przez jedną minutę w każdej z studzienek, przenieś je do studzienek zawierających pożywkę, myjąc przez jedną minutę w każdym.Aby wyhodować hydrożelowe plastry guza, umieść je na wsporniku filtra o wielkości porów 0,4 mikrometra umieszczonym wewnątrz sześciodołkowej płytki. Dodaj 1,5 mililitra pożywki do hodowli komórkowych poniżej wspornika filtra, a następnie niewielką kroplę pożywki bezpośrednio na każdy hydrożelowy plasterek guza, aby zapobiec wysuszeniu. W leczeniu farmakologicznym dodaj żądaną ilość leku do pożywki hodowlanej.Na koniec umieść sześciodołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na żądany okres uprawy. Hydrożelowe plastry guza zachowały swoją strukturę przez trzy dni hodowli, z pęcherzykami powietrza obecnymi po wydrukowaniu, które zniknęły podczas uprawy. Żywotność komórek Jeko-1 hodowanych w plastrach hydrożelu przez trzy dni wynosiła 80%, co nie różniło się znacząco od komórek hodowanych w zawiesinie 2D na poziomie 88%Bezpośrednio po wydrukowaniu komórki Jeko-1 były równomiernie rozmieszczone w plastrze hydrożelu i były w przeważającej mierze dodatnie pod względem TMRM, co wskazuje na żywotność.Tylko kilka komórek było dodatnich dla kaspazy-3 i PicoGreen, markerów odpowiednio apoptozy i śmierci. Po trzech dniach hodowli komórki Jeko-1 utworzyły klastry i pozostały w większości TMRM dodatnie. Hydrożelowe plastry guza zachowały swoją integralność strukturalną po trzech dniach leczenia doksorubicyną.Komórki Jeko-1 hodowane w plastrach hydrożelu wykazywały zależny od dawki spadek żywotności w odpowiedzi na leczenie doksorubicyną. Połowa maksymalnego stężenia hamującego doksorubicyny była wyższa dla komórek Jeko-1 w plastrach hydrożelu o masie około 5,8 mikromola w porównaniu z hodowlą zawiesinową w odległości dwóch mikromolowców, co wskazuje na zmniejszoną czułość w hodowli 3D. Obrazowanie fluorescencyjne na żywo plastrów hydrożelu poddanych działaniu doksorubicyny wykazało zmniejszony sygnał TMRM, wskazujący na utratę potencjału błony mitochondrialnej i zwiększony sygnał PicoGreen, wskazujący na zwiększoną śmierć komórki.Po czterech dniach hodowli pierwotne komórki MCL w plastrach hydrożelu utrzymały żywotność na poziomie 43,6%, która była znacznie wyższa niż 19,6% obserwowane w hodowli zawiesinowej. Obrazowanie fluorescencyjne wykazało, że komórki w hydrożelu były w większości dodatnie pod względem TMRM.

bioprinting-hydrogel-tumor-slices-as-3d-model-for-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenoprzeszczepy glejaka wielopostaciowego pochodzące od pacjentów mogą być miniaturyzowane do żywych mikroguzów za pomocą systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D. Ten test 3D guza in vivo nadaje się do testowania odpowiedzi na lek i profilowania molekularnego, w tym analizy kinomicznej.

Generowanie mikroguzów przy użyciu systemu hodowli biożelu ludzkiego 3D i komórek glejaka pochodzących od pacjentów do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki

Chłoniak z komórek płaszcza (MCL) jest trudnym do leczenia zaburzeniem komórek B i równie trudno jest stworzyć mysi model ksenoprzeszczepu pierwotnego MCL w celu zbadania i opracowania terapii. W tym miejscu opisujemy udane wprowadzenie ksenoprzeszczepów MCL u myszy, aby pomóc zrozumieć ich biologię.

Wszczepienie guza w mysim modelu ksenoprzeszczepu chłoniaka z ludzkich komórek płaszcza

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Niedotlenienie jest cechą charakterystyczną mikrośrodowiska guza i odgrywa kluczową rolę w progresji raka. Ten artykuł opisuje proces wytwarzania niedotlenionego raka na chipie opartego na technologii drukowania komórek 3D w celu podsumowania patologii raka związanej z niedotlenieniem.

Drukowany w 3D hipoksyjny rak na chipie do rekapitulacji patologicznej progresji raka litego

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Poznaj metodę biodruku hydrożelowych plastrów guza do badania chłoniaka z komórek płaszcza. Model 3D z alginatem i kolagenem poprawia fizjologiczną relewantność w porównaniu do kultur 2D.

Biodruk hydrożelowych plastrów guza jako model 3D chłoniaka z komórek płaszcza

Przeglądaj więcej filmów