Name: Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj test kometarny do ilościowej oceny uszkodzeń DNA w komórkach 32D z mutacją FLT3 po ekspozycji na inhibitory typu I i II. Metoda ta pozwala ocenić genotoksyczność leków w białaczce AML.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Innowacyjny Zespół Badawczy ds. Nauki i Technologii Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (2021), Program Centrum Badań nad Technologią Inżynieryjną Jiangsu Vocational College (2023), Program Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych Prowincji Zhejiang (2025KY1861), Podstawa Klucza Nauk Przyrodniczych Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu w Chinach (Grant nr 24KJA310008), Programy Wyższej Szkoły Zdrowia Zawodowego w Suzhou (Grant Nr. SZWZYTD202201, szwzy202406) oraz Projekt Państwowego Kluczowego Laboratorium Medycyny i Ochrony przed Promieniowaniem Uniwersytetu Soochow (GZK12023013).

1. Budowa modelu uszkodzeń DNA w komórkach 32D z mutacjami FLT3-ITD 18
<ol>
	<li>Odzyskiwanie komórek<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy szybko przenieś kriokonserwowane zmutowane komórki 32D FLT3-ITD (przechowywane w temperaturze -80 °C). Pobrać kriowiale za pomocą kleszczy i natychmiast zanurzyć je w łaźni wodnej o regulowanej temperaturze (37 °C ± 0,5 °C) dokładnie na 60 sekund, aby zakończyć kontrolowane rozmrażanie. UWAGA: Podczas rozmrażania należy z przerwami potrząsać kriowialiami w łaźni wodnej, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.</li>
		<li>Odwirować kriokonserwowane próbki w temperaturze 150 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C ± 1 °C. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą sterylnych pipet serologicznych, zachowując osad komórkowy.</li>
		<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej (RPMI 1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny/streptomycyny) do probówki do kriokonserwacji. Przeprowadzić delikatne rozcieranie przez 10 kolejnych cykli pipetowania (objętość 1 ml), aby zapewnić całkowite ponowne wymieszanie. Przenieść zawiesinę komórkową do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodać 7 ml kompletnej pożywki, aby uzyskać końcową objętość 8 ml.</li>
		<li>Delikatnie poruszyć naczynie hodowlane pięcioma ruchami poziomymi i pięcioma ruchami obrotowymi. Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C ± 0,2 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95%. Inkubować przez 24 godziny przed przetwarzaniem eksperymentalnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena żywotności komórek<ol>
		<li>Wybierz do eksperymentu zmutowane komórki 32D FLT3-ITD w logarytmicznej fazie wzrostu o dobrym statusie komórkowym. UWAGA: Komórki w logarytmicznej fazie wzrostu mają zwykle krótki cykl podziału i wysoką częstotliwość podziałów komórkowych.<ol>
			<li>Obserwuj morfologię i stan wzrostu komórek 32D z mutacją FLT3-ITD za pomocą mikroskopu elektronowego. Upewnij się, że spełnione są kryteria progów proliferacji komórkowej: Szukaj komórek che, które mają postać pojedynczej kuleczki o gładkich krawędziach, jednolitej dyspersji, niewielu agregatach, jednolitym rozmiarze komórki, nienaruszonej integralności błony plazmatycznej i szczątkach komórkowych &lt; 5%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj licznika komórek, aby określić stężenie zawiesiny komórek. UWAGA: Wymieszaj zawiesiny komórek (10 kolejnych cykli pipetowania przy użyciu sterylnych końcówek o pojemności 1 ml przy maksymalnej prędkości pipety 50%).</li>
		<li>Standaryzacja zawiesiny komórek do 2,0 × 105 komórek/ml w kompletnej pożywce wzrostowej przy użyciu iteracyjnego rozcieńczania. Za pomocą pipety dozować 50 μl porcji do studzienek centralnych (B2-G7) 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Napełnij studzienki peryferyjne (A1-H12) 100 μl sterylnego PBS, aby utrzymać wilgotność i zminimalizować efekt parowania krawędzi.</li>
		<li>Przygotowanie pożywki zawierającej inhibitor FLT3: Wybierz dziewięć studzienek na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i oznacz je zgodnie z drabinką stężeń inhibitora FLT3 (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250, 500 i 1000 nM). Dodać 400 μl kompletnej pożywki do studzienek oznaczonych 10,0 μM i 200 μl kompletnej pożywki do pozostałych studzienek.<ol>
			<li>Rozcieńczenie gilterytynibu: Dodać 4 μl 100 μM odczynnika gilterytynibu (gilterytynib w dimetylosulfotlenku) do każdej z studzienek oznaczonych 1000 nM za pomocą pistoletu do pipet i dokładnie wymieszać roztwór. Pobrać pipetą 200 μl 1000 nM gilterytynibu do studzienek oznaczonych 500 nM i wymieszać; następnie odpipetować 200 μl 500 nM gilterytynibu do studzienek oznaczonych 250 nM i wymieszać. Za każdym razem należy pobrać 200 μl poprzedniego rozcieńczenia do następnego dołka i wymieszać do uzyskania pożądanego stężenia.</li>
			<li>Rozcieńczenie AC220: Dodać 4 μl 100 μM odczynnika AC220 (AC220 w dimetylosulfotlenku) do każdej z studzienek oznaczonych 1000 nM za pomocą pistoletu do pipet. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2.4.1 dla pozostałych studzienek. UWAGA: Upewnij się, że podstawowy roztwór inhibitora FLT3 w pipecie został całkowicie przeniesiony do studzienek, aby uniknąć resztek roztworu. Upewnij się, że roztwór jest dobrze wymieszany przed przystąpieniem do rozcieńczania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja: Dozować pożywkę zawierającą inhibitor FLT3 do wyznaczonych studzienek (50 μl/studzienkę) za pomocą pipety. Utrzymywać 96-dołkową płytkę w fizjologicznych warunkach hodowli (37,0 °C ± 0,2 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) dokładnie przez 72 godziny ± 15 minut.</li>
		<li>Podwielokrotność 10 μl odczynnika CCK-8 do wszystkich studzienek doświadczalnych i ślepej próby kontrolnej za pomocą pipety. Chronić płytkę przed światłem i inkubować ją w warunkach normoksyjnych (37 °C, 5% CO2 ) przez 2,0 H ± 10 min. UWAGA: Dozuj odczynnik z niską prędkością pipety z końcówką o głębokości zanurzenia 2 mm, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas dodawania próbki, aby zapobiec zakłóceniom odczytów średnicy zewnętrznej.</li>
		<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Zapisz wyniki.</li>
		<li>Obliczyć % inhibicji zgodnie ze wzorem obliczeniowym IC50 : Hamowanie (%) = <img alt="Equation for MTT assay analysis, showing optical density (OD) measurement calculation formula." src="/files/ftp_upload/68469/68469eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Equation 1"> × 100% Studzienka eksperymentalna leku oznacza studzienki komórkowe poddane działaniu leku. Kontrola komórkowa dobrze oznacza studzienki komórkowe, które nie były leczone lekiem. Ślepe studzienki kontrolne wskazują tylko podłoże bez komórek.</li>
		<li>Analizuj znormalizowane dane dawka-odpowiedź za pomocą regresji nieliniowej, wykorzystując czteroparametrowy model logistyczny. Kliknij przycisk Dopasowanie krzywej, aby dopasować krzywą. Wyprowadź połówkę maksymalnego stężenia hamującego (IC50) ze zbieżności modelu (R2 &gt; 0,98, reszta sumy kwadratów &lt; 0,15) i oblicz 95% przedziały ufności za pomocą 1000-iteracyjnego ponownego próbkowania bootstrap.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment uszkodzenia DNA komórek 32D z mutacją FLT3-ITD indukowaną przez inhibitor FLT3<ol>
		<li>Wybierz zmutowane komórki 32D FLT3-ITD wykazujące gwałtowny wzrost (czas podwojenia populacji &lt; 24 godziny) do oceny uszkodzeń DNA.</li>
		<li>Policz komórki (szczegółowe informacje znajdują się w kroku 1.2.2).</li>
		<li>Wysiew komórek: Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 1 × 106 komórek na naczynie, używając naczynia o średnicy 6 cm i 4 ml zawiesiny komórek na szalkę.</li>
		<li>Przygotować trzy kontrpróby dla każdego stężenia inhibitora: 55 nM gilterytynib: 4 ml pożywki + 2,2 μl 100 μM podstawy, 0,15 nM AC220: 4 ml pożywki + 6 μL 100 nM podstawy. Roztwory należy mieszać wirowo i równoważyć je w temperaturze 37 °C przez 15 minut; Delikatnie potrząśnij probówkami, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie. Odessać oryginalną pożywkę i zastąpić ją 4 ml na naczynie świeżo przygotowanej pożywki zawierającej inhibitory za pomocą sterylnych pipet serologicznych.</li>
		<li>Inkubować leczone komórki w warunkach fizjologicznych (37 °C, 5% CO2 , 95% wilgotności) w określonych odstępach czasu (0, 2, 4, 6 H). Natychmiast przeprowadź kontrolę czasu zerowego w celu oceny uszkodzeń DNA na linii bazowej.</li>
		<li>Test wykluczania błękitu trypanowego<ol>
			<li>Odwirować zebrane komórki pod ciśnieniem 150 × g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
			<li>Odpipetować 100 μl zawieszonych komórek do plastikowej probówki wirówkowej, dodać 100 μl barwnika trypanowego (2x), delikatnie wymieszać i barwić przez 3 min.</li>
			<li>Policz komórki (szczegółowe informacje znajdują się w kroku 1.2.2).</li>
			<li>Oblicz żywotność komórek w następujący sposób: %Przeżycie komórki = <img alt="Cell viability calculation formula; equation for assessing viable cell proportion in sample analysis." src="/files/ftp_upload/68469/68469eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Equation 2"> × 100% UWAGA: Tylko próbki o żywotności ≥90% zostały przetworzone do testu komety.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynnika i przygotowanie próbki komórki
<ol>
	<li>Równoważyć roztwór do lizy (zawierający 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) w temperaturze 4 °C ± 0,5 °C przez 30 minut w lodówce.</li>
	<li>Rozpuść niskotopliwą agarozę (LMA) w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu.</li>
	<li>Przygotować alkaliczny bufor do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH &gt;13) przez zważenie 12 g NaOH za pomocą wagi elektronicznej, pipetowanie 2 ml 500 mM roztworu EDTA, a następnie dodanie ddH2O w celu uzupełnienia do 1 l buforu.</li>
	<li>Pobieranie komórek<ol>
		<li>Zebrać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesiny komórkowe o masie 800 × g przez 5 minut. Odessać supernatanty za pomocą filtracji próżniowej.<ol>
			<li>Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża za pomocą końcówek do pipet o szerokim otworze 1 ml, a następnie wykonać 10 pionowych inwersji.</li>
			<li>Policz komórki jak w kroku 1.2.</li>
			<li>Odwirować zawiesinę komórek w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml o masie 150 × g przez 5 minut, aby usunąć całe podłoże. Ponownie zawiesić umyte komórki w bezwapniowym PBS do ~5,0 × 105 komórek/ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura oznaczania komety
<ol>
	<li>Wcześniej przygotuj preparaty testowe komet i próbki komórek. Za pomocą pipety przygotować mieszaninę agarozy LMA i zawiesiny komórek (5 × 105 komórek/ml) w probówkach o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszać. Dozować 55 μl porcji mieszaniny agarozy i komórek na szkiełka komety za pomocą pipety umieszczonej pod kątem 45°, zachowując odległość 2 mm od powierzchni szkiełka. Umieścić szkiełka pokryte mieszaniną w temperaturze 4 °C na 30 minut, aby uniknąć światła. UWAGA: Podczas dodawania mieszaniny LMA i komórek do szkiełek testowych komety, należy dozować zawiesinę powoli i równomiernie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków i zapewnić jednorodny rozkład żelu.</li>
	<li>Zanurzyć zestalone szkiełka w wstępnie schłodzonym roztworze do lizy (zawierającym 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO) i przeprowadzać lizę przez ≥1 H w temperaturze 4 °C w warunkach ochrony przed światłem.</li>
	<li>Po lizie wyjmij szkiełko z lizatu i użyj pistoletu do pipet, aby zassać jak najwięcej płynu wokół łopatki. Następnie umieścić szkiełko w alkalicznym buforze do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH &gt;13) i wstępnie zrównoważyć przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, uważając, aby nie dopuścić do światła.</li>
	<li>Elektroforeza: Umieść szkiełka w komorze do elektroforezy i dodaj wystarczającą ilość alkalicznego roztworu elektroforetycznego, aby zanurzyć szkiełka. Przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 24 V (odpowiednik 0,74 V/cm) stałym prądem (300 mA) przez 30 minut przy użyciu wstępnie zrównoważonego buforu (4 °C) w celu zminimalizowania uszkodzeń DNA.</li>
	<li>Neutralizacja: Po elektroforezie za pomocą pistoletu do pipet odessać alkaliczny roztwór elektroforezy ze szkiełka, zanurzyć szkiełka na 2 x 5 min wdH2O, a następnie zanurzyć je w 70% etanolu na 5 min. Suszyć szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Barwienie: Nałożyć 100 μl podwielokrotności 1x barwnika kwasem nukleinowym YeaRed na dołek i inkubować przez 30 minut w temperaturze otoczenia w warunkach ochrony przed światłem. Nadmiar plamy usunąć poprzez delikatne spłukiwanie wodne, a następnie suszenie termiczne w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Obrazowanie: Wykonaj wizualizację fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 4x, z cyfrową akwizycją obrazu przeprowadzoną w znormalizowanych warunkach ekspozycji.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Wykonaj ilościową analizę obrazu, aby określić standardowe parametry komety, w tym DNA warkocza (%), moment warkocza oliwkowego i długość warkocza (μm).<ol>
		<li>Otwórz interfejs oprogramowania (Rysunek 5).</li>
		<li>Zaimportuj obraz do oprogramowania, kliknij przycisk Plik, a następnie kliknij przycisk Wybierz plik , aby zaimportować obraz, który chcesz przeanalizować do oprogramowania. Następnie przytrzymaj przycisk myszy i przeciągnij, aż pojawi się niebieskie pole. Przeciągnij niebieskie pole, aby upewnić się, że komórka, którą chcesz przeanalizować, jest w nim zamknięta. Opcja Dopasuj na rysunku może służyć do dostosowywania położenia ramki w taki sposób, aby obejmowała całą komórkę (Rysunek 5).</li>
		<li>Przed rozpoczęciem analizy kliknij przycisk Uruchom, a następnie kliknij przycisk Analiza. Wyniki analizy pojedynczej komórki zostaną wyświetlone po prawej stronie w sekcji "Profile". Po przeanalizowaniu każdej komórki kliknij przycisk Zapisz. Parametry, które można wykryć, są wyświetlane po prawej stronie "Profili", a wartości liczbowe różnych parametrów są wyświetlane na dole. Na koniec kliknij Plik | Eksport wyników. Uzyskane wyniki obejmują HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment i OliveTailMoment.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swaminathan, M., Wang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+therapies+for+AML%3A+A+round-up+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel therapies for AML: A round-up for clinicians.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).</li>
<li>Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+flt3+mutations+in+AML%3A+Review+of+current+knowledge+and+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence.</a> Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+and+prognosis+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+FLT3%2FAXL+inhibitor%2C+shows+antileukemic+activity+in+mouse+models+of+FLT3-mutated+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia.</a> Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).</li>
<li>Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+classification+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Genomic classification in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).</li>
<li>Cortes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quizartinib%3A+A+potent+and+selective+FLT3+inhibitor+for+the+treatment+of+patients+with+FLT3-ITD-positive+AML%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML.</a> J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).</li>
<li>Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+medicine+for+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Towards precision medicine for AML.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).</li>
<li>Kantarjian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%3A+Current+progress+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions.</a> Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).</li>
<li>Miyamoto, K., Minami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge+molecular+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia.</a> Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).</li>
<li>Yang, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+therapy+for+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Precision therapy for acute myeloid leukemia.</a> J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+Principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+to+perform+the+alkaline+standard+and+enzyme-modified+comet+assay+in+human+biomonitoring+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Genet+Toxicol+Environ+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).</li>
<li>Cotelle, S., Férard, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+in+genetic+ecotoxicology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Comet assay in genetic ecotoxicology: A review.</a> Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+Guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+comet+assay+for+assessing+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells.</a> Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).</li>
<li>Liu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flt3-itd+length+on+prognosis+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia.</a> Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+adavosertib+and+fimepinostat+on+acute+myeloid+leukemia+cells+by+enhancing+the+induction+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage.</a> Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).</li>
<li>Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+trioxide+induces+oxidative+stress%2C+DNA+damage%2C+and+mitochondrial+pathway+of+apoptosis+in+human+leukemia+%28hl-60%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells.</a> J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Test komety stanowi znaczący postęp w metodologiach oceny genotoksyczności. Technika ta oferuje wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami dzięki dostępności technicznej, rozdzielczości pojedynczej komórki i bezpośredniej wizualizacji wzorców uszkodzeń za pomocą elektroforetycznych profili migracji. W ramach rozwoju terapeutycznego AML test kometa umożliwia systematyczną ocenę profili genotoksycznych potencjalnych czynników podczas docelowych faz walidacji, dostarczając krytycznych danych farmakodynamiczn...

Ostra białaczka szpikowa (AML) stanowi klonalne zaburzenie hematopoetycznych komórek macierzystych definiowane przez patologiczną ekspansję niezróżnicowanych komórek progenitorowych szpiku, co prowadzi do zahamowania układu krwiotwórczego i niewydolności szpiku kostnego. Nieodłączna heterogeniczność molekularna AML stanowi poważne wyzwanie terapeutyczne1. Szczególne znaczenie kliniczne mają mutacje kinazy tyrozynowej 3 (FLT3) podobne do FMS, które stanowią jedną z najczęstszych zmian genetycznych w AML, występującą w około 30% przypadków i wykazują silną korelację z niekorzystnymi wynikami klinicznymi2. Kinaza tyrozynowa receptora FLT3 ulega aktywacji w błonie plazmatycznej, pośrednicząc w kaskadach sygnałowych PI3K/AKT i RAS/MAPK, podczas gdy wariant zmutowany FLT3-ITD jest zatrzymywany w retikulum endoplazmatycznym, indukując trwałą fosforylację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5). Te zmiany genetyczne napędzają leukemogenezę poprzez wiele mechanizmów onkogennych, głównie poprzez dysregulację transdukcji sygnału, niekontrolowaną sygnalizację proliferacyjną i oporność apoptotyczną3.
AC220 i gilterytynib, jako typowe inhibitory FLT3, hamują proliferację komórek i indukują apoptozę poprzez hamowanie ekspresji FLT3, ale o różnych mechanizmach działania. Gilterytynib (inhibitor typu I) nie tylko obejmuje szersze spektrum mutacji aktywujących FLT3, ale także hamuje kinazę tyrozynową AXL, która jest blisko spokrewniona z FLT3. Poprzez podwójne hamowanie, gilterytynib może blokować wzrost komórek rakowychw bardziej kompleksowy sposób4. AC220 (inhibitor typu II) wywiera działanie hamujące poprzez konkurencyjne wiązanie z aktywowaną konformacją kinazy, specyficznie ukierunkowaną na kieszeń wiążącą ATP z wysoką swoistością5. To hamowanie może prowadzić do zatrzymania cyklu komórkowego i zwiększonego stresu replikacji DNA.
Gilterytynib wiąże się z niskim ryzykiem wystąpienia oporności i jest wskazany do monoterapii w nawrotowej/opornej na leczenie AML z mutacją FLT3. AC220 jest skuteczny i selektywny w przypadku mutacji FLT3-ITD, z dobrymi wskaźnikami odpowiedzi klinicznej, ale jest nieskuteczny w przypadku mutacji FLT3-TKD i może być oporny na mutacje FLT3-TKD z powodu wtórnych mutacji FLT3-TKD (np. D835 lub F691L) na rozwój oporności. Inhibitory te zyskały na znaczeniu w terapiach AML w oparciu o wykazaną skuteczność kliniczną i ulepszone wskaźniki terapeutyczne6. Jednak kliniczne stosowanie tych leków jest utrudnione ze względu na nabytą oporność i efekty niezamierzone. Długotrwałe stosowanie AC220 w warunkach klinicznych prowadzi do oporności spowodowanej mutacjami FLT3-TKD, podczas gdy długotrwałe stosowanie gilterytynibu może mieć ograniczenia w przypadku mutacji złożonych (np. FLT3-ITD w połączeniu z TKD), nawet jeśli nie prowadzi do oporności z powodu mutacji FLT3-TKD 7,8.
Te dwie klasy inhibitorów FLT3 wywierają podwójny efekt terapeutyczny poprzez pośrednie wywoływanie stresu replikacyjnego poprzez hamowanie FLT3 i blokadę proliferacyjnego szlaku sygnałowego - sygnalizacji RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5. Blokada proliferacji komórek zwykle prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego, zaburzeń metabolicznych (rozregulowania homeostazy redoks), a ostatecznie do apoptozy 9,10. Mechanizm ten ostatecznie generuje zmiany w DNA, które aktywują kompensacyjne adaptacje naprawy DNA w opornych populacjach komórek. Test kometarny umożliwia ilościowe porównanie specyficznych dla inhibitorów profili uszkodzeń DNA w komórkach z mutacją FLT3. To eksperymentalne podejście dostarcza kluczowych informacji dla opracowania racjonalnych terapii skojarzonych, które wykorzystują podatność na uszkodzenia DNA, pokonując w ten sposób nabytą oporność terapeutyczną.
Współczesne metodologie wykrywania uszkodzeń DNA obejmują analizę immunohistochemiczną, elektroforezę fragmentów DNA w żelu agarozowym, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) i sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), z których każda wykazuje wysoką czułość analityczną i swoistość11. Podejścia te są jednak ograniczone znacznymi wymaganiami finansowymi, wydłużonym czasem przetwarzania i rygorystycznymi warunkami eksperymentalnymi. Podkreśla to konieczność przyjęcia strategii wykrywania, które równoważą precyzję analityczną z prostotą obsługi.
Test komety jest szeroko stosowany w toksykologii środowiskowej i ocenie genotoksyczności ze względu na jego doskonałą czułość, dostępność techniczną, wizualizację ilościową uszkodzeń DNA i szerokie zastosowanie w systemach biologicznych12,13. Ustalono trzy główne warianty metodologiczne: alkaliczny test kometaryczny do wykrywania pęknięć jedno/dwuniciowych, neutralny test kometaliczny do analizy pęknięć dwuniciowych oraz test kometarny modyfikowany enzymatycznie do identyfikacji specyficznych zmian w DNA. 14
Zasada metodologiczna obejmuje: (1) indukcję pęknięć nici DNA poprzez leczenie eksperymentalne; (2) Rozpuszczanie błon komórkowych i jądrowych za pośrednictwem buforu lizy, umożliwiające dyfuzję białek cytoplazmatycznych / jądrowych i RNA do buforu elektroforezy, podczas gdy DNA o dużej masie cząsteczkowej pozostaje unieruchomione w matrycy agarozowej; (3) Denaturacja alkaliczna (pH > 13) indukująca odwijanie DNA i uwalnianie uszkodzonych fragmentów DNA; (4) Elektroforetyczna migracja anodowa rozdrobnionego DNA napędzana polem elektroforycznym, tworząca charakterystyczną morfologię komety, z nienaruszonym DNA zachowującym sferyczną strukturę nukleoidową15,16. Kwantyfikacja uszkodzeń DNA jest osiągana poprzez komputerową analizę procentowego DNA ogona (TDP), zapewniając precyzyjny pomiar wpływu genotoksycznego w rozdzielczości pojedynczej komórki17.
W badaniu wykorzystano systematyczne ramy eksperymentalne w celu porównania zróżnicowanych genotoksycznych skutków gilterytynibu i AC220 w zwalidowanych komórkach 32D z mutacją FLT3. Projekt eksperymentalny składał się z dwóch głównych elementów: (i) ustanowienia modelu uszkodzenia DNA specyficznego dla mutacji FLT3 oraz (ii) ilościowej oceny uszkodzeń DNA wywołanych przez lek za pomocą metodologii alkalicznego testu kometowego. Linia komórkowa 32D z mutacją FLT3 była utrzymywana w standardowych warunkach in vitro przed ekspozycją na seryjnie rozcieńczane inhibitory FLT3. Żywotność komórek oceniano za pomocą testów CCK-8, a następnie obliczono wartości połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50) za pomocą analizy regresji nieliniowej. Jako próg indukcji uszkodzenia DNA wybrano pięciokrotną wartość IC50 . Komórki poddane działaniu leku pobrano i osadzono w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szkiełkach w celu późniejszej analizy. Separację elektroforetyczną przeprowadzono przy napięciu 24 V (~0,74 V/cm) i ciśnieniu 300 mA przez 30 minut w buforze alkalicznym, podczas którego fragmentaryczne DNA migrowało anodowo, tworząc charakterystyczną morfologię komety, podczas gdy nienaruszone DNA zachowywało sferyczną konfigurację nukleoidu. Kwantyfikacja uszkodzeń DNA została osiągnięta za pomocą skomputeryzowanego projektu oprogramowania do analizy obrazu (CASP) mierzącego moment warkoczący, przy czym zwiększone wartości momentu ogona Olive były bezpośrednio skorelowane z zakresem fragmentacji DNA.

<table><tbody><tr><td>0,5 mln EDTA</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał ST066</td><td></td></tr><tr><td>1x barwnik kwasu nukleinowego YeaRed</td><td>Yeasen powiedział:</td><td>Numer katalogowy 10202ES</td><td></td></tr><tr><td>KOMÓRKA 32D</td><td>Cobioer</td><td>CBP60995</td><td></td></tr><tr><td>Zobacz materiał AC220</td><td>CelMol</td><td>Zobacz materiał T2066 TGL</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Dojindo powiedział:</td><td>CK04 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do liczenia komórek</td><td>QiuJing powiedział:</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>Projekt oprogramowania do oznaczania komety (CASP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania komety&nbsp;</td><td>Trevigen powiedział:</td><td>4250-050-TYS.</td><td></td></tr><tr><td>Cytat 5</td><td>BioTek</td><td>16280004</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Sieć Usługowa</td><td>PATELNIA</td><td>Zobacz materiał ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Gilterytynib</td><td>CelMol</td><td>Zobacz materiał T4409 TGL</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Pryzmat 9.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Thermo</td><td>&nbsp; Zobacz materiał 9AQ2861 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Pipety L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipety L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>zbiornik ciekłego azotu</td><td>Mvecryoge powiedział:</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>Fotometr mikropłytkowy Multiskan FC</td><td>Thermo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>Na2OH</td><td>DAMAO (Język DAMAO)</td><td>1588</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>Zobacz materiał P1020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny, 100x</td><td>Beyotime</td><td>Zobacz materiał C0222</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>C22400500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trójokularowy mikroskop żywych komórek</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka niskotemperaturowa</td><td>Włosy</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń dna w komórkach 32d z ekspresją mutanta flt3 po ekspozycji na inhibitory flt3 typu i i ii

Comet Assay to Quantify DNA Damage in FLT3 Mutant-expressing 32D Cells after Exposure to Type I and Type II FLT3 Inhibitors

Kinaza tyrozynowa 3 podobna do FMS (FLT3), kinaza tyrozynowa receptora klasy III, wykazuje częstość mutacji około 30% u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML) i stanowi krytyczny cel terapeutyczny. Jako reprezentatywne inhibitory FLT3 typu I i typu II, gilterytynib i chizartynib (AC220) są klinicznie stosowane w leczeniu AML z mutacją FLT3. 
Gilterytynib hamuje zarówno aktywowane, jak i inaktywowane białka FLT3, z dodatkowym hamowaniem celów AXL, aby pomóc w przezwyciężeniu oporności. AC220 hamuje aktywowany FLT3. Test kometarny był systematycznie stosowany do ilościowego określania i porównywania wzorców uszkodzeń DNA indukowanych przez inhibitory FLT3 typu I i typu II w zmutowanych komórkach. Wyniki eksperymentów ujawniły, że uszkodzenia DNA spowodowane przez AC220 były znacznie wyższe niż te spowodowane przez gilterytynib. W przypadku silnych uszkodzeń DNA, inhibitory FLT3 można łączyć z inhibitorami naprawy uszkodzeń DNA, aby celować w defekty naprawy DNA. Wyniki stanowią eksperymentalne wsparcie dla racjonalnej strategii łączenia leków ukierunkowanych na uszkodzenia DNA.

Test kometarny był systematycznie stosowany do ilościowego określania zróżnicowanych profili uszkodzeń DNA indukowanych przez gilterytynib i AC220 w liniach komórkowych z mutacją FLT3. Analizy wykazały, że różnica w uszkodzeniach DNA między populacjami komórek nieleczonych gilterytynibem i AC220 nie była statystycznie istotna (P &gt; 0,05). Zależne od dawki zwiększenie wartości Tail DNA (%) i Olive Moment Tail (OMT) osiągnęło istotność statystyczną (P &lt; 0,05) po 2-6 godzinach ekspozycji. OMT oznacza iloczyn % DNA w og...

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3), a class III receptor tyrosine kinase, exhibits a mutation frequency of approximately 30% in acute myeloid leukemia ...

Wykorzystujemy test kometarny do systematycznej oceny genotoksyczności inhibitorów FLT3 typu I i typu II na zmutowanych komórkach FLT3 32D, dostarczając krytycznych danych do optymalizacji klinicznej w AML. Podczas zabiegów niewłaściwe obchodzenie się z narzędziem mikrochirurgicznym spowoduje uszkodzenie szkiełka, powodując utratę próbki. Badania wskazują, że AC220 jako inhibitor typu II powoduje poważniejsze uszkodzenia DNA w zmutowanych komórkach FLT3, dostarczając kluczowych informacji dla opracowania terapii skojarzonych poprzez wykorzystanie podatności na uszkodzenia DNA w celu przezwyciężenia oporności terapeutycznej.Zbadanie mechanizmu działania inhibitorów FLT3 w leczeniu AML i opracowanie strategii dwulekowej lub wielolekowej terapii skojarzonej opartej na inhibitorach FLT3. Na początek przygotuj mieszaninę 10 do jednego agarozy o niskiej temperaturze topnienia i zawiesiny komórek w 1,5 mililitrowych probówkach za pomocą pipety i delikatnie wymieszaj. Dozować 55 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny komórek agarozy na szkiełka komety za pomocą pipety trzymanej pod kątem 45 stopni.Następnie umieść szkiełka pokryte mieszanką w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut w ciemnym otoczeniu. Zanurzyć zestalone szkiełka we wstępnie schłodzonym roztworze do lizy i inkubować przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc szkiełka przed światłem. Po lizie usunąć szkiełka z roztworu do lizy.Za pomocą pistoletu do pipet ostrożnie zassaj jak najwięcej pozostałego płynu z okolic łopatki. Następnie umieść szkiełka w buforze do elektroforezy alkalicznej i pozwól im osiągnąć wstępną równowagę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Teraz umieść szkiełka w komorze elektroforezy.Aby całkowicie zanurzyć szkiełka, dodaj wystarczającą ilość wstępnie schłodzonego roztworu do elektroforezy alkalicznej. Uruchom elektroforezę przy napięciu 24 V ze stałym prądem przez 30 minut, używając buforu wstępnie zbalansowanego w celu zmniejszenia uszkodzenia DNA. Po elektroforezie za pomocą pistoletu do pipet odessać alkaliczny bufor do elektroforezy z okolic szkiełka.Zanurz szkiełka w podwójnie destylowanej wodzie na pięć minut, a następnie zanurz szkiełka w 70% etanolu na pięć minut. Umieść szkiełka w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza na 15 minut do wyschnięcia. Następnie nałóż 100 mikrolitrów podwielokrotności barwienia kwasem nukleinowym YeaRed do każdej studzienki szkiełka.Inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza w środowisku chronionym przed światłem. Delikatnie spłucz szkiełka wodą, aby usunąć nadmiar plam i wysusz je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Test kometarny był systematycznie stosowany do ilościowego określania zróżnicowanych profili uszkodzeń DNA indukowanych przez gilterytynib i AC220 w zmutowanych liniach komórkowych FLT3.Analiza ilościowa procentowego DNA ogona potwierdziła, że oba związki znacznie zwiększają uszkodzenia DNA po dwóch, czterech i sześciu godzinach, przy czym AC220 wytwarza wyższe poziomy uszkodzeń niż gilterytynib w każdym punkcie czasowym. Wszystkie pomiary ogona momentowego odzwierciedlały trend DNA ogona ze statystycznie istotnymi wzrostami dla obu zabiegów od dwóch do sześciu godzin i wyższymi wartościami OTM obserwowanymi w grupie AC220 przez cały czas.

comet-assay-to-quantify-dna-damage-flt3-mutant-expressing-32d-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez CCR7-efektorowe limfocyty T pamięci. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak indukować aktywną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie aktywnej nadwrażliwości opóźnionej (DTH) u szczurów

Limfocyty T regulatorowe: potencjał terapeutyczny w leczeniu odrzutów przeszczepów i cukrzycy typu I

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Poznaj test kometarny do ilościowej oceny uszkodzeń DNA w komórkach 32D z mutacją FLT3 po ekspozycji na inhibitory typu I i II. Metoda ta pozwala ocenić genotoksyczność leków w białaczce AML.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II (Wideo) | JoVE Journal

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Przeglądaj więcej filmów