Name: Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-15T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj protokół izolacji siatkówki myszy do badań eksplantatowych glialnych interakcji w kontekście neurozapalenia jaskry. Ta metoda zachowuje naturalne środowisko komórek siatkówki, umożliwiając dokładniejszą analizę fizjologicznych funkcji komórek glejowych i ich wpływu na przeżycie neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.A.M. był wspierany przez NIH/NEI R01EY035312, Jaskrę Research Foundation Catalyst for a Cure Award, Fundację Melzy M. i Franka Theodore'a Barrów, Fundację Roberta M. Sinskeya, MD, Fundację Ruettgers Family Charitable Foundation oraz Fundację B.L. Manger. P.F.C. był wspierany przez NIH/NEI 2T32EY007145. Prace te były również możliwe dzięki grantowi NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176. Rysunek 1 został wygenerowany za pomocą Biorender. Autorzy pragną podziękować dr Nasirowi Uddinowi za opinie na temat manuskryptu oraz dr Qiurong Zhu za pomoc i wsparcie.

<ol><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy%3A+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).</li>
<li>Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+roads+lead+to+glaucoma%3A+induced+retinal+injury+cascades+contribute+to+a+common+neurodegenerative+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome.</a> Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).</li>
<li>Tham, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+glaucoma+and+projections+of+glaucoma+burden+through+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).</li>
<li>Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-neuron+interactions+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-neuron interactions in the mammalian retina.</a> Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).</li>
<li>Livne-Bar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+lipoxins+A4+and+B4+promote+neuroprotection+from+acute+and+chronic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury.</a> J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).</li>
<li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+reactive+astrocytes+are+induced+by+activated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia.</a> Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Verkhratsky, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of astroglia.</a> Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Tezel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+neuroinflammation+in+glaucoma%3A+current+knowledge+and+the+ongoing+search+for+new+treatment+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets.</a> Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).</li>
<li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbead+occlusion+model%3A+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).</li>
<li>Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+ganglion+cell+loss+and+optic+nerve+degeneration+in+DBA%2F2J+mice+is+variable+and+asymmetric%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric.</a> BMC Neurosci. 7, 66(2006).</li>
<li>Paschalis, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+neuroglial+remodeling+of+the+retina+following+infiltration+of+CSF1R+inhibition-resistant+peripheral+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).</li>
<li>Rutigliani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+retina+and+optic+nerve+neuroinflammation+in+enucleated+eyes+from+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients.</a> Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunoaffinity-based+method+for+isolating+ultrapure+adult+astrocytes+based+on+ATP1B2+targeting+by+the+ACSA-2+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody.</a> J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).</li>
<li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+methods+to+study+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro methods to study microglia.</a> Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).</li>
<li>Batiuk, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+region-specific+astrocyte+subtypes+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution.</a> Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).</li>
<li>Cullen, P. F., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+of+the+eye+and+optic+nerve%3A+heterogeneous+populations+with+unique+functions+mediate+axonal+resilience+and+vulnerability+to+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ophthalmol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma.</a> Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).</li>
<li>Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+retinal+astrocytes+identifies+a+specific+marker+and+points+to+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization.</a> Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).</li>
<li>Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+intact+retinal+astrocytes%3A+a+novel+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach.</a> Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).</li>
<li>Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglia in the developing retina.</a> Neural Dev. 14 (1), 12(2019).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>Tao, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+proteoglycans+act+as+cellular+receptors+for+basement+membrane+assembly+to+control+astrocyte+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis.</a> Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).</li>
<li>Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+retina+explants%3A+from+ex+vivo+to+in+vivo+model+of+central+nervous+system+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries.</a> Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).</li>
<li>Vagaja, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+murine+hyalocytes+are+valuable+early+indicators+of+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).</li>
<li>Alarautalahti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+mouse+retinal+explant+cultures+assessed+by+preservation+of+functionality+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).</li>
<li>Rodrigues, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vital+dyes+in+ocular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The use of vital dyes in ocular surgery.</a> Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+inflammatory+responses+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy.</a> Front Immunol. 11, 564077(2020).</li>
<li>Reboussin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neuroprotective+and+immunomodulatory+properties+of+mesenchymal+stem+cells+in+an+ex+vivo+retinal+explant+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).</li>
<li>Do, M. T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+and+the+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%3A+biophysics+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior.</a> Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).</li>
<li>Yu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+target+synaptic+sites+early+during+excitatory+circuit+disassembly+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration.</a> iScience. 28 (4), 112201(2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podejścia do hodowli organotypowych32 , takie jak eksplantaty siatkówki, wykorzystują eksperymentalną elastyczność i szybki czas realizacji hodowli komórkowych, zachowując jednocześnie wiele z kontekstu in situ badań in vivo , co czyni je skuteczną drogą do badania złożonych interakcji między typami komórek. Przedstawiamy ten protokół jako punkt wyjścia dla badaczy, którzy mogą mieć duże doświadczenie z okiem i czuć się komfortowo manipulując stałą siatkówką, ale nie nową; W zwią...

Siatkówka światłoczuła, przedłużenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) znajdująca się w tylnej części oka, jest niezbędna dla wzroku, ale podatna zarówno na ostre urazy, jak i przewlekłe choroby. Podobnie jak w przypadku innych regionów OUN, neurony w dorosłej siatkówce nie są zastępowane w przypadku utraty, a komórki zwojowe siatkówki (RGC), które agregują i przekazują informacje wizualne do mózgu, są szczególnie podatne na dysfunkcję i śmierć w jaskrze, co powoduje nieodwracalną utratę wzroku1,2. Jaskra jest główną przyczyną ślepoty na całym świecie3, jednak pomimo niszczycielskiego wpływu na osoby dotknięte chorobą i ogólnych kosztów dla społeczeństwa, wiele pozostaje niewiadomych na temat tego, jak wczesne stadia choroby przyczyniają się do utraty RGC4. Rola gleju jest głównym obszarem badań w patofizjologii jaskry, ponieważ te nieneuronalne komórki podporowe są niezbędne do przeżycia RGC5, ale ulegają fenotypowym zmianom w chorobie, które mogą zmniejszać korzystne zachowanie6 lub nawet napędzać przyjęcie szkodliwych fenotypów7. Chociaż termin glej obejmuje szereg wyspecjalizowanych typów komórek w całym OUN8, można je ogólnie podzielić na dwie kategorie - te, które dzielą linię rozwojową z neuronami i zapewniają wsparcie troficzne, energetyczne i strukturalne9, oraz te o pochodzeniu szpikowym, które wykonują specjalistyczne zadania związane z nadzorem immunologicznym i reagowaniem10. Przedstawiciele obu kategorii - astrocyty i komórki Müllera w pierwszej, mikroglej w drugiej - zasiedlają siatkówkę5 i przechodzą poważne zmiany w jaskrze, które rodzą istotne pytania o ich rolę w progresji choroby i przeżyciu RGC11.
Próby odpowiedzi na te pytania są częściowo utrudnione przez wewnętrzne cechy gleju siatkówki, które stanowią wyzwanie zarówno dla badań in vivo, jak i in vitro. W przeciwieństwie do neuronów, są one stosunkowo ciche elektrycznie, co sprawia, że podejścia takie jak ERG, które umożliwiają funkcjonalną ocenę RGC i fotoreceptorów in vivo, nie nadają się do badania zmian w funkcji i zachowaniu gleju. I chociaż dostępne są modele jaskry indukowalne12 i spontaniczne13 jaskry, wiele pozostaje niewiadomych na temat zmian w gleju w najwcześniejszych punktach choroby, które mogą poprzedzać wykrywalną utratę RGC, problem potęgowany przez zmienną penetrację stanu chorobowego w wielu z tych modeli. Co więcej, dowody zarówno kliniczne, jak i eksperymentalne dotyczące jaskry sugerują wkład obwodowych komórek odpornościowych, które mogą być trudne do odróżnienia od komórek mikrogleju, pomimo wskaźników, że mogą one działać w różnych "kierunkach", wpływając na postęp choroby14,15.
Wyzwania również obfitują w badanie gleju siatkówki in vitro. Chociaż izolacja i hodowla astrocytów16,17 i microglia18 z mózgu są dobrze znane, ostatnie prace podkreślają rozległą heterogeniczność glejową między regionami OUN, zwłaszcza w astrocytach19, a fenotypy obecne w jednym regionie mogą nie być obecne w gleju z innego, takiego jak retina20,21. Jednak bezpośrednia izolacja astrocytów siatkówki i mikrogleju do badań jest szczególnie trudna, ponieważ oba typy komórek są stosunkowo rzadkie - każdy z nich stanowi mniej niż 1% z szacowanych 6,5 miliona komórek w siatkówce myszy22,23,24. Ponadto, w przeciwieństwie do neuronów, komórki glejowe są bardzo plastyczne i szybko przystosowują się do dramatycznych zmian w swoim otoczeniu16,18,25; W rezultacie, zachowania obserwowane w tych komórkach in vitro mogą reprezentować specyficzne adaptacje do ich nowego środowiska, a nie wzorce fenotypowe, które zwykle byłyby obserwowane w zdrowiu lub chorobie. Biorąc pod uwagę ograniczenia zarówno eksperymentów in vivo, jak i pierwotnej hodowli gleju siatkówki, poszukiwaliśmy podejścia pośredniego - eksplantatów siatkówki - w którym glej, RGC i inne elementy siatkówki są zachowane in situ w kontekście ex vivo. W porównaniu z modelami in vivo, podejście to oferuje skrócony eksperymentalny przebieg czasowy26, umożliwia bezpośrednią eksperymentalną manipulację glejem siatkówki27 i pozwala uniknąć potencjalnie mylącego wpływu infiltracji obwodowych komórek odpornościowych14. I odwrotnie, w przeciwieństwie do pierwotnej hodowli komórkowej, zakłócenia środowiska zewnątrzkomórkowego są minimalne, a glej pozostaje nienaruszony i morfologicznie rozpoznawalny, eliminując wyzwania związane z zasadniczo odrastaniem i identyfikacją tych komórek po rozerwaniu enzymatycznym i mechanicznym16,25.
W stosunku do wcześniej opisanych metodologii eksplantacji siatkówki, to podejście kładzie nacisk na niezawodność techniczną, odtwarzalność i maksymalizację 'przyjazności dla użytkownika' podejścia w celu poprawy dostępności26,28. W osobistej komunikacji z innymi badaczami stwierdziliśmy, że wyzwania techniczne związane z obsługą żywej siatkówki stanowią główną przeszkodę dla wielu osób chcących wykorzystać eksplantaty, podczas gdy utrzymanie eksplantowanej siatkówki w hodowli było stosunkowo proste dla grup z odpowiednimi urządzeniami do hodowli komórek. W związku z tym protokół ten zawiera szereg innowacji mających na celu skrócenie krzywej uczenia się związanej z izolacją siatkówki i umożliwienie naukowcom szybszego rozpoczęcia zbierania danych eksperymentalnych. Wreszcie, chociaż położyliśmy szczególny nacisk na potencjał tego modelu eksplantatu do badania zachowania gleju siatkówki i scharakteryzowaliśmy go głównie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, inne typy i struktury komórek siatkówki są również w dużej mierze konserwatywne, a eksplantowane siatkówki pozostają podatne na szeroki zakres dodatkowych technik badawczych.

<table><tbody><tr><td>#11 Ostrza skalpela</td><td>Bard-Parker</td><td>3,71,311</td><td></td></tr><tr><td>Piper 1 ml ('Pipetman P1000')</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu</td><td>Ted Pella Inc</td><td>18,505</td><td>Rozcieńczony do 4% w celu utrwalenia</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Do utrwalania, blokowania i inkubacja przeciwciał</td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka i zestaw wkładek</td><td>Greiner bio-one</td><td>657641</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>711-545-152</td><td>Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Osioł anty-IgG IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowany</td><td>krzyżowo Invitrogen</td><td>A-21209</td><td>Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-F(ab')2 Osioł Anty-Mysi IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>715-586-150</td><td>Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>706-605-148</td><td>Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>703-606-155</td><td>Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>Kleszcze kątowe ('5/45')</td><td>FST / Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Brn3a (mysz)</td><td>Chemicon</td><td>MAB1585</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD206 (szczur)</td><td>Biorad</td><td>MCA2235</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFAP (kurczak)</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anty-Iba1 przeciwciało (królik)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>019-19741</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Tmem119 (świnka morska)</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>400 004</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>B-27, 50x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze ("Extra Fine Graefe)</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Użyj 1% w/v do blokowania i inkubacji przeciwciał</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów (0,2 i mikro; m aMembrana PES, filtr butelkowy 150 ml)&nbsp;</td><td>Fisherscientific</td><td>FB12566508</td><td></td></tr><tr><td>Cienki pędzel, rozmiar 3/0</td><td>Princeton Art & Brush Co.</td><td>06435-1030</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki laboratoryjne (chusteczki Kim)&nbsp;</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>N-2, 100x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>12349015</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td>Stosować w stężeniu 10% do blokowania i inkubacji przeciwciał</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1000 i mikro; L</td><td>TipOne</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe ('Cohan-Vannas')</td><td>FST</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda ("Dnase, bez rnazy)</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Sterylnie filtrowane PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste ("mini")</td> <td>FST / Dumont</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>Pipet transferowy, 5,8 ml</td><td>fisherscientific</td><td>13-711-9AMMD</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A16046. Stosować AP</td><td>w stężeniu 0,5% do blokowania i inkubacji przeciwciał</td></tr></tbody></table>

model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

An Ex Vivo Explant Model for Studying Glial Interactions in the Mouse Retina

Rola gleju w jaskrze jest coraz bardziej ważnym tematem badawczym, ale wiele pozostaje niewiadomych na temat tego, jak populacje tych komórek podporowych - mianowicie astrocyty i mikroglej - wpływają na przeżycie komórek zwojowych siatkówki. Podczas gdy modele in vivo i in vitro zapewniają pewien stopień wglądu, oba podejścia mają istotne ograniczenia, takie jak wpływ obwodowej odpowiedzi immunologicznej w pierwszym przypadku i zmiany funkcji fizjologicznych wywołane izolacją i hodowlą komórek w przypadku drugiego. Aby zminimalizować te czynniki zakłócające, opracowaliśmy system eksplantacji siatkówki ex vivo, w którym astrocyty, mikroglej i inne typy komórek siatkówki mogą być utrzymywane in situ przez okres co najmniej 3 dni, umożliwiając ukierunkowane badania z większą przepustowością niż jest to zwykle możliwe w przypadku modeli in vivo. Co najważniejsze, podejście to jest wysoce podatne na metodologie, które byłyby trudne lub niewykonalne w przypadku żywego zwierzęcia, a jednocześnie pozostaje zgodne z powszechnymi dalszymi testami nienaruszonej tkanki nerwowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół odpowiedni do izolacji i hodowli nienaruszonych eksplantatów siatkówki wraz z reprezentatywnymi wynikami mikroskopii immunofluorescencyjnej dokumentującymi zmiany zachodzące przez komórki glejowe i zwojowe siatkówki w siatkówce ex vivo.

W skali makroskopowej wyeksplantowane siatkówki pozostają w zasadzie niezmienione zarówno w 1., jak i 3. dniu, choć w tym drugim terminie stają się stosunkowo kruche, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nimi przed fiksacją lub innymi końcowymi etapami eksperymentu. Siatkówki powinny być stosunkowo płaskie, bez zagięć (które mogą prowadzić do miejscowych zaburzeń dyfuzji tlenu i składników odżywczych) i powinny być zawieszone w medium między powierzchnią styku powietrze-ciecz a wkładem do hodowli komórkowej. Do 3. dnia...

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

The role of glia in glaucoma is an increasingly prominent research topic, but much remains unknown about how populations of these support cells - namely ...

Chcemy zrozumieć zapalenie nerwów w jaskrze, główną przyczynę nieodwracalnej ślepoty na całym świecie. W szczególności badamy, w jaki sposób komórki podporowe glejowe w siatkówce wpływają na utratę neuronów podczas postępu choroby.Uważa się, że glej, takie jak astrocyty i mikroglej, wpływają na postęp jaskry, ale wiele narzędzi używanych do badania funkcji neuronów w żywych modelach zwierzęcych nie jest dostosowanych do tych komórek. Eksplantaty siatkówki są używane do badania zapalenia nerwów i funkcji gleju, ale krzywa uczenia się jest stroma. Nasz protokół sprawia, że jest on bardziej przystępny i miejmy nadzieję, że umożliwi szersze zastosowanie tej techniki.W porównaniu z tradycyjną hodowlą komórkową in vitro, nasze podejście oparte na eksplantatach lepiej chroni naturalne środowisko komórek w wewnętrznej siatkówce, umożliwiając dokładniejsze badanie ich funkcji fizjologicznych.[Narrator] Aby rozpocząć, umieść wyekstrahowane oko myszy w naczyniu separacyjnym wypełnionym sterylnym PBS o temperaturze pokojowej. Zidentyfikuj odpowiedni punkt trzymania i chwyć go pod kątem kleszczykami, a następnie delikatnie umieść oko na zanurzonej chusteczce laboratoryjnej, upewniając się, że oś przednio-tylna od rogówki do nerwu wzrokowego jest ustawiona poziomo. Utrzymując mocne trzymanie za pomocą kleszczy pod kątem, użyj końcówki skalpela numer 11, aby wykonać nacięcie równoległe i około 0,5 milimetra z tyłu do rąbka, w którym rogówka przechodzi w twardówkę. Włóż jedno ostrze nożyczek sprężynowych do wnętrza kuli i przetnij obwodowo wokół oka, zmieniając w razie potrzeby położenie za pomocą kleszczy. Po wykonaniu cięcia okołokończynowego usuń przedni odcinek i soczewkę za pomocą kleszczy. Jeśli pozostanie długi kawałek nerwu wzrokowego, przytnij go do długości od jednego do dwóch milimetrów za pomocą cienkich nożyczek. Następnie obróć muszlę oczną tak, aby była skierowana do góry, aby umożliwić kontrolę wzrokową i ułatwić usuwanie ciała szklistego. Kontynuuj używanie kleszczyków pod kątem, aby unieruchomić muszlę oczną i sprawdź siatkówkę pod kątem widocznych uszkodzeń oraz zbadaj komorę ciała szklistego pod kątem pigmentowych resztek komórek z nabłonka barwnikowego siatkówki lub naczyniówki. Za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej przepłukać komorę szklistą PBS, trzymając końcówkę pipety zanurzoną, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Następnie za pomocą cienkiego pędzla do akwareli delikatnie usuń większe zanieczyszczenia, jednocześnie minimalizując kontakt z siatkówką. W przypadku uporczywych zanieczyszczeń należy ostrożnie używać kleszczyków z cienką końcówką, unikając bezpośredniego kontaktu metalu z siatkówką. Po usunięciu widocznych zanieczyszczeń przepłucz komorę ciała szklistego PBS z pipety transferowej trzy do pięciu razy i użyj cienkiej szczoteczki, aby sondować w pobliżu obwodu w poszukiwaniu resztek elementów ciała rzęskowego, wykrywając ciało szkliste przez opór włókien szczoteczki. Jeśli pozostaną kieszenie ciała szklistego, wymiataj szczotką na zewnątrz w kierunku obwodu, utrzymując włókna pod płytkim kątem, aby zapobiec uszkodzeniu siatkówki. Trzymaj parę kleszczyków w pozycji zamkniętej tak, aby końcówki się stykały i delikatnie włóż je między siatkówkę a naczyniówkę, wykorzystując wszelkie naturalne szczeliny powstałe podczas przenoszenia. Użyj płaskich ramion kleszczy, aby stopniowo powiększać przestrzeń między siatkówką a naczyniówką, aż do uzyskania pełnej separacji. Kontynuuj stabilizację próbki za pomocą jednej pary kleszczy, używając drugiej pary, aby delikatnie pociągnąć muszlę oczną, w tym twardówkę i naczyniówkę, w dół. Jeśli siatkówka schodzi wraz z muszlą oczną, użyj kleszczyków, aby delikatnie sondować i odłączyć wszelkie pozostałe punkty połączenia, omijając głowę nerwu wzrokowego. Następnie, gdy siatkówka jest nadal zakotwiczona w głowie nerwu wzrokowego, kontynuuj stabilne trzymanie tkanki i użyj drugiej pary kleszczy, aby zwinąć muszlę oczną poniżej głowy nerwu wzrokowego. Sprawdź, czy obwód siatkówki nie jest pofałdowany z powodu zalegającego ciała szklistego, szczególnie w miejscach, w których pozostaje ciało rzęskowe. W razie potrzeby przepłukać komorę PBS za pomocą pipety transferowej i za pomocą szczoteczki delikatnie rozwinąć fałdowaną siatkówkę i usunąć nadmiar ciała szklistego. Po odsłonięciu siatkówki z obu stron użyj nożyczek sprężynowych, aby wykonać serię nacięć odciążających pod kątem około 90 stopni od obwodu siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego. Trzymając zanurzoną tkankę, użyj kleszczyków, aby bocznie odciągnąć chusteczkę laboratoryjną od próbki i wyjmij ją z naczynia bez dotykania siatkówki. Trzymając siatkówkę na miejscu, użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć nerw wzrokowy tuż pod siatkówką. Następnie ostrożnie podnieś i wyjmij pozostałą tkankę muszli ocznej z naczynia. Teraz napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego PBS i za pomocą kleszczy umieść kwadrat filtra na dole szorstką, matową stroną skierowaną do góry, unikając zagnieceń. Następnie, za pomocą pipety transferowej, delikatnie odessać siatkówkę i przenieść ją na szalkę Petriego. Użyj szczoteczki, aby ustawić siatkówkę tak, aby wewnętrzna powierzchnia była skierowana do góry i umieścić ją bezpośrednio nad kwadratem filtra. Powoli zasysaj PBS, aby opuścić siatkówkę na filtrze. Gdy siatkówka zostanie osadzona na filtrze, użyj szczoteczki, aby delikatnie rozwinąć wszelkie fałdy obwodowe. Dostosuj poziom PBS, aby zrównoważyć stabilność siatkówki i nawilżenie, umożliwiając płynny ruch szczoteczki bez wysuszania tkanki. Teraz użyj pipety transferowej, aby ociekać PBS z około jednego centymetra powyżej, aby spłukać powierzchnię i ponownie sprawdzić siatkówkę pod kątem zanieczyszczeń. Zamknij pokrywę 35-milimetrowej naczynia i przenieś ją do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umieść zamknięte naczynie w komorze bezpieczeństwa biologicznego, nie kontaktując się z żadnymi wewnętrznymi powierzchniami lub sprzętem. Wysterylizuj lub wymień rękawice podczas przechodzenia do pracy aseptycznej i przenieś sześciodołkową płytkę wstępnie załadowaną pożywką eksplantacyjną z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. W szafce zdejmij pokrywę 35-milimetrowej czaszy i użyj kątowych kleszczyków, aby podnieść kwadrat filtra bez dotykania siatkówki. Następnie otwórz płytkę sześciodołkową i delikatnie opuść filtr na środek wkładu w jednym dołku, powoli zanurzając go w pożywce. Gdy siatkówka oddzieli się od filtra, powoli odsuń filtr na bok i wyjmij go ze studni za pomocą kątowych kleszczyków. Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zassać 500 mikrolitrów pożywki z wkładki, zatrzymując siatkówkę między wkładką a powierzchnią powietrzno-cieczową. Na koniec załóż pokrywkę na płytkę sześciodołkową i włóż ją z powrotem do inkubatora, upewniając się, że siatkówka pozostaje wyśrodkowana w studzience. Aby zbadać wielkoskalowe zmiany w gleju siatkówki, trzydniowe eksplantowane siatkówki porównano z pozorowanymi eksplantatami utrwalonymi natychmiast po izolacji, zamiast być hodowanym. Mikroglej w pozorowanych siatkówkach wykazywał regularny, nienakładający się wzorzec rozmieszczenia, podczas gdy w trzecim dniu organizacja eksplantowanych siatek stała się nieregularna, a komórki wyglądały na skupione, co sugeruje migrację. Astrocyty siatkówki w pozorowanych siatkówkach wykazywały ścisłe wyrównanie z naczynieniem, które znacznie zmniejszyło się po trzech dniach in vitro. Ekspresja GFAP w komórkach Muellera była słaba lub nieobecna w pozorowanych siatkówkach, ale stała się wyraźnie widoczna w trzecim dniu in vitro, szczególnie w pobliżu krawędzi tkanki. Po jednym dniu in vitro mikroglej wykazywał retrakcję procesu i wczesne oznaki aktywacji, które rozwinęły się do zwartej morfologii ameboidalnej w trzecim dniu. Po 24 godzinach gęstość komórek zwojowych siatkówki oznaczona ilościowo za pomocą Brn3a wykazała niewielki, ale wyraźny spadek eksplantatów hodowlanych w porównaniu z pozorowanymi. TMEM119, homeostatyczny marker mikrogleju, wykazywał wysoką ekspresję w pozornych siatkówkach, ale był prawie niewykrywalny po trzech dniach in vitro. Ekspresja CD206, oznaczająca hialocyty, pozostała stabilna po trzech dniach hodowli in vitro. Barwienie GFAP ujawniło reaktywność astrocytów i komórek Muellera wokół miejsc urazów mechanicznych odniesionych podczas sekcji i przenoszenia.

an-ex-vivo-explant-model-for-studying-glial-interactions-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Niniejszy artykuł wideo demonstruje sposób tworzenia organotypowych kultur całej siatkówki oraz procedurę cytospinową służącą do analizy efektów indukowanych egzogennie. Organotypowe kultury całej siatkówki odwzorowują warunki in vivo i znacząco ułatwiają dostęp do siatkówek myszy w manipulacjach eksperymentalnych, pozwalając jednocześnie uniknąć wad klasycznych modeli zwierzęcych u myszy.

Organotypowa hodowla całego preparatu siatkówki mysiej typu in vivo

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten film pokazuje hodowlę komórek glejowych Müllera (MG) wyizolowanych z siatkówki myszy. Siatkówki są dysocjowane w zawiesinę jednokomórkową za pomocą enzymów trawiennych. Komórki są następnie hodowane w pożywce z czynnikiem wzrostu, który sprzyja proliferacji komórek MG i śmiertelności komórek neuronalnych. Martwe komórki neuronalne są usuwane podczas pasażowania, a komórki MG są hodowane w celu dalszej analizy.

Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Protokół opisuje organotypowe eksplantaty myszy neuroretina, hodowana razem z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE), w pożywce zdefiniowanej przez R16, wolna od surowicy i antybiotyków. Metoda ta jest stosunkowo prosta do wykonania, tańsza i bardziej czasochłonna w porównaniu z eksperymentami in vivo i może być dostosowana do wielu zastosowań eksperymentalnych.

Długotrwała, pozbawiona surowicy hodowla organtypowych eksplantatów siatkówki myszy z nienaruszonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj protokół izolacji siatkówki myszy do badań eksplantatowych glialnych interakcji w kontekście neurozapalenia jaskry. Ta metoda zachowuje naturalne środowisko komórek siatkówki, umożliwiając dokładniejszą analizę fizjologicznych funkcji komórek glejowych i ich wpływu na przeżycie neuronów.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Przeglądaj więcej filmów