Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Opracowujemy nowe typy sond do hybrydyzacji fluorescencyjnej do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji. Ostatnio narzędzia do analizy hybrydyzacji zostały rozszerzone o testy wykorzystujące systemy CRISPR-Cas. Obecnie najnowocześniejsze sondy hybrydyzacyjne, takie jak TaqMan, oraz sondy z nadajnikami molekularnymi, są najczęściej wykorzystywane do analizy celów kwasów nukleinowych.

Dokładne wykrywanie substytucji pojedynczych nukleotydów i celów kwasów nukleinowych jest nadal praktycznie wyzwaniem. Nasz protokół zapewnia wymagany poziom aktywności ogniw, zapewniając jednocześnie odczyt sygnału fluorescencyjnego bez znaczników. Na początek zaprojektuj sekwencje dwóch niezmodyfikowanych nici oligonukleotydowych DNA tworzących SLAS.

Użyj fragmentu zawierającego nukleotydy dla 6 do 39 DAP-10-42. Przekształć łodygę 1 składającą się z nukleotydów od 1 do 8 i od 36 do 42 w łodygę 1, usuwając wybrzuszoną tyminę w pozycji 5, skracając łodygę do czterech par zasad i dodając końcową parę zasad cytozyna-guanina. Uwzględnij nukleotydy od 9 do 29 w jednej nici SLAS i nukleotydy od 30 do 35 w drugiej.

Rozszerz sekwencję trzech pierwszych końcówek fragmentu za pomocą nukleotydów od 9 do 29, dodając deoksy GGTCAT. Następnie rozszerz sekwencję pięciu głównych końcówek fragmentu od 30 do 35 za pomocą deoksy TGACC, aby utworzyć trzon 2 z sześcioma parami zasad. Teraz rozszerz łodygę 1 na obu niciach za pomocą łączników deoxy TT i sekwencji DNA komplementarnych do celu kwasu nukleinowego.

W ten sposób uzyskuje się sekwencje nici SLAS-U i SLAS-S tworzących sondę. Spraw, aby SLAS-S był komplementarny dla regionu nukleotydowego od 7 do 10. Obejmuje to miejsce substytucji pojedynczego nukleotydu.

Następnie upewnij się, że docelowe ramię wiążące SLAS-U jest komplementarne z 15 do 25 fragmentami nukleotydów sąsiadującymi z regionem SLAS-S. Oceń temperatury topnienia docelowych dupleksów wiążących za pomocą serwera WWW UNAFold. Kliknij zakładkę INAMelt.

Przejdź do Aplikacje i wybierz Hybrydyzacja topnienia w dwóch stanach. Wprowadź sekwencje interakcji w kolejności od pięciu do trzech pierwszych w lewym i prawym polu. Następnie dostosuj temperaturę testu do 22 stopni Celsjusza i wprowadź stężenia kationów jednowartościowych i dwuwartościowych odpowiednio do jonów 20 milimolowych i 25 milimolowych.

Dostosuj stężenia oddziałujących sekwencji w odpowiednim polu. Naciśnij przycisk Prześlij i przejrzyj wartości zmiany energii Gibbsa, entalpY, entropii i temperatury topnienia dla odpowiednich dupleksów. Upewnij się, że temperatury topnienia dla idealnie dopasowanych celów i ramion wiążących cel SLAS-S i SLAS-U są wyższe od temperatury testu, 22 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że dupleks między SLAS-S a niedopasowanym celem daje temperatury topnienia poniżej temperatury testu, aby zachować specyficzność. W razie potrzeby dostosuj długości ramion wiążących tarczę, aby spełnić te warunki. Uzyskaj sfinalizowane nici oligonukleotydowe SLAS-U i SLAS-S od komercyjnego dostawcy DNA lub zsyntetyzuj je we własnym zakresie za pomocą zautomatyzowanego syntezatora DNA.

Przygotować roztwory podstawowe Auraminy O, SLAS-S, SLAS-U i bufor do oznaczania. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą wszystkie składniki oznaczania z wyjątkiem celu. Dodaj wodę wolną od nukleaz do ostatniej objętości mieszanki wzorcowej o wymiarach pięć na szóste.

Następnie zwiruj i odkręć mieszankę główną. Dozować 50 mikrolitrów do każdej probówki z próbką. Następnie oznacz jedną próbkę jako ślepą próbę bez celu, a drugą jako kontrolę pozytywną.

Dodać 10 mikrolitrów próbki zawierającej tarczę do probówki zawierającej mieszankę główną, aby uzyskać próbkę o pojemności 60 mikrolitrów. Do ślepej próby dodaj 10 mikrolitrów wody bez nukleaz. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów syntetycznego oligonukleotydu DNA zawierającego sekwencję docelową do probówki kontroli pozytywnej.

Krótko wymieszać wszystkie próbki w wirówce za pomocą mikrowirówki. Następnie inkubuj probówki w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 10 do 60 minut. Zmierz fluorescencję przy 540 nanometrach po wzbudzeniu przy 475 nanometrach za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego.

SLAS został dostosowany do określonego fragmentu genu NANOGP8. Cel M był w pełni komplementarny z nicią SLAS-S, podczas gdy docelowy MM miał pozycję nukleotydu cytozyny 1, 423, wprowadzając niezgodność z SLAS-S. Po dodaniu w pełni uzupełniającego celu M, fluorescencja stale rosła i ustabilizowała się po 45 do 50 minutach.

Jednak wyraźny sygnał był wykrywalny w ciągu 10 minut, a stosunek sygnału do ślepej próby wynosił 10 SLAS wykazał wysoki sygnał fluorescencji dla w pełni dopasowanych celów, ale nie dla niedopasowanych celów lub ślepych prób. Moc fluorescencji wzrastała liniowo przy stężeniu docelowym do 500 nanomolowych, co umożliwiło ilościowe określenie i określenie granic wykrywalności. Próbki amplifikowane PCR wykazywały różne poziomy sygnału, przy czym tylko próbka 2 przekraczała wartość progu fluorescencji 2.

Na podstawie krzywej kalibracyjnej stężenie NANOGP8 amplikonu w próbce 2 oszacowano na 124+lub 13 nanomolowców. Detekcja fluorescencji sygnału SLAS była spójna zarówno w spektrofotometrze stacjonarnym, jak i przenośnym fluorometrze. Stosunek sygnału do ślepej próby powyżej 20 zaobserwowano również wizualnie przy użyciu światła UV.