22 sierpnia 2025
Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.
Teraz w naszym protokole prezentujemy obrazowanie multimodalne z wykorzystaniem konfokalnej mikrospektroskopii Ramana i tomograficznej mikroskopii fazowej do szybkiego i bezstronnego fenotypowania morfochemicznego ludzkich komórek raka piersi w ich naturalnym środowisku fizjologicznym. Połączenie mikrospektroskopii Ramanowskiej i tomografii fazowej umożliwia obrazowanie bez znaczników w warunkach fizjologicznych, dostarczając informacji biochemicznych i morfologicznych o komórkach oraz rozwiązując problem ograniczeń konwencjonalnych metod perturbacyjnych, takich jak znakowanie fluorescencyjne lub utrwalanie chemiczne. Nasze wyniki wskazują na duży potencjał zastosowania podejścia multimodalnego w fenotypowaniu morfochemicznym komórek raka piersi. Co więcej, jego wszechstronność, powtarzalność i nieinwazyjność sprawiły, że jest to obiecujące narzędzie do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych, od podstawowych badań biologii komórki po diagnostykę.
Naszym celem jest stworzenie atlasu biomarkerów optycznych do nieinwazyjnej kontroli jakości embrionów, wykrywania starzenia się komórek i badań przesiewowych leków w modelach organoidowych, aby przyspieszyć medycynę regeneracyjną i badania nad chorobami.
[Instruktor] Aby rozpocząć, umieść próbkę ludzkiej komórki raka piersi MDA-MB-231 w inkubatorze na etapie. Dodaj wodę do celu zanurzenia w wodzie. Włącz automatyczny podajnik zanurzeniowy w wodzie, aby dostarczyć wodę do soczewki obiektywu. Regularnie sprawdzaj poziom wody, aby uniknąć parowania i zapewnić spójne warunki obrazowania podczas wszystkich pomiarów. Teraz włącz laser pompy i dostosuj jego moc wyjściową, aby uzyskać moc lasera 75 miliwatów na płaszczyźnie próbki. Otwórz oprogramowanie sterujące mikroskopem Micro-Manager. W ustawieniach konfiguracyjnych wybierz BF i kliknij na żywo po lewej stronie okna oprogramowania. Wybierz żądaną pojedynczą komórkę, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć wizualizację w jasnym polu. Otwórz oprogramowanie sterujące kamerą CCD. W ustawieniach eksperymentu ustaw czas ekspozycji na 1.5 sekundy. Kliknij przycisk Uruchom na pasku narzędzi eksperymentu i włącz wiązkę laserową. Następnie dostosuj pozycję Z, aby zmaksymalizować liczbę sygnałów w obszarze odcisku palca od 600 do 1,800 centymetrów odwrotnych, a następnie wyłącz laser. Kliknij przycisk Zatrzymaj na pasku narzędzi eksperymentu i zamknij oprogramowanie. Rozpocznij proces akwizycji danych za pomocą skryptu MATLAB, który automatycznie zarządza kanałami Ramana w pomiarach wielowymiarowych i zapisuje dane. Ustaw pole widzenia na 50 na 50 mikrometrów kwadratowych z rozdzielczością 40 na 40 pikseli, przy czym każdy piksel zajmuje 1,25 na 1,25 mikrometra kwadratowego. Ustaw czas ekspozycji dla każdego widma Ramana na 1,5 sekundy i uruchom skrypt MATLAB. W celu późniejszego przetwarzania map hiperspektralnych Ramana uruchom narzędzie internetowe RamApp. Zaimportuj dane hiperspektralne klikając na nowe w zakładce moje analizy i wgraj plik .mat zawierający zmienne danych przestrzennych i spektralnych wraz ze zmienną osi X. Aby obciąć spektrum, w menu przycinania i obracania wybierz opcję przycinanie spektralne. Zdefiniuj dolną i górną granicę obszaru przesunięcia Ramana odpowiednio jako 600 i 1,800 centymetrów odwrotnych. Aby skorygować promieniowanie kosmiczne, przejdź do sekcji Odszumianie, kliknij despike, wybierz Z-score jako metodę i ustaw wartość threshold (Próg na osiem). Zaznacz opcje Użyj pierwszej różnicy i Popraw spajki, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby zastosować poprawkę. Aby usunąć szum z map, kliknij w Wygładź mapę, wybierz filtr mediany, ustaw rozmiar kwadratu na trzy piksele, a następnie kliknij w uruchom. Aby wygładzić spektrum każdego piksela, wybierz filtr Savistky-Golay. Ustaw długość okna filtru na siedem i kolejność wielomianów na dwa, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby odjąć średni sygnał tła, otwórz proces usuwania podłoża optycznego i kliknij przycisk Identyfikuj podłoże. Ustaw k-średnie jako metodę z dwoma klastrami. Następnie kliknij Opcje zaawansowane. Wybierz czyszczenie morfologiczne, aby usunąć małe plamy z pierwszego planu, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby usunąć średni sygnał tła, kliknij usuń substrat, a następnie wybierz średnią globalną lub średnią centralnej metody 95% wartości i kliknij uruchom. Aby skorygować fluorescencję linii bazowej, otwórz panel linii bazowej, kliknij poprawną linię bazową, wybierz adaptacyjną gładkość PLS, a następnie ustaw lambda na 5 milionów i kliknij uruchom. Aby znormalizować każdą mapę hiperspektralną Ramana, przejdź do sekcji Różne, wybierz opcję normalizuj, wybierz metodę Frobeniusa i kliknij przycisk Uruchom. Aby wygenerować obraz w sztucznych kolorach pokazujący rozkład subkomórkowy, w panelu obrazów kliknij symbol otwartego menu w obszarze Intensywny obraz, a następnie kliknij edytuj obraz. Na panelu edycji wybierz pojedyncze pasmo i zdefiniuj zakres spektralny. Teraz wybierz podwójny kolor na mapie kolorów, a następnie zdefiniuj kolor, próg intensywności i krycie przed kliknięciem potwierdź. Aby pobrać widmo pojedynczego punktu, wybierz interesujący Cię piksel, a następnie w panelu legendy widma kliknij przycisk Pobierz widmo. Na koniec, aby wyeksportować widma pierwszego planu i podłoża, przejdź do legendy spektralnej, a następnie kliknij przycisk Pobierz widmo zarówno dla sekcji pierwszego planu, jak i substratu. Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu. Umieść próbkę na stoliku translacyjnym mikroskopu, a następnie dostosuj pozycję próbki, aby wyrównać ją z soczewką obiektywu. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie do obrazowania. Kliknij ikonę mikroskopu na pasku narzędzi. Po zainicjowaniu kliknij przycisk konfiguracji, wybierz aktywną komórkę w panelu zadań i PBS jako nośnik. Następnie uzyskaj dostęp do zakładki kalibracji w panelu sterowania oprogramowania do obrazowania. Ustaw pozycje osiowe soczewek obiektywu i kondensatora, wybierając odpowiednio ostrość i powierzchnię. Teraz kliknij tryb skanowania, aby ręcznie wyregulować soczewki i upewnić się, że wzory oświetlenia są wyśrodkowane i prawie statyczne. Wybierz tryb normalny, a następnie dostosuj etap translacji, aby umieścić komórkę w polu widzenia i skupić się na próbce. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować region bez komórek. Wybierz opcję Kalibruj, aby przechwycić wiele hologramów 2D pod różnymi kątami oświetlenia. Dostosuj etap translacji, aby wyśrodkować komórkę, a następnie przejdź do zakładki akwizycji i wybierz migawkę 3D, aby uchwycić tomogram komórki. Aby zwizualizować tomogramy holograficzne, wybierz dane w panelu nawigacji po danych, kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Otwórz. W panelu menedżera danych kliknij na tomogram RI. W panelu wizualizacji woluminu wybierz opcję RI i narysuj cztery prostokątne kolorowe pola na płótnie RI. Ustaw minimalne i maksymalne wartości zakresu wystąpień zarezerwowanych dla każdego pola koloru, a następnie skojarz krycie i kolor z każdym polem. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać zdefiniowane zakresy wystąpień zarezerwowanych i pola kolorów. Aby uzyskać ilościowe deskryptory morfologii komórki, wykorzystaj interfejs analizy. Wybierz opcję ręcznie w panelu segmentacji, a następnie ustaw 1,3450 jako próg wystąpień zarezerwowanych i kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać obliczone indeksy morfologiczne. Mapowanie spektralne Ramana ujawniło przestrzenny rozkład cytoplazmy, jądra, fenyloalaniny i lipidów w poszczególnych komórkach MDA-MB-231. Wyraźne piki widmowe Ramana odpowiadające cytoplazmie, jądru, fenyloalaninie i lipidom zostały potwierdzone w obszarze odcisków palców między 600 a 1800 odwrotnymi centymetrami. Mapy cieplne współczynnika załamania światła pojedynczych komórek ujawniły wewnętrzny rozkład składników subkomórkowych w osiowej płaszczyźnie XY, strzałkowej płaszczyźnie YZ i koronalnej płaszczyźnie XZ. Rekonstrukcja tomograficzna 3D pozwoliła zidentyfikować obszary o wolumetrycznym współczynniku załamania światła odpowiadające wewnętrznym strukturom nośnym. Ilościowe pomiary morfologiczne pojedynczej komórki MDA-MB-231 wykazały różne deskryptory morfologii komórki, o całkowitej objętości 4024,189 mikrometrów sześciennych i powierzchni 2383,707 mikrometrów kwadratowych, ze średnim współczynnikiem załamania światła 1,356.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy protokół przedstawia multimodalne podejście obrazowe z wykorzystaniem konfokalnej mikrospektroskopii Ramana oraz tomograficznej mikroskopii fazowej do bezznacznikowego i nieinwazyjnego fenotypowania komórek raka piersi u ludzi. Pozwala on na szybką i bezstronną analizę morfochemiczną, dostarczając informacji o charakterystyce biochemicznej i morfologicznej komórek.
Szybkie, bezznakownikowe fenotypowanie żywych komórek raka piersi z wykorzystaniem multimodalnej konfokalnej mikrospektroskopii Ramanowskiej oraz tomograficznej mikroskopii fazowej odpowiada na krytyczną potrzebę nieperturbacyjnej, ilościowej analizy komórkowej w fazie wczesnego odkrywania i badań translacyjnych. System ten umożliwia obiektywne profilowanie morfochemiczne, wspierając pewność predykcyjną i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w kluczowych punktach zwrotnych w badaniach i rozwoju (R&D) w onkologii. Podejście to usprawnia proces podejmowania decyzji dotyczących portfolio, dostarczając wysokotreściowych i powtarzalnych danych z systemów istotnych fizjologicznie.
Ta multimodalna platforma obrazowania integruje się z continuum od etapu odkrywania do fazy przedklinicznej, łącząc wczesne przesiewy fenotypowe z badaniami translacyjnymi w onkologii.