Name: In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj metodę biotynylacji zbliżeniowej in vivo w Pantofelku czworobocznym przy użyciu ligazy turboID. Technika ta umożliwia selektywne wzbogacanie białek biotynylowanych, wspierając badania interakcji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu DigiK Uniwersytetu w Bernie i grantu Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki, 229074 przyznany licencjatowi licencjackiemu. oraz grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki 214853 przyznany M.N.

1. Metody ogólne
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w, odczynniki i inne materiały wymienione w Tabeli 1.</li>
	<li>Hoduj monoklonalne linie pantofelków , jak opisano wcześniej17. Krótko mówiąc, przenieś jedną komórkę do nowej studzienki depresyjnej, która zawiera bakteriizowane lekkie podłoże (0,8 μg / ml β-sitosterolu), tak aby gęstość komórek pozostała niższa niż 500 komórek / ml, aby zapobiec przedwczesnemu zainicjowaniu cyklu mejotycznego. Po 50 podziałach komórkowych przenieś komórki do bogatej w bakterie pożywki (z 0,8 μg/ml β-sitosterolu) i pozostaw do momentu, aż wszystkie bakterie zostaną zużyte, indukując w ten sposób rozmnażanie płciowe (autogamię)18. UWAGA: Po zakończeniu cyklu rozmnażania płciowego komórki pozostaną w niedzielącym się stanie postautogamicznym, dopóki nie zostanie dostarczone nowe źródło składników odżywczych.</li>
	<li>Konstruowanie białek fuzyjnych docelowych genów za pomocą wektora zawierającego zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencję 3x HA turboID z miejscami cięcia enzymu restrykcyjnego w górę.<ol>
		<li>Przeprowadzić amplifikację PCR docelowego genu i jego regionu promotorowego z genomowego DNA, używając starterów zaprojektowanych z nawisami, które kodują odpowiednie miejsca restrykcyjne.</li>
		<li>Wprowadzić produkt za pomocą standardowego trawienia restrykcyjnego do kompatybilnych miejsc cięcia w ramie19 przed regionami kodowania turboID.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonuj, weryfikuj i amplifikuj skonstruowane plazmidowe DNA w E. coli DH5α. Wyizoluj plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu i zlinearyzuj 100 μg plazmidowego DNA przez trawienie restrykcyjne.</li>
	<li>Oczyść za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie przefiltruj przez filtr odśrodkowy12. Przeprowadzić wytrącanie etanolu i rozpuścić osad DNA w wodzie, aby uzyskać stężenie 5 mg/ml. UWAGA: DNA można wprowadzić do jąder somatycznych komórek pantofelka za pomocą następującej procedury mikroiniekcji.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja do jądra somatycznego (MAC)
<ol>
	<li>Przenieść komórkę z hodowli postautogamicznej uzyskanej w kroku 1.2 na świeże szkiełko depresyjne z bakteriizowaną pożywką świetlną o stężeniu 0,8 μg/ml β-sitosterolu. Inkubować w temperaturze 27 °C przez dwa dni przed wstrzyknięciem w celu odzyskania komórek.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego przenieś komórki z odzyskanej kultury na świeżo przygotowany szkiełko depresyjne wypełnione pożywką myjącą.</li>
	<li>Gdy komórki znajdują się w podłożu myjącym, dodać 20 μl ddH2O na szkiełko podstawowe i nałożyć je szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Dodaj 200 μl oleju mineralnego na wierzch szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Następnie przenieś poszczególne umyte komórki w postaci kropelek pod olej mineralny, używając jak najmniejszej objętości płynu. Umieść do 20 pęcherzyków zawierających pojedynczą komórkę na szkiełku, a następnie umieść przygotowane szkiełko na cokole mikroskopu iniekcyjnego.</li>
	<li>Zamocuj igłę aspiracyjną i przesuń ją na miejsce, a następnie uruchom ramię robota i maszynę do wstrzykiwania.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipet z mikroładowarką dodać 2-3 μl roztworu DNA przygotowanego w kroku 1.5 do igły iniekcyjnej. Przymocuj igłę do ramienia robota i przesuń ją na miejsce, a następnie podłącz ją do zaworu ciśnieniowego wtryskarki.</li>
	<li>Za pomocą ramienia robota umieść igłę iniekcyjną w pustej kropli wody na szkiełku. Następnie naciśnij przycisk Wyczyść , aby usunąć pozostałe powietrze z igły do wstrzykiwań, aż do momentu zaobserwowania przepływu DNA.</li>
	<li>Przejdź do kropli zawierającej komórkę, a następnie opuść igłę do aspiracji. Delikatnie usuń płyn (wodę) z tej kropli, aż komórka zostanie unieruchomiona.</li>
	<li>Podnieść igłę do aspiracji i opuścić igłę do wstrzykiwań, a następnie przełączyć na większe powiększenie.</li>
	<li>Upewnij się, że jądro somatyczne (MAC) jest teraz widoczne jako ciemniejszy obszar pozbawiony wakuoli pokarmowych (patrz ryc. 1c), w który należy wprowadzić igłę do wstrzykiwań.</li>
	<li>Dążyć do całkowitego wniknięcia w MAC za pomocą igły do wstrzykiwań i powoli cofać igłę przez kilka sekund. UWAGA: Gdy igła znajduje się wewnątrz MAC, DNA będzie przepływać w MAC ze względu na stałe ciśnienie powietrza stosowane przez maszynę do wstrzykiwania. Rozlana wakuola składająca się z wstrzykniętego DNA może stać się widoczna w granicach MAC. UWAGA: Możliwe jest wielokrotne wstrzykiwanie tej samej komórki, aby zapewnić udane wstrzyknięcie.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwania komórek należy opuścić igłę do aspiracji zawierającą wodę odessaną w kroku 2.9. Odwróć przepływ, aby zwrócić wystarczającą ilość wody do kropli, aż komórka zacznie się ponownie poruszać.</li>
	<li>Kontynuuj, aż wszystkie kropelki zawierające komórkę zostaną przetworzone.</li>
	<li>Odzyskaj każdą wstrzykniętą komórkę, zbierając kropelki ze szkiełka i przenosząc każdą z nich do oddzielnej studzienki wypełnionej bakterizowanym lekkim podłożem o stężeniu 0,8 μg/ml β-sitosterolu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 27 °C przez noc, przenieść pojedynczą komórkę z każdej studzienki do nowej studzienki i utrzymywać pierwotną studzienkę w temperaturze 18 °C jako zapasową.</li>
	<li>Hodować przeniesione komórki przez noc w temperaturze 27 °C przez 1 dzień, a następnie przenieść 5 komórek z każdej studzienki monoklonalnej do probówki PCR. Użyj starterów specyficznych dla konstruktu do amplifikacji, aby zweryfikować obecność wstrzykniętego DNA w komórkach.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne w celu weryfikacji prawidłowej lokalizacji białka i funkcji ligazy biotyny
<ol>
	<li>Hoduj wybrane klony PCR-dodatnie w 20 ml bakteriizowanej pożywki z 0,8 μg/ml β-sitosterolu.</li>
	<li>Gdy podłoże stanie się mniej mętne, należy pobrać próbkę o objętości 50 μl z kultury. Dodać 1 μl roztworu DAPI (0,1 mg/ml) i 1 μl EDTA (0,5 mM) do barwienia DNA w celu sprawdzenia inicjacji autogamii. UWAGA: Autogamia zwykle zaczyna się od gęstości komórek 2,000 komórek/ml.</li>
	<li>Jeżeli pożądana jest biotynylacja, należy uzupełnić pożywkę hodowlaną biotyną do końcowego stężenia 500 μM przez co najmniej 1 godzinę przed pobraniem komórek.</li>
	<li>Zebrać komórki w odpowiednim stadium rozwojowym za pomocą wirówki do pomiaru oleju wyposażonej w probówki w kształcie gruszki o sile 280 x g przez 2 minuty. Odrzucić pożywkę hodowlaną i dodać PBS do probówek, następnie ponownie odwirować i usunąć PBS.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w PBS i przenieść do przezroczystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przygotować 3,7% rozcieńczenie PFA w PBS z 37% roztworu podstawowego.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml 3,7% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, aż utworzy się widoczny osad. Wyrzuć roztwór PFA do wyznaczonego specjalnego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 50 mM glicyny w PBS. Inkubować przez 5-10 minut na rotatorze rurowym.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 1 min. Usunąć supernatant i dodać 0,8 ml 1x PBS. Opcjonalnie umyj jeszcze raz za pomocą PBS. UWAGA: W tym momencie ogniwa można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, usunąć PBS i dodać 500 μl 0,5 % Triton X-100 do PBS. Inkubować przez 20 minut na rotatorze probówkowym.</li>
	<li>Wirować do momentu, aż osad stanie się widoczny (1 000 x g przez 2 minuty), usunąć roztwór Triton X-100 i ponownie zawiesić komórki w PBS.</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór BSA w PBS zgodnie z wymaganą objętością przeciwciała.</li>
	<li>Usunąć płuczkę PBS z komórek i dodać do komórek 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w 5% BSA w PBS. Dostosuj czas inkubacji do zastosowanego przeciwciała. UWAGA: Inkubacja przez 2 godziny w temperaturze pokojowej jest wystarczająca dla większości przeciwciał.</li>
	<li>Odwirować przy 600 x g, usunąć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych i przemyć komórki 500 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 5% BSA w PBS. Dostosuj czas inkubacji; Generalnie wystarczy 1 godzina w temperaturze pokojowej. Przykryj probówkę folią aluminiową, aby chronić fluorofor przed światłem.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu DAPI (0,1 mg/ml) podczas ostatnich 10 minut inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 1 minutę, usunąć roztwór barwiący i przemyć dwukrotnie PBS. Pozostaw 20 μl drugiego płukania w probówce i ponownie zawieś komórki.</li>
	<li>Zamontować 10 μl na szkiełku w celu kontroli pod mikroskopem.</li>
</ol>
4. Selektywne wzbogacanie białek biotynylowanych
<ol>
	<li>Zebrać 1 x 106 komórek we właściwym stadium rozwoju, jak opisano w ppkt 3.4.</li>
	<li>Zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy.</li>
	<li>Przenieś do homogenizatora odbijającego i zmilizuj komórki za pomocą 100 pociągnięć tłuczkiem.</li>
	<li>Przenieść lizat do dwóch probówek do mikrowirówek i odwirować przy 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zrównoważyć kulki magnetyczne pokryte streptawidyną, mieszając 20 μl (na próbkę) zawiesiny perełkowej z wirem pulsacyjnym z 1 ml buforu do lizy w probówce do mikrowirówki i inkubując przez 2 minuty.</li>
	<li>Usuń bufor do lizy z kulek za pomocą stojaka magnetycznego i ponownie zawieś w buforze do lizy.</li>
	<li>Powtórz krok 4.6.</li>
	<li>Usunąć bufor do lizy i wymieszać zrównoważone kulki z supernatantem (oczyszczonym lizatem) z kroku 4.4. UWAGA: Optymalne stężenia soli i procentowa zawartość detergentów do wiązania z kulkami mogą się różnić i muszą zostać zweryfikowane eksperymentalnie. Dodatkowo możliwa jest inkubacja osadu z 4,4 w 50 μl 2% SDS przez 10 minut w temperaturze 60 °C w celu ekstrakcji białek z frakcji nierozpuszczalnej, a następnie odwirowanie w temperaturze 21 000 x g przez 10 min. Dodaj ten ekstrakt do oczyszczonego lizatu i kulek.</li>
	<li>Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze rurowym.</li>
	<li>Krótko odwirować (<1s) probówkę, aby odzyskać całą ciecz na dno probówki, zebrać kulki na stojaku magnetycznym, a następnie zastąpić supernatant (przepływowy) buforem płuczącym 1.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut na rotatorze probówkowym, a następnie powtórzyć czynności jak w kroku 4.10 dla drugiego przemycia.</li>
	<li>Wymień bufor myjący 1 na bufor płuczący 2 na dwa dodatkowe mycia (mycie 3 i 4).</li>
	<li>Wymień bufor myjący 2 na bufor płuczący 3 na dwa mycia końcowe (mycie 5 i 6).</li>
	<li>Po usunięciu końcowego prania należy przechowywać kulki w temperaturze -20 °C przed dalszą obróbką. UWAGA: Kulki można eluować buforem Laemmli do analizy western blot i przesłać do usług spektrometrii mas w celu przygotowania peptydu na kulkach do identyfikacji białka.</li>
</ol>

<ol><li>Stefanov, B. -A., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+mechanisms+of+eukaryotic+RNA-guided+programmed+DNA+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Functions and mechanisms of eukaryotic RNA-guided programmed DNA elimination.</a> Biochem Soc Trans. 53 (2), 473-485 (2025).</li>
<li>Swart, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+and+epigenetic+control+of+programmed+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic and epigenetic control of programmed DNA deletion.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 8970-8983 (2014).</li>
<li>Witzany, G. The Roles of transposable elements in transgenerational inheritance and genome evolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStefanov%2C+B-A+%22Epigenetics+in+Biological+Communication.+Witzany%2C+G%22">Epigenetics in Biological Communication. Witzany, G</a>. , Springer Cham. 369-385 (2024).</li>
<li>Dubois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+invasion+of+the+paramecium+germline+genome+countered+by+a+domesticated+piggybac+transposase+and+the+NHEJ+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon invasion of the paramecium germline genome countered by a domesticated piggybac transposase and the NHEJ pathway.</a> Int J Evol Biol. 2012, 436196(2012).</li>
<li>Gruchota, J., Denby Wilkes, C., Arnaiz, O., Sperling, L., Nowak, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiosis-specific+Spt5+homolog+involved+in+non-coding+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A meiosis-specific Spt5 homolog involved in non-coding transcription.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4722-4732 (2017).</li>
<li>Sandoval, P. Y., Swart, E. C., Arambasic, M., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+Dicer-like+proteins+and+small+RNAs+required+for+genome+sculpting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of Dicer-like proteins and small RNAs required for genome sculpting.</a> Dev Cell. 28 (2), 174-188 (2014).</li>
<li>Furrer, D. I., Swart, E. C., Kraft, M. F., Sandoval, P. Y., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sets+of+piwi+proteins+are+involved+in+distinct+sRNA+pathways+leading+to+elimination+of+germline-specific+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Two sets of piwi proteins are involved in distinct sRNA pathways leading to elimination of germline-specific DNA.</a> Cell Rep. 20 (2), 505-520 (2017).</li>
<li>Lepère, G., Bétermier, M., Meyer, E., Duharcourt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+noncoding+transcripts+antagonize+the+targeting+of+DNA+elimination+by+scanRNAs+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal noncoding transcripts antagonize the targeting of DNA elimination by scanRNAs in Paramecium tetraurelia.</a> Genes Dev. 22 (11), 1501-1512 (2008).</li>
<li>Garnier, O., Serrano, V., Duharcourt, S., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+programming+of+developmental+genome+rearrangements+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated programming of developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia.</a> Mol Cell Biol. 24 (17), 7370-7379 (2004).</li>
<li>Khanduja, J. S., Calvo, I. A., Joh, R. I., Hill, I. T., Motamedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+noncoding+RNAs+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear noncoding RNAs and genome stability.</a> Mol Cell. 63 (1), 7-20 (2016).</li>
<li>Yao, M. -C., Chao, J. -L., Cheng, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+Tetrahymena%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in Tetrahymena.</a> Microbiol Spectr. 2 (6), (2014).</li>
<li>Nowacki, M., Zagorski-Ostoja, W., Meyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nowa1p+and+Nowa2p%3A+Novel+putative+RNA+binding+proteins+involved+in+trans-nuclear+crosstalk+in+Paramecium+tetraurelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nowa1p and Nowa2p: Novel putative RNA binding proteins involved in trans-nuclear crosstalk in Paramecium tetraurelia.</a> Curr Biol. 15 (18), 1616-1628 (2005).</li>
<li>Drews, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+piwis+with+Ago-like+functions+silence+somatic+genes+at+the+chromatin+level%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Two piwis with Ago-like functions silence somatic genes at the chromatin level.</a> RNA Biol. 18 (sup2), 757-769 (2021).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI1+complex+proteins+facilitate+developmental+genome+editing+in+Paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ISWI1 complex proteins facilitate developmental genome editing in Paramecium.</a> Genome Res. 35 (1), 93-108 (2025).</li>
<li>Bernier, S. C., Cantin, L., Salesse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+expression%2C+solubility%2C+and+purification+of+a+passenger+protein+in+fusion+with+different+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the expression, solubility, and purification of a passenger protein in fusion with different tags.</a> Protein Expr Purif. 152, 92-106 (2018).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Beisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+clonal+Paramecium+tetraurelia+cell+lines+of+controlled+age+through+daily+reisolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Maintaining clonal Paramecium tetraurelia cell lines of controlled age through daily reisolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (1), pdb.prot5361(2010).</li>
<li>Berger, J. D., Rahemtullah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+to+autogamy+in+Paramecium+blocks+mating+reactivity%3A+implications+for+regulation+of+the+sexual+pathway+and+the+breeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Commitment to autogamy in Paramecium blocks mating reactivity: implications for regulation of the sexual pathway and the breeding system.</a> Exp Cell Res. 187 (1), 126-133 (1990).</li>
<li>Stefanov, B. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+protein+thermometer+enables+precise+electrothermal+control+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded protein thermometer enables precise electrothermal control of transgene expression.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2101813(2021).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+proximity+labeling+with+enhanced+direct+identification+of+biotinylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution proximity labeling with enhanced direct identification of biotinylation sites.</a> Commun Biol. 7 (1), 554(2024).</li>
<li>Leffers, K. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+natural+and+recombinant+prion+protein+into+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Assembly of natural and recombinant prion protein into fibrils.</a> Biol Chem. 386 (6), 569-580 (2005).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Ajuh, E., Allen, S., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+release+factor+1+from+Euplotes+promotes+frameshifting+at+premature+stop+codons+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic release factor 1 from Euplotes promotes frameshifting at premature stop codons in human cells.</a> iScience. 27 (4), 109413(2024).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarker-driven+feedback+control+of+synthetic+biology+systems+for+next-generation+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomarker-driven feedback control of synthetic biology systems for next-generation personalized medicine.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 986210(2022).</li>
<li>Stefanov, B. -A., Mansouri, M., Charpin-El Hamri, G. -, Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunlight-Controllable+Biopharmaceutical+Production+for+Remote+Emergency+Supply+of+Directly+Injectable+Therapeutic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sunlight-Controllable Biopharmaceutical Production for Remote Emergency Supply of Directly Injectable Therapeutic Proteins.</a> Small. 18 (41), e2202566(2022).</li>
<li>Rzeszutek, I., Maurer-Alcalá, X. X., Nowacki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+genome+rearrangements+in+ciliates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Programmed genome rearrangements in ciliates.</a> Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4615-4629 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje technikę przyłączania ugrupowania biotyny do białek znajdujących się w pobliżu białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ze względu na silne powinowactwo streptawidyny do biotyny, pozwala to na szybkie i skuteczne wzbogacenie zmodyfikowanych białek. W połączeniu z szybką zdolnością adaptacji do różnych białek będących przedmiotem zainteresowania, przedstawiona metoda może ułatwić badania interakcji wielobiałkowych w pantofelku. Ten organizm modelowy jest dobrze przygotowany do badań nad interakcjami transpozon-gospodarz podczas rozmnażania mejotycznego3. Ponadto może zaoferować nowatorskie narzędzia molekularne do precyzyjnej edycji genomu, ponieważ wycina ponad 45 000 sekwencji podczas zaprogramowanych rearanżacji genomu. Proces ten jest koordynowany przez złożoną, wieloskładnikową maszynerię, która pozwala na precyzyjne wycinanie tych fragmentów DNA z odtwarzalnym miejscem cięcia przez każde pokolenie, kierowane przez RNA. Przedstawiona tutaj metoda oferuje dwie główne korzyści dla badania tego procesu. Upraszcza to odkrywanie przejściowych interakcji białko-białko. Dodatkowo, wektor biorczy plug-and-play pozwala na szybkie tworzenie wielu funkcjonalnych białek fuzyjnych. Ponieważ na różnych etapach procesu prawdopodobnie zaangażowanych jest wiele czynników, zdolność adaptacji pozwala na odkrycie interakcji wielu białek, które mogą być częścią maszynerii wycinającej. Co ważne, konstrukty fuzyjne są wyrażane przez promotor genu endogennego, a zatem ściśle odpowiadają natywnemu przebiegowi czasowemu ekspresji. Co więcej, zademonstrowane zastosowanie mikroiniekcji do dostarczania egzogennego materiału genetycznego do tego organizmu modelowego pozwala na generowanie jednorodnych populacji monoklonalnych. Takie populacje umożliwiają bardziej synchroniczne zainicjowanie procesu autogamii, podczas którego następuje rozwój nowego jądra somatycznego.
Chociaż zademonstrowana procedura wprowadzania konstruktów fuzyjnych turboID jest solidna, może być konieczna specyficzna optymalizacja w dalszych protokołach wzbogacania białek ze względu na mechanizm biotynylacji. Ponieważ skondensowany enzym turboID generuje reaktywne ugrupowania biotyny-AMP, które dyfundują z dala od enzymu, mogą one potencjalnie reagować z dowolną grupą nukleofilową w pobliżu. W związku z tym istotnym krokiem w tej metodologii jest identyfikacja prawdziwych partnerów interakcji na podstawie trafień tła oraz białek zlokalizowanych w ogólnym sąsiedztwie białka fuzyjnego turboID, które nie są rzeczywistymi partnerami interakcji. Aby to osiągnąć, można dostosować różne parametry, takie jak czas inkubacji z biotyną16. Co więcej, konfiguracja eksperymentalna, która obejmuje grupę kontrolną bez dodatkowej biotyny w pożywce, może wskazywać na wiązanie tła. Jak wykazano, taka grupa kontrolna będzie genetycznie identyczna z rzeczywistym eksperymentem, ale biotynylacja przez turboID jest znacznie zmniejszona ze względu na niską obfitość biotyny. Dodatkowe ważne grupy kontrolne mogą obejmować nieskondensowane białko turboID, a także grupę typu dzikiego, obie hodowane w pożywce uzupełnionej biotyną. Ponadto, mimo że silne powinowactwo streptawidyny do biotyny stanowi istotną przewagę nad ekstraktorami opartymi na przeciwciałach, różne stężenia soli i detergentów mogą mieć wpływ na czystość i skuteczność wzbogacania.
Lepsze podejścia proteomiczne mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat unikalnej maszynerii molekularnej pantofelka i potencjalnie innych orzęsków. Składniki molekularne o nowych funkcjach mogą zostać ponownie wykorzystane jako narzędzia w biologii syntetycznej, a tym samym mogą sprzyjać rozwojowi biotechnologicznemu22,23. Zmodyfikowane białka syntetyczne często składają się z kombinacji domen funkcjonalnych o nowatorskich właściwościach, które umożliwiają wcześniej niewykonalne zastosowania terapeutyczne. Modyfikowane białka mogą również znaleźć zastosowanie w procesach produkcji farmaceutycznej24. Kierowany przez RNA system wycinania genomu z pantofelka jest szczególnie interesujący dla takich odkryć. System ten osiąga zależne od RNA wycinanie tysięcy fragmentów DNA, z precyzją do pojedynczego nukleotydu25. Takie parametry sprawiają, że interesujące jest zwiększenie dokładności edycji genomu w komórkach ludzkich. Przedstawiona metoda biotynylacji zbliżeniowej może zostać wykorzystana do przyspieszenia i wspierania odkrywania nowych składników białkowych i ich interakcji w wielobiałkowych maszynach molekularnych.

Jednokomórkowy organizm rzęskowy Paramecium tetraurelia zawiera dwa różne typy jąder: jądro linii zarodkowej do długotrwałego przechowywania informacji genetycznej i jądro somatyczne do fizjologicznych funkcji komórki1. Rozmnażanie płciowe w tym organizmie wymaga powstania nowego genomu somatycznego. Proces ten obejmuje nieodwracalne wycięcie ponad 45 000 fragmentów DNA z genomu somatycznego2, które zawierają elementy transpozycyjne3 i inne powtórzenia. Szczególnie uderzające jest to, że zdarzenia wycinania są wykonywane z dokładnością do pojedynczej pary zasad1. Ta dokładność jest biologicznie konieczna, ponieważ wycięte fragmenty DNA zakłócają regiony kodujące białka4, a każde wadliwe wycięcie może wywołać mutacje z przesunięciem ramki odczytu, przedwczesne kodony stop lub zmienić sekwencję kodującą białko. Skomplikowany mechanizm porównywania RNA pozwala komórce różnicować sekwencje, które są potrzebne w nowym genomie somatycznym. Rozpoczyna się od transkrypcji całego genomu linii zarodkowej5, po której następuje przycinanie do rozmiaru 25 pz6, transport do starego genomu somatycznego7, gdzie wszystkie komplementarne RNA są odrzucane8. Pozostałe sRNA, które nie mają komplementarnych sekwencji w starym genomie somatyki, są dalej transportowane do nowego rozwijającego się genomu somatycznego, gdzie dopasowują się do wszelkich sekwencji ograniczonych przez linię zarodkową i kierują ich wycięciem9. Ten złożony, wieloetapowy proces wymaga precyzyjnego i terminowego współdziałania wielu składników komórkowych, a zwłaszcza przejściowych słabych oddziaływań, gdy małe RNA przechodzą między różnymi jądrami10,11. Wcześniej próby zrozumienia mechaniki molekularnej procesu podejmowano przy użyciu eksperymentów knockdown, aby określić, czy domniemane składniki są niezbędne dla procesu, a następnie podejścia immunoprecypitacyjne w celu odkrycia interakcji niezbędnych białek 12,13,14. Chociaż ta metoda jest przydatna do wykrywania silnego i ciągłego wiązania, które wytrzymuje również warunki niefizjologiczne podczas ściągania, wykrywanie słabych i przejściowych interakcji może wymagać żmudnej optymalizacji. Ze względu na potencjalnie przejściowy charakter wielu interakcji biorących udział w procesie edycji genomu, metody in vivo mogą poprawić wykrywanie takich interakcji. Ponadto niektóre białka nie mogą być efektywnie rozpuszczalne w warunkach zewnątrzkomórkowych15, co stanowi problem, który można rozwiązać poprzez modyfikacje białek oparte na interakcjach in vivo, takie jak znakowanie zbliżeniowe biotyną.
W tym miejscu opisujemy nową metodę, która pozwala na specyficzną biotynylację in vivo białek, które są zlokalizowane blisko pożądanego białka docelowego. Kowalencyjna modyfikacja biotyny może być wykorzystana do efektywnego wzbogacania przy użyciu metod pulldown opartych na streptawidynie. Opracowanie tej metody osiągnięto dzięki zastosowaniu ligazy biotyny TurboID16 do wykonywania badań interakcji białkowych w Pantofelii czterobureliowej. Nasze podejście można łatwo zastosować do dowolnego białka docelowego, postępując zgodnie z krokami opisanymi w protokole. Dlatego w tym artykule przedstawiono wydajną i skalowalną strategię biotynylacji zbliżeniowej, która może być wykorzystana do wysokoprzepustowych badań proteomicznych w wybitnym organizmie modelowym pierwotniaka.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop Axiovert 40 CFL (soczewki 10x, 40x)</td><td>Zeiss</td><td>nie</td><td></td></tr><tr><td>B-sitosterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567152</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Olej CellTram</td><td>Ependorf powiedział:</td><td>nie</td><td></td></tr><tr><td>zoptymalizowana sekwencja DNA 3xHA-turboID</td><td>Twist biologia</td><td>nie</td><td>GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC CTGATTATGCTTATCCTTACGAT GTTCCTGATGATGCTTATCCTTAT GATGTACCTGATTACGCTGGATC AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA AGAGCTGCTATTAATAAACACATT CAAACTTTAAGAGATGGGGTGT TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA AGGATATTCCTCTGAACCCAT TCCTTTATTAAATGCTAAACAAT TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT GACTCAACTAATCAAATCAATATTTATTAG ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTCTCCTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTTbr/ GGTAGAAAATGGTTTTCTCTTTTT� GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG CAGCTATTGGATTAGGTCCTCAT TGGTATTGTTTGTCTGAAGCTCT TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT TCAAACACTTTAGCTGCTCTCTCA TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCTCT CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA GAAATGA</td></tr><tr><td>DAPI (interfejs DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał D9542</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer Naukowy</td><td>AAA151610B</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek epT.I.P.S.</td><td>Ependorf powiedział:</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Grogg Chemie</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 4i</td><td>Ependorf powiedział:</td><td>nie</td><td></td></tr><tr><td>Femtotip II</td><td>Kaliber: Naukowy</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Zastosowanie</td><td>10021259</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fischer Naukowy</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>HA-tag (C29F4) mAB królika</td><td>systemy komórkowe</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz NI 2</td><td>Ependorf powiedział:</td><td>nie</td><td></td></tr><tr><td>Lekki średni</td><td>nie</td><td>nie</td><td>0,2x roztwór sproszkowanej trawy pszenicznej w 2,5 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał M8691</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 powiedział:</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol fenolowo-chloroformowy-izoamylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforem&nbsp;</td><td>Fischer Naukowy</td><td>10722497</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid plus zestaw midiprep</td><td>Qiagene powiedział:</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>Bogate podłoże</td><td>nie</td><td>nie</td><td>1x roztwór trawy pszenicznej w proszku w 2,5 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>Streptawidyna-FITC</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>11-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Ultrafree-MC GV&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do mycia</td><td>nie</td><td>nie</td><td>0,1% BSA w wodzie Volvic&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór trawy pszenicznej w proszku</td><td>Sosny międzynarodowe</td><td>nie</td><td>Przygotuj jako 20x bulion z proszku, jak opisano wcześniej (0,5 g/10 ml)</td></tr><tr><td>Streptawidyna-HRP</td><td>Biblioteka ABCAM</td><td>ab7403 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnatyczne pokryte streptawidyną</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LSKMAGT02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy do ściągania</td><td>nie</td><td>nie</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Deoksycholan sodu; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2; 2x inhibitor proteazy cOmplete (Roche); &nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor myjący 1 do ściągania</td><td>nie</td><td>nie</td><td>50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0,5% Deoksycholan sodu; 1% Triton X-100; 5 mM MgCl2;</td></tr><tr><td>Bufor myjący 2 do ściągania</td><td>nie</td><td>nie</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,01 % NP40; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Bufor myjący 3 do ściągania</td><td>nie</td><td>nie</td><td>10 mM Tris pH 7,4; 150 mM NaCl;</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo ) biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w pantofelku czworobocznym

In Vivo Proximity Biotinylation for Protein Interaction Studies in Paramecium tetraurelia

Pantofelek jest głównym organizmem modelowym do badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w programowane rearanżacje genomu i eliminację transpozonów podczas rozmnażania mejotycznego. Wiele szczegółów tego procesu pozostaje zagadkowych ze względu na złożoność zaangażowanej maszynerii molekularnej i przejściowych interakcji białko-białko. W tym miejscu przedstawiamy metodę czasowo-rozdzielczego znakowania białek biotyną znajdujących się w pobliżu białka docelowego będącego przedmiotem zainteresowania. Metodę tę można łatwo dostosować do różnych celów, ponieważ biotynylację uzyskuje się poprzez wstrzyknięcie DNA kodującego białko docelowe połączone z zmodyfikowaną ligazą biotyny. Konstrukt fuzyjny ulega ekspresji z promotora genu endogennego, co umożliwia specyficzny dla etapu profil ekspresji podobny do profilu białka natywnego. Warto zauważyć, że kowalencyjnie przyłączona grupa biotyny pozwala na selektywne wzbogacanie znakowanych białek za pomocą kulek pokrytych streptawidyną. Ponadto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego wykazaliśmy, że skuteczne znakowanie wymaga uzupełnienia kultury biotyną. Zmodyfikowany wektor ekspresji typu plug-and-play, w połączeniu z zademonstrowaną tutaj wydajną procedurą wstrzykiwania, pozwala na szybkie generowanie linii pantofelka wykazujących ekspresję zmodyfikowanego białka. Zademonstrowana tutaj procedura biotynylacji może być kontynuowana za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji wzbogaconych białek, które zawierają oddziałujących partnerów białka docelowego. Biotynylacja zbliżeniowa może uprościć i przyspieszyć odkrywanie interakcji białko-białko w pantofelku oraz zintensyfikować wysiłki na rzecz zrozumienia jego maszynerii edycji genomu.

Nasz protokół opisuje uproszczoną metodę wprowadzania kowalencyjnej modyfikacji biotyny do białek w pobliżu białka docelowego w Pantofelku (ryc. 1A). Te biotynylowane białka mogą być następnie dalej wzbogacane za pomocą ściągania streptawidyny i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas20. Aby zademonstrować praktyczny przypadek użycia metody, zastosowaliśmy protokół do białka Nowa1. Białko to jest niezbędne w procesie rearanżacji genomu i ma dynamiczne zmiany w swojej lokalizacji12. We wczesnych stadiach pozostaje w starym jądrze somatycznym i fragmentach, ale później znajduje się w nowym rozwijającym się jądrze. Warto zauważyć, że nasze poprzednie próby wzbogacenia białek oddziałujących z Nowa1 za pośrednictwem znaczników zakończyły się niepowodzeniem (niepublikowane wyniki). Było to prawdopodobnie spowodowane złożonymi powtórzeniami podobnymi do białka prionowego PrP27, które mogły powodować samoagregację w nieoptymalnych warunkach podczas procedury pulldown21. Przeprowadziliśmy PCR amplifikację regionu kodującego Nowa1 wraz z jego nadrzędnym regionem niekodującym zawierającym promotor. Produkt został następnie umieszczony w ramce ze zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencją kodowania turboID (rysunek 1B). Aby uniknąć wyciszenia wywołanego transgenem spowodowanego wstrzyknięciem kolistego DNA do pantofelka, wektor został zlinearyzowany przed wstrzyknięciem. Zlinearyzowane i oczyszczone DNA zostało następnie mikrowstrzyknięte do jądra somatycznego (MAC), jak opisano w tym protokole. Rozproszona kropla zamknięta w ciemniejszym obszarze jądra somatycznego stała się widoczna w niektórych udanych iniekcjach (ryc. 1C). Udane wstrzyknięcie i amplifikacja DNA przez komórki podczas podziału komórki zostały następnie zweryfikowane za pomocą PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, 40-50% komórek było dodatnich dla wstrzykniętego DNA konstruktu Nowa1 (oczekiwana wielkość produktu 685 pz) (Figura 2). Kolejnym krokiem było zweryfikowanie obecności białka kodowanego przez wstrzyknięte DNA. Ponieważ wektor biorcy zawiera sekwencję turboID otoczoną potrójnym znacznikiem HA, użyliśmy barwienia immunofluorescencyjnego do wykrycia znacznika. Pozwoliło nam to zweryfikować, czy w wstrzykiwanych komórkach występuje ekspresja białka fuzyjnego i czy jest ono prawidłowo zlokalizowane. Użyliśmy komórek w późnym stadium, które wykazały lokalizację białka fuzyjnego w dwóch nowo rozwijających się jądrach, jak wcześniej zaobserwowano dla białka Nowa1 typu dzikiego12. Poszczególne wstrzyknięte linie komórkowe wykazywały różne poziomy białka fuzyjnego (ryc. 3). Niższy poziom ekspresji może być korzystny dla zastosowań, w których pożądane jest zmniejszone tło, ale w tym przypadku zdecydowaliśmy się na maksymalny sygnał i przeszliśmy do klonu 2, który wykazał najwyższą ekspresję. Następnie pobraliśmy próbki na różnych etapach rozwoju, aby śledzić lokalizację białka fuzyjnego. Białko było początkowo zlokalizowane w motkach powstałych ze starego jądra somatycznego oraz w oddzielonych fragmentach jądrowych we wczesnych stadiach autogamii. Po pojawieniu się anlagenu jądrowego, białko fuzyjne przeszło w kierunku tych nowo rozwijających się jąder (ryc. 4). Aby wspomóc biotynylację proteomu proksymalnego na różnych etapach, uzupełniliśmy hodowlę biotyną o wielkości 500 μM przez 2 godziny przed pobraniem komórek do IF. Zobrazowaliśmy białka znakowane biotyną za pomocą barwienia IF przy użyciu fluorescencyjnie znakowanej streptawidyny. Obserwowany sygnał odpowiadał lokalizacji białka fuzyjnego znakowanego HA. Co ważne, udało się uzyskać lokalizację biotynylacji, która jest specyficzna dla różnych etapów rozwoju jądrowego, ponieważ nawet krótka inkubacja z biotyną jest wystarczająca do osiągnięcia znaczącej biotynylacji (ryc. 4). Dodatkowo, bez dodatku uzupełniającej biotyny, w wstrzykniętych komórkach wykryto tylko znikomą biotynylację. W komórkach typu dzikiego dodanie dodatkowej biotyny nie spowodowało wykrywalnej biotynylacji (ryc. 5A). Warto zauważyć, że biotyna nie tylko gromadziła się w rozwijającym się jądrze, ponieważ nawet w warunkach denaturacji pozostaje przyczepiona do białek. (Rysunek 5B). Za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną możliwe było selektywne wzbogacenie biotynylowanych białek (ryc. 6). Wzbogacone białka można zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas. W tych kolejnych eksperymentach z identyfikacją białek, niesuplementowane kultury, jak również komórki wyrażające nieskondensowane białko turboID, mogą być wykorzystane jako tła grupy kontrolne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig1.jpg"> 
Rycina 1: Przegląd procedury biotynylacji zbliżeniowej u P. tetraurelia.(A) Uogólniony zarys protokołu. (B) Zasada klonowania dla wektora biorcy turboID typu plug-and-play i wynikowy konstrukt dla białka fuzyjnego Nowa1. Region 3'UTR używany w tym plazmidzie pochodzi z CenH3a. (C) Widoczna rozproszona kropla zawarta w ciemniejszym obszarze odpowiadającym jądru somatycznemu (MAC) po udanym wstrzyknięciu DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig2.jpg"> 
Rycina 2: Test PCR pod kątem udanego wstrzyknięcia. Analiza reakcji PCR w żelu agarozowym dla produktu ze starterem do przodu specyficznym dla regionu poprzedzającego kodującym oporność na ampicylinę (amp start) i odwrotnym starterem komplementarnym do Nowa1. Grot strzałki pokazuje oczekiwany rozmiar produktu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig3.jpg"> 
Rycina 3: Barwienie immunofluorescencyjne w celu walidacji prawidłowej lokalizacji białka fuzyjnego turboID. Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała króliczego anty-HA (1:100) i sprzężonego z koziego przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 568 (1:1000) monoklonalnych linii Pantofelka z dodatnim sygnałem PCR dla DNA kodującego białko fuzyjne Nowa1-HA-turboID. Skala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig4.jpg"> 
Rycina 4: Biotynylacja specyficzna dla Nowa1 na różnych etapach rozwoju. Barwienie immunofluorescencyjne linii monoklonalnej 2 na postępujących etapach podczas tworzenia nowego jądra somatycznego. Pożywkę hodowlaną uzupełniono biotyną o wielkości 500 μM w celu uzyskania optymalnej aktywności turboID. Znacznik HA wykryto jak na rysunku 3, a biotynę wykryto za pomocą Streptavidin-FITC (1:200). Skala 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig5.jpg"> 
Rysunek 5: Skuteczne znakowanie zbliżeniowe za pomocą turboID wymaga dodatkowej biotyny w hodowli. (A) Barwienie immunofluorescencyjne komórek wt i wstrzykniętych komórek w późnym stadium rozwoju, wykazujące ekspresję Nowa1-HA-turboID i obserwowaną biotynylację 500 μM uzupełniającej biotyny. Znacznik HA i biotynę wykryto jak na rysunku 4. Skala 20 μm. (B) Analiza Western blot dla biotyny przy użyciu HRP-streptawidyny komórek wt hodowanych z biotyną 500 μM i komórek wstrzykniętych turboID z biotyną i bez biotyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68504/68504fig6.jpg"> 
Rycina 6: Wzbogacanie biotynylowanych białek za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny. Analiza Western blot dla biotyny w próbkach z eksperymentu pulldown przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Próbki to: lizat komórkowy Nowa1-HA-turboID (wejście), frakcja niezwiązana (przepływ), etapy płukania (płukanie 1-6) oraz białka związane z kulkami (wyjście). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68504/68504fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Paramecium is a major model organism for the study of molecular mechanisms involved in programmed genomic rearrangements and transposon elimination during ...

Pantofelek jest jednokomórkowym eukariontem z dymorfizmem jądrowym. W jądrze linii zarodkowej wiele genów kodujących białka jest przerywanych przez sekwencje podobne do transpozonów, które muszą zostać usunięte w jądrze somatycznym. Wymaga to kompleksów wielobiałkowych w dynamicznym procesie.Jedną ze skutecznych strategii badania tak skomplikowanej maszynerii molekularnej jest biotynylacja zbliżeniowa. W naszym podejściu możemy wprowadzić dowolny gen docelowy przed ligazą turboID, aby stworzyć białko fuzyjne. Następnie konstrukt ten musi zostać wstrzyknięty do jądra somatycznego pantofelka, jak pokazano w poniższym protokole.W tym protokole stosowanym obecnie komórki, które zostały odzyskane w świeżej pożywce hodowlanej. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby uchwycić komórki za pomocą pipety i przenieść je do świeżego pola szkiełka depresyjnego z medium myjącym. Gdy komórki znajdują się w medium myjącym, rozprowadź 20 mikrolitrów wody na szkiełku podstawowym i przykryj szkłem nakrywkowym.Dodaj 200 mikrolitrów oleju mineralnego na wierzch szkła nakrywkowego. Następnie przenieś poszczególne komórki ze szkiełka myjącego w postaci kropelek pod olej mineralny. Umieścić przygotowane szkiełko na cokole mikroskopu iniekcyjnego.Zamocować igłę do aspiracji i przesunąć ją na miejsce. Aktywuj ramię robota i mikrowtryskiwacz FemtoJet. Użyj końcówki pipety do mikroładowarki, aby dodać DNA do kapilary igły do wstrzykiwań.Przymocować igłę do wstrzykiwań do systemu iniekcyjnego, a następnie przesunąć ją na miejsce i podłączyć do wstrzykiwacza FemtoJet. Użyj ramienia robota, aby umieścić igłę do wstrzykiwań wewnątrz kropli wody. Następnie naciśnij czysty, aby oczyścić igłę, aż będzie widoczny przepływ DNA.Przejść do kropli zawierającej komórkę i opuścić igłę do aspiracji. Następnie delikatnie zasysaj wodę, aż komórka zostanie unieruchomiona. Podnieść igłę do aspiracji i opuścić igłę do wstrzykiwań.Igłę do wstrzykiwań należy wprowadzić w ciemniejsze miejsce odpowiadające jądru somatycznym. Rozlana kropla może stać się widoczna w granicach jądra somatycznego po udanym wstrzyknięciu. Po wstrzyknięciu należy użyć igły do aspiracji, aby przywrócić wodę do komórki.Następnie każda wstrzyknięta komórka musi zostać odzyskana do studzienki wypełnionej pożywką hodowlaną. Po namnażeniu komórek należy potwierdzić obecność wstrzykniętego DNA. W przypadku tej procedury zwykle oczekuje się wskaźnika sukcesu od 40 do 50%.Konieczne jest również zweryfikowanie pomyślnej ekspresji białek z wstrzykniętego DNA, a także ich prawidłowej lokalizacji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Tutaj pokazujemy udane zastosowanie białka NOVA1 połączonego z ligazą biotyny turboID do znakowania zbliżeniowego podczas różnych etapów rozwoju w pantofelku. Warto zauważyć, że suplementacja biotyną zwiększa biotynylację w komórkach, które wyrażają białko fuzyjne turboID.Jednak dodanie biotyny do komórek typu dzikiego nie prowadzi do biotynylacji. Zgodnie z oczekiwaniami, biotyna jest kowalencyjnie przyłączona do różnych białek, jak wykazano w analizie Western blot. Na koniec używamy kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną, aby wykazać, że biotynylowane białka mogą być selektywnie wzbogacane z lizatu pantofelka.Opracowaliśmy metodę znakowania biotyną białek in vivo in pantofelcium. Metodę tę można szybko dostosować do każdego genu, który Cię interesuje. Biotynylację specyficzną dla danego etapu można osiągnąć poprzez czas suplementacji biotyną.

in-vivo-proximity-biotinylation-for-protein-interaction-studies

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ten film opisuje test ligacji zbliżeniowej do badania in situ interakcji białko-białko w komórkach nicieni. Bliskie sąsiedztwo badanych białek generuje kolistą matrycę DNA za pomocą sondy PLA dołączonej do przeciwciała wtórnego. Sonda jest dalej amplifikowana za pomocą roztworu do amplifikacji, który wytwarza długie, jednoniciowe DNA, a następnie hybrydyzuje sondę detektora, umożliwiając lokalizację interakcji białko-białko w komórkach.

Test ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę biotynylacji zbliżeniowej in vivo w Pantofelku czworobocznym przy użyciu ligazy turboID. Technika ta umożliwia selektywne wzbogacanie białek biotynylowanych, wspierając badania interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Przeglądaj więcej filmów