In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Pantofelek jest jednokomórkowym eukariontem z dymorfizmem jądrowym. W jądrze linii zarodkowej wiele genów kodujących białka jest przerywanych przez sekwencje podobne do transpozonów, które muszą zostać usunięte w jądrze somatycznym. Wymaga to kompleksów wielobiałkowych w dynamicznym procesie.

Jedną ze skutecznych strategii badania tak skomplikowanej maszynerii molekularnej jest biotynylacja zbliżeniowa. W naszym podejściu możemy wprowadzić dowolny gen docelowy przed ligazą turboID, aby stworzyć białko fuzyjne. Następnie konstrukt ten musi zostać wstrzyknięty do jądra somatycznego pantofelka, jak pokazano w poniższym protokole.

W tym protokole stosowanym obecnie komórki, które zostały odzyskane w świeżej pożywce hodowlanej. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby uchwycić komórki za pomocą pipety i przenieść je do świeżego pola szkiełka depresyjnego z medium myjącym. Gdy komórki znajdują się w medium myjącym, rozprowadź 20 mikrolitrów wody na szkiełku podstawowym i przykryj szkłem nakrywkowym.

Dodaj 200 mikrolitrów oleju mineralnego na wierzch szkła nakrywkowego. Następnie przenieś poszczególne komórki ze szkiełka myjącego w postaci kropelek pod olej mineralny. Umieścić przygotowane szkiełko na cokole mikroskopu iniekcyjnego.

Zamocować igłę do aspiracji i przesunąć ją na miejsce. Aktywuj ramię robota i mikrowtryskiwacz FemtoJet. Użyj końcówki pipety do mikroładowarki, aby dodać DNA do kapilary igły do wstrzykiwań.

Przymocować igłę do wstrzykiwań do systemu iniekcyjnego, a następnie przesunąć ją na miejsce i podłączyć do wstrzykiwacza FemtoJet. Użyj ramienia robota, aby umieścić igłę do wstrzykiwań wewnątrz kropli wody. Następnie naciśnij czysty, aby oczyścić igłę, aż będzie widoczny przepływ DNA.

Przejść do kropli zawierającej komórkę i opuścić igłę do aspiracji. Następnie delikatnie zasysaj wodę, aż komórka zostanie unieruchomiona. Podnieść igłę do aspiracji i opuścić igłę do wstrzykiwań.

Igłę do wstrzykiwań należy wprowadzić w ciemniejsze miejsce odpowiadające jądru somatycznym. Rozlana kropla może stać się widoczna w granicach jądra somatycznego po udanym wstrzyknięciu. Po wstrzyknięciu należy użyć igły do aspiracji, aby przywrócić wodę do komórki.

Następnie każda wstrzyknięta komórka musi zostać odzyskana do studzienki wypełnionej pożywką hodowlaną. Po namnażeniu komórek należy potwierdzić obecność wstrzykniętego DNA. W przypadku tej procedury zwykle oczekuje się wskaźnika sukcesu od 40 do 50%.

Konieczne jest również zweryfikowanie pomyślnej ekspresji białek z wstrzykniętego DNA, a także ich prawidłowej lokalizacji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Tutaj pokazujemy udane zastosowanie białka NOVA1 połączonego z ligazą biotyny turboID do znakowania zbliżeniowego podczas różnych etapów rozwoju w pantofelku. Warto zauważyć, że suplementacja biotyną zwiększa biotynylację w komórkach, które wyrażają białko fuzyjne turboID.

Jednak dodanie biotyny do komórek typu dzikiego nie prowadzi do biotynylacji. Zgodnie z oczekiwaniami, biotyna jest kowalencyjnie przyłączona do różnych białek, jak wykazano w analizie Western blot. Na koniec używamy kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną, aby wykazać, że biotynylowane białka mogą być selektywnie wzbogacane z lizatu pantofelka.

Opracowaliśmy metodę znakowania biotyną białek in vivo in pantofelcium. Metodę tę można szybko dostosować do każdego genu, który Cię interesuje. Biotynylację specyficzną dla danego etapu można osiągnąć poprzez czas suplementacji biotyną.