Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Genomy mogą dostarczyć informacji o pochodzeniu, transmisji i możliwościach patogenu. W przypadku bakterii, które nie nadają się do hodowli, informacje te można uzyskać tylko poprzez wzbogacenie docelowe. Sekwencjonowanie patogenów bakteryjnych bezpośrednio z próbek klinicznych jest wyzwaniem ze względu na przytłaczające ludzkie DNA, różnorodną mikrobiotę i wyjątkowo niskie obciążenie bakteriami.

W wielu przypadkach hodowla nie wchodzi w grę ze względu na metodę pobierania próbek i wybredne bakterie. Stosując tę technologię do bakterii przenoszonych drogą płciową, odkryliśmy nową linię LGV Chlamydia trachomatis o nazwie ompA-genotyp L4 i potwierdziliśmy globalną ekspansję dominującej linii LGV, dostarczając kluczowych informacji dla diagnostyki molekularnej i nadzoru epidemiologicznego. Ten protokół wzbogacania postępu umożliwia pełne odzyskanie genomu z dodatnio zdiagnozowanych próbek klinicznych chorób przenoszonych drogą płciową.

Odkryliśmy, że ta technika przewyższa głębokie sekwencjonowanie metagenomiczne, zubożenie DNA gospodarza i sekwencjonowanie adaptacyjne nanoporowe. Badamy krążące szczepy tych patogenów w Europie i Argentynie. Ma to potencjał informacyjny w zakresie przenoszenia i zarządzania środkami przeciwdrobnoustrojowymi.

Na początek zmierz stężenie DNA w ekstraktach DNA z próbek klinicznych przy użyciu czułej i dokładnej metody opartej na fluorescencji. Rozcieńczyć każdą próbkę DNA za pomocą wody wolnej od nukleaz do 10 do 200 nanogramów w końcowej objętości 17 mikrolitrów w każdym pasku probówki PCR. Dodać 3 mikrolitry głównej mieszanki rozdrobnienia do każdej studzienki zawierającej 17 mikrolitrów rozcieńczonego DNA.

Pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Następnie uszczelnij pasek probówki do PCR. Wiruj pasek z dużą prędkością przez 10 sekund i krótko obracaj, aby zebrać zawartość.

Następnie umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i uruchom zaprogramowany protokół fragmentacji i inkubacji. Następnie przygotuj naprawę końcową i główną mieszankę dA-tailing, jak pokazano w tabeli. Wiruj i zakręć rurką, jak pokazano wcześniej, i trzymaj ją na lodzie.

Następnie odpipetować 20 mikrolitrów wzorca naprawy końcowej i dA-tailing do każdej studzienki zawierającej 50 mikrolitrów fragmentów DNA. Uszczelnij pasek i wiruj z dużą prędkością przez osiem sekund. Po krótkim odkręceniu paska umieść go z powrotem w termocyklerze.

Po zakończeniu programu termocyklera umieść pasek probówki PCR na lodzie. Następnie dodaj 25 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji w temperaturze pokojowej, która została przygotowana 30 do 45 minut wcześniej, do każdej studzienki zawierającej fragmenty DNA. Dodaj 5 mikrolitrów mieszanki oligo adaptera dla bibliotek oznaczonych NBC do każdej studzienki.

Natychmiast umieść pasek probówki PCR z powrotem w termocyklerze i kontynuuj program. Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, wyjmij kulki magnetyczne z 4 stopni Celsjusza i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem. Następnie dodaj 80 mikrolitrów do każdej studzienki próbki.

Umieść pasek probówki PCR na stojaku magnetycznym i umyj każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Odczekaj minutę podczas każdego prania i ostrożnie usuń etanol, nie naruszając kulek magnetycznych. Po wymieszaniu i inkubacji kulek z 35 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz przez pięć minut, ostrożnie zassać oczyszczony supernatant z każdej studzienki i przenieść go do odpowiedniej studzienki w nowym pasku probówki do PCR.

Umieść nowy pasek probówki PCR na lodzie i wyrzuć kulki magnetyczne. Weź przygotowaną mieszaninę reakcyjną PCR przed wychwytywaniem i dodaj jej 11 mikrolitrów do każdej studzienki próbki zawierającej oczyszczoną bibliotekę DNA. Dodać 5 mikrolitrów wybranej naprawy prime indeksowej do każdej reakcji i uszczelnić pasek probówki PCR.

Uruchom program termocyklera do amplifikacji PCR, jak określono w tabeli, aby przeprowadzić PCR przed wychwytywaniem. Dodaj pasek probówki do PCR dopiero wtedy, gdy termocykler osiągnie 98 stopni Celsjusza. Po zakończeniu PCR przed przechwyceniem wykonaj kolejne czyszczenie za pomocą koralików, aby oczyścić bibliotekę.

Inkubować produkt PCR za pomocą kulek magnetycznych. Następnie umieść probówkę z paskiem PCR na urządzeniu do separacji magnetycznej i odczekaj 5 do 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Podczas gdy pasek pozostaje na stojaku magnetycznym, ostrożnie usuń i wyrzuć przezroczysty supernatant z każdej studzienki.

Następnie eluuj DNA w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i zmierz stężenie DNA w oczyszczonej bibliotece DNA. W celu hybrydyzacji próbki zaprogramuj termocykler zgodnie z określonym tutaj protokołem. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj bieg.

Rozcieńczyć 500 do 1 000 nanogramów przygotowanych bibliotek DNA do końcowej objętości 12 mikrolitrów przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Po wirowaniu i odwirowaniu mieszanki blokerów oligonukleotydów dodaj 5 mikrolitrów do każdej probówki z próbką. Uszczelnij pasek probówki PCR i umieść go w termocyklerze.

Wstrzymaj termocykler, gdy osiągnie krok trzeci protokołu. Dodaj 13 mikrolitrów przygotowanej mieszanki hybrydyzacyjnej sondy temperatury pokojowej do każdej próbki, utrzymując pasek wewnątrz termocyklera. Powoli pipetuj w górę i w dół od 8 do 10 razy, aby wymieszać.

Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza i umieść pasek z powrotem w termocyklerze. Następnie upewnij się, że wszystkie rurki są szczelnie zamknięte. Aby przechwycić zhybrydyzowaną bibliotekę, przenieś całą objętość z każdej probówki do odpowiednich probówek zawierających 200 mikrolitrów wstępnie umytych kulek streptawidyny.

Zbierz kulki streptawidyny przed umyciem ich buforem do mycia o temperaturze pokojowej. Po wyjęciu paska probówki do PCR z separatora magnetycznego dodaj 200 mikrolitrów wysokotemperaturowego buforu do płukania wstępnie podgrzanego do 70 stopni Celsjusza i ponownie zawiesij kulki, pipetując w górę iw dół. Uszczelnij pasek rury, wiruj z dużą prędkością i szybko wiruj, jak pokazano wcześniej.

Umieść szczelnie zamknięty pasek probówki w bloku termocyklera w temperaturze 70 stopni Celsjusza i inkubuj przez 5 minut. Przenieś pasek probówki PCR z termocyklera z powrotem do separatora magnetycznego w temperaturze pokojowej. Odczekaj minutę, aż roztwór stanie się klarowny.

Następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej probówki zawierającej kulki. Zaprogramuj termocykler zgodnie z tabelą pokazaną tutaj.

Dodać 25 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej PCR po wychwyceniu do każdej probówki z próbką. Mieszać reakcję, aż zawiesina będzie jednolita, i bezpiecznie uszczelnić pasek probówki do PCR, nie obracając jej w dół. Umieść szczelnie zamknięty pasek probówki PCR w termocyklerze.

Po przeniesieniu produktu PCR do świeżej probówki, dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny kulek do każdej probówki z próbką i wykonaj czyszczenie DNA, jak pokazano wcześniej. Zmierzyć stężenie DNA w końcowym oczyszczonym DNA z biblioteki przy użyciu metody kwantyfikacji opartej na fluorescencji. Wzbogacenie celu skutkowało znacznie wyższym odsetkiem odczytów docelowych, a tym samym kompletnymi genomami w porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem wszystkich testowanych patogenów, w tym Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma Genitalium.

Powodzenie sekwencjonowania genomu zaobserwowano głównie w próbkach o wartościach progowych cyklu qPCR poniżej 30 dla wszystkich czterech patogenów. Z wyraźną odwrotną korelacją między wartościami CT a odsetkiem docelowych odczytów dla Chlamydia trachomatis. Zastosowanie temperatury hybrydyzacji wynoszącej 62,5 stopnia Celsjusza w porównaniu z poprzednimi 65 stopniami Celsjusza, poprawiło pokrycie genomu Mycoplasma genitalium bez zmniejszania wydajności innych docelowych patogenów.

Analiza filogenetyczna genomów Chlamydia trachomatis z Argentyny wykazała, że wiele próbek skupia się w obrębie kladu L2b i ujawniła nową linię zaproponowaną jako genotyp L4 ompA, oddzieloną od wszystkich poprzednich genomów LGV przez około 600 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.