Name: Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania całych genomów bakterii z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania celu. Protokół umożliwia odzyskanie kompletnych genomów Chlamydia trachomatis i innych patogenów STI, przewyższając skutecznośćą metagenomiczne sekwencjonowanie głębokie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy wszystkim, którzy przyczynili się do powstania tego projektu. Z Uniwersytetu w Zurychu dziękujemy dr Fanny Wegner, Srinithi Purushothaman, dr Frankowi Imkampowi, dr Timowi Roloffowi, dr Dominique Braun i prof. dr Adrianowi Egli za ich zaangażowanie w rozwój i optymalizację techniki. Wyrażamy naszą wdzięczność Danielowi Ganderowi, Valérii Pires, Ariacie Asani i Stefanowi Antenerowi za ich wyjątkową pomoc techniczną przy sekwencjonowaniu. Z Uniwersytetu w Buenos Aires dziękujemy dr Andrei Carolinie Entrocassi, dr Maríi Lucíi Gallo Vaulet, dr Deysi López Aquino, dr Laurze Svidler López i dr Lucianie La Rosie za ich cenny wkład. Na koniec jesteśmy wdzięczni dr Ibrahimowi Kisakesenowi i dr Andreasowi Schreiberowi z firmy Agilent za ich wsparcie. Prace te były wspierane przez STIDirect Grant z Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung oraz przez STISeq Grant STWF-24-009 z Stiftung für wissenschaftliche Forschung an der Universität Zürich. Dodatkowe nieograniczone fundusze zostały przekazane przez Uniwersytet w Zurychu.

<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Generowanie kompletnych danych dotyczących genomu bakteryjnego z próbek klinicznych jest szczególnie trudne. Jednak dane te są nam potrzebne, aby uzyskać informacje na temat krążących klonów i zbadać profile oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie u wybrednych i trudnych do hodowli bakterii. Stosując alternatywne metody, takie jak głębokie sekwencjonowanie lub sekwencjonowanie adaptacyjne z wykorzystaniem technologii Oxford Nanopore, nie można uzyskać wystarczających danych do analizy sekwencji całego genomu. W przypadkach takich jak próbki chorób przenoszonych drogą płciową, wzbogacanie docelowe jest optymalną techniką dostępu do pełnego genomu, a metoda ta może być stosowana w całym panelu bakteryjnych patogenów STI. Chociaż nie jest to tania procedura, wyników, które może zaoferować, nie można uzyskać w żaden inny sposób10.
Odpowiednie próbki powinny być starannie dobrane, najlepiej tak, aby odpowiadały na istotne i ważne pytania w diagnostyce i badaniach. Pożywka używana do zbierania niekoniecznie odgrywa kluczową rolę, z udanymi sekwencjami uzyskanymi zarówno z pożywki 2-SP, jak i NAAT. Przechowywanie próbek jest ważne w celu utrzymania integralności DNA. Za najważniejszy czynnik uznano obciążenie diagnostyczne, dążące do uzyskania przybliżonych wartości Ct poniżej Ct30. W przypadku próbek o wartościach Ct powyżej 30 powodzenie pełnego sekwencjonowania genomu jest mniej prawdopodobne, ale w niektórych przypadkach częściowe dane mogą dostarczyć istotnych informacji.
Procedura nie jest trywialna, obejmuje wiele etapów, w tym cykle PCR, hybrydyzację i wiele myć perełek. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zwrócić szczególną uwagę na procedurę. Krytyczne etapy protokołu – fragmentacja DNA, hybrydyzacja za pomocą sond wychwytujących i wychwytywanie oparte na kulkach magnetycznych z myciem – wymagają starannego wykonania i właściwego obchodzenia się z nimi. Protokół może być nauczony przez badaczy i techników po kilku próbach. W pierwszych rundach, podczas nauki, 3-dniowy protokół może być zaletą; W przypadku bardziej doświadczonych użytkowników 2-dniowy protokół może przyspieszyć wyniki. Ponieważ odczynniki są drogie, warto przeprowadzić test bez drogich komponentów, na przykład sond. W przypadku alternatywnych zestawów przynęt temperaturę hybrydyzacji można dostosować, co może poprawić czułość lub swoistość wzbogacenia. Jeśli zostanie wygenerowana wystarczająca ilość danych i zaobserwowany zostanie znaczny odsetek duplikatów PCR, można również dostosować liczbę cykli PCR przed wychwytywaniem i po wychwyceniu.
Dane uzyskane z tych eksperymentów można wykorzystać do typowania, z wyodrębnionym MLST i innymi odpowiednimi celami. Można go dalej analizować w kontekście epidemiologicznym, globalnie lub lokalnie, w porównaniu z odpowiednimi genomami w celu uzyskania współczesnych informacji. Rekombinacja i analiza elementów ruchomych w całym genomie również wnioskują o zmianach w czasie i pod presją selekcyjną oraz możliwych koinfekcjach. Dysponując wystarczającą ilością danych i powiązanych metadanych, można dokonać obliczeń czasowych i wywnioskować przodków o określonych cechach i liniach, a także możliwych trasach i mechanizmach transmisji. Wszystkie te postępy w naszej wiedzy na temat ważnej grupy patogenów mogą stanowić podstawę strategii zdrowia publicznego. Nasz protokół i reprezentatywne wyniki wskazują na zastosowanie zestawów sond docelowych z panelem syndromicznym, które są skuteczne w próbkach bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i mogą być rozszerzone na dodatkowe typy próbek.

Pojawienie się technik sekwencjonowania nowej generacji (NGS) ułatwiło sekwencjonowanie całego genomu bakterii (WGS), umożliwiając sekwencjonowanie izolatów klinicznych w wielu gatunkach ludzkich patogenów bakteryjnych. Technologia ta umożliwiła przeprowadzenie licznych badań porównawczych poprzez wygenerowanie kompletnych genomów na niespotykaną dotąd skalę. Miało to duży wpływ na mikrobiologię kliniczną i mikrobiologię zdrowia publicznego, ponieważ dostęp do danych genomowych z próbek klinicznych za pośrednictwem WGS umożliwia typowanie i wykrywanie genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Ponadto podejścia metagenomiczne umożliwiają bezpośrednie wykrywanie patogenów związanych z chorobą w próbkach klinicznych. Takie informacje stwarzają nowe możliwości w zakresie spersonalizowanych strategii leczenia pacjentów. Ponadto WGS jest potężnym narzędziem, które zapewnia wgląd w ewolucję krążących szczepów określonego patogenu, a także wzorce ich przenoszenia, umożliwiając organom ds. zdrowia publicznego lepsze zrozumienie i reagowanie na ogniska patogenów 1,2,3.
Aby osiągnąć wystarczającą jakość sekwencjonowania dla WGS, zwykle konieczna jest izolacja bakterii poprzez hodowlę w celu uzyskania wymaganych ilości DNA drobnoustrojów 4,5,6. Stanowi to czynnik ograniczający dla organizmów, które są trudne do hodowli, tych, które nie mogą być hodowane ze względu na niezdolne do życia przetwarzanie próbek diagnostycznych lub tych, które są narażone na działanie antybiotyków podczas leczenia pacjenta. Przykładami takich trudnych do hodowli mikroorganizmów są patogeny bakteryjne przenoszone drogą płciową, takie jak Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium 7,8,9. Gatunki te są trudne do hodowli ze względu na kilka czynników, w tym ich wewnątrzkomórkowy charakter, kruchość, wybredne wymagania dotyczące wzrostu i powolne tempo replikacji. Z tych powodów opracowanie i wdrożenie technik, które umożliwiają WGS pomimo niskiej zawartości DNA – jak to często ma miejsce w próbkach pobranych od pacjentów – ma kluczowe znaczenie dla przeprowadzania analiz genomowych w warunkach klinicznych.
Wzbogacanie docelowe jest najbardziej obiecującą metodą sekwencjonowania genomu, gdy DNA drobnoustrojów jest rzadkie10. Na przykład w kontekście patogenów powodujących infekcje przenoszone drogą płciową (STI) tylko niewielka część DNA obecnego w próbce pacjenta pochodzi od patogenu. W przypadku zakażeń C. trachomatis stwierdzono, że DNA patogenu stanowi maksymalnie 0,6% całkowitego DNA, ale wartości są zwykle znacznie niższe11. Docelowa metoda wzbogacania polega na selektywnym wychwytywaniu interesującego nas DNA drobnoustrojów przed NGS. Osiąga się to za pomocą specjalnie zaprojektowanych sond RNA znakowanych biotyną, które są komplementarne do docelowego DNA drobnoustrojów. Ligacja adaptera jest wykonywana w celu wygenerowania biblioteki genomowej przed hybrydyzacją, podczas której sondy te wiążą się z komplementarnym DNA drobnoustrojów. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do wychwytywania kompleksów kwasów nukleinowych znakowanych biotyną, wykorzystując silne oddziaływanie biotyny-streptawidyny. Na koniec reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) amplifikuje wybrane fragmenty DNA. Te kluczowe kroki koncepcyjne są niezbędne do zrozumienia docelowej strategii wzbogacania. Jednak dodatkowe kroki proceduralne, takie jak mycie i kontrola jakości, są również zaangażowane w pełny protokół10,12.
Przed zainicjowaniem protokołu sekwencjonowania ważne jest, aby ocenić ilość wejściowego DNA i upewnić się, że warunki w całym przepływie pracy zachowują jego integralność. Zgodnie z zaleceniami producenta, standardowy protokół wymaga 10-200 ng DNA w objętości 7 μL, co odpowiada zakresowi stężeń od około 1,4 do 28,6 ng/μL. Gdy stężenie DNA jest niższe, zaleca się zmodyfikowaną wersję protokołu z użyciem 17 μl, pozwalającą na stężenia od 0,6 do 11,8 ng/μl przy zachowaniu wymaganej ilości wejściowej12. Biorąc pod uwagę niskie stężenia często uzyskiwane z próbek klinicznych, rutynowo wdrożyliśmy wariant protokołu 17 μl. Wydajność hybrydyzacji i sekwencjonowania jest związana z jakością DNA, co podkreśla znaczenie odpowiednich warunków przechowywania i transportu próbki w celu zachowania integralności kwasów nukleinowych. Dlatego właściwe praktyki obchodzenia się z pożywkami, takie jak stabilizacja pożywek zbiorczych, szybkie przetwarzanie, utrzymywanie warunków łańcucha chłodniczego i minimalizowanie cykli zamrażania i rozmrażania, są ważnymi środkami optymalizacji jakości DNA. Oprócz wymaganych stężeń DNA, wskaźnikiem integralności jest długość fragmentu DNA. Zalecamy zminimalizowanie degradacji DNA podczas obsługi i przechowywania próbki w celu uzyskania dłuższych fragmentów i optymalizacji wyników sekwencjonowania. Jest to szczególnie istotne w warunkach klinicznych, gdzie powszechna jest zmienność metod pobierania, podłoża i obchodzenia się z nimi. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do DNA wyekstrahowanego zarówno z pożywki 2-SP, jak i pożywki transportowej NAAT, ze średnią długością fragmentów do 1 kb, jak opisano w reprezentatywnych wynikach. Wreszcie, udane sekwencjonowanie zdefiniowano jako osiągnięcie ponad 95% pokrycia genomu przy średniej głębokości odczytu przekraczającej 10 x10.
Do tej pory wzbogacanie tarczy było z powodzeniem stosowane przez różne grupy badawcze do szerokiej gamy mikroorganizmów i wirusów, w tym patogenów wywołujących choroby przenoszone drogą płciową, norowirusów, wirusów zwierząt gospodarskich i patogenów roślin 10,13,14,15,16. Jednak do tej pory konstrukcja sondy była na ogół ograniczona do pojedynczych patogenów, a nie do panelu ukierunkowanego na kompletne genomy wielu syndromicznie powiązanych patogenów. Idealnymi celami są organizmy z małymi, konserwatywnymi genomami, do których rzeczywiście należą C. trachomatis, T. pallidum i M. genitalium. Podczas gdy N. gonorrhoeae ma bardziej zróżnicowany genom i większy pan-genom, sondy pokrywające go nadal mogą być zracjonalizowane w projekcie z pozostałymi trzema bakteriami. Istnieje pewna rozbieżność w %G+C między tymi bakteriami i inne, które mogą być połączone syndromicznie, co oznacza, że warunki mogą wymagać optymalizacji.
Celem tego protokołu jest uzyskanie kompletnych genomów bezpośrednio z próbek klinicznych, aby umożliwić analizy filogenetyczne i epidemiologiczne. Demonstrujemy nowatorską i skuteczną strategię przy użyciu panelu sond dostosowanego do C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum i M. genitalium w celu odzyskania kompletnych genomów przy użyciu wyekstrahowanego DNA z próbek klinicznych, takich jak wymazy z układu moczowo-płciowego i odbytu. Podejście to okazało się skuteczne i zostało zastosowane w charakterystyce wybuchu epidemii ziarniniaka wenereum (LGV) w Buenos Aires, umożliwiając opisanie nowej linii C. trachomatis LGV10,13.
Opisana zostanie procedura wzbogacania celu, w tym zastosowanie dostępnej na rynku metody wychwytywania DNA z łączeniem po wychwytywaniu dla sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stosowanej do uzyskania pełnych genomów bezpośrednio z próbek klinicznych od pacjentów, u których zdiagnozowano C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. palidum i/lub M. genitalium Zakażeń. Aby uzyskać optymalny sukces, zaleca się wybieranie próbek o wartości Ct poniżej 30, ponieważ wyższe wartości Ct odzwierciedlają niższe obciążenia patogenami i mają mniejsze szanse na uzyskanie kompletnych genomów. Ekstrakt DNA do tej metody można uzyskać z próbek klinicznych różnych typów próbek i pożywek do pobierania. Procedury ekstrakcji DNA mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych systemów, przy użyciu zestawów przeznaczonych do izolacji DNA patogenu lub wirusa z próbek wymazów pobranych od ludzi (patrz tabela materiałów).
Zestaw sond wykorzystany w procedurze wzbogacania celu (patrz tabela materiałów) został specjalnie zaprojektowany w celu uchwycenia różnorodności genomowej C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. palidum i M. genitalium. Wygenerowano niestandardowe sondy przy użyciu wielu kompletnych genomów dla każdego gatunku, optymalizując pokrycie ich znanych pangenomów10. Kryteria projektowe obejmowały minimalną homologię sekwencji wynoszącą 90% w stosunku do sekwencji odniesienia oraz częstotliwość kafelkowania 1x-2x w celu zwiększenia skuteczności przechwytywania celów. Aby zoptymalizować opłacalność, algorytm zastosowany w konstrukcji sondy zminimalizował liczbę sond przy jednoczesnym zachowaniu kompleksowej reprezentacji genomowej. Ostateczny zestaw sond składał się z 242 000 sond dla projektów multipleksów ukierunkowanych na C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium i T. pallidum. Cały protokół wzbogacania celu można wykonać w ciągu 2 lub 3 dni. Zarówno w przypadku dwudniowego, jak i trzydniowego przepływu pracy dostępne są wyraźne wskazania punktów zatrzymania.
OŚWIADCZENIE ETYCZNE W niniejszym opracowaniu zaproponowano ulepszenia metodologiczne w oparciu o wcześniej opublikowane protokoły10,13. Opisane procedury obejmują wyłącznie próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i nie obejmują danych pacjenta; W związku z tym nie było wymagane szczególne zatwierdzenie etyczne w odniesieniu do aspektów metodologicznych. Reprezentatywne wyniki uzyskano z dwóch zestawów wcześniej badanych próbek: próbek argentyńskich pobranych zgodnie z zatwierdzonym protokołem Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación (Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, nr zatwierdzenia 201723), za pisemną świadomą zgodą uzyskaną od wszystkich uczestników; oraz zanonimizowane próbki fińskie, w przypadku których nie była wymagana żadna konkretna zgoda etyczna. Przed przesłaniem do bazy danych jakichkolwiek wynikowych danych sekwencjonowania należy usunąć odczyty odczytane przez człowieka.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 8-kanałowa 0,5-10 i mikro; L</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3125000010</td><td>Badania Eppendorf&nbsp; plus, 8-kanałowy, 0,5-10 i mikro; L, średnio szary, o zmiennej objętości.</td></tr><tr><td>Pipeta 8-kanałowa 10-100 &micro; L</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3125000036</td><td>Badania Eppendorf&nbsp; plus, 8-kanałowe, 10-100 i mikro; L, żółty, zmienna głośność.</td></tr><tr><td>Adapter Oligo Mix dla bibliotek oznaczonych MBC</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system ekstrakcji kwasów nukleinowych za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA wirusa/patogenu</td><td>Qiagen powiedział:</td><td>937036 (Zestaw) / 9001297 (Instrument)</td><td>Instrument QIAsymphony SP/AS używany z zestawem QIAamp DSP Virus/Pathogen Kit do automatycznej ekstrakcji DNA.</td></tr><tr><td>Bufor powiązań</td><td>Technologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Część zestawu do wzbogacania celów SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA i automatyczny instrument</td><td>Korporacja Badawcza Zymo</td><td>D3024/D3025</td><td>Quick-DNA Miniprep Kit służy do całkowitej ekstrakcji DNA z próbek klinicznych. Kompatybilny z ręcznym lub zautomatyzowanym przepływem pracy.</td></tr><tr><td>Naprawa końcowa - mieszanka enzymów ogonowych</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Koniec bufora ogonowego naprawy</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>20816.298</td><td>Etanol absolutny &ge; 99,5% Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Fluorometr z testem dsDNA o wysokiej czułości / metoda oparta na fluorescencji do ilościowego oznaczania DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Fluorometr Qubit 4 z zestawem testowym 1X dsDNA o wysokiej czułości (HS).</td></tr><tr><td>Bufor fragmentacji</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Część zestawu do fragmentacji enzymatycznej SureSelect o nazwie "5X Fragmentation Buffer".</td></tr><tr><td>Enzym fragmentacji</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-4080</td><td>Część zestawu do fragmentacji enzymatycznej SureSelect.</td></tr><tr><td>Bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR) o nazwie ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Bufor polimerazy DNA o wysokiej wierności z dNTP (5X)</td><td>Technologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzym fuzyjny o wysokiej wierności do amplifikacji PCR</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-5688</td><td>Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowy bufor do płukania</td><td>Technologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Część zestawu SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny&nbsp;</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Indeksowane startery sekwencjonowania</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część par starterów indeksowych SureSelect XT HS2 1-96 do ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Wewnętrzny multipleksowy test PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Opracowany i akredytowany test oparty na zestawach Lightmix do wykrywania chorób przenoszonych drogą płciową</td></tr><tr><td>Bufor podwiązania</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne do sprzątania</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-5740</td><td>Koraliki SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Sprzęt laboratoryjny Permagen</td><td>MSRLV08</td><td>0,2 ml PCR 8-paskowy separator magnetyczny 5 i mikro; L ~ 0,2 ml objętości.</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS): Wysokowydajny system sekwencjonowania z krótkim odczytem&nbsp;</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Sekwencjonowanie parowanych końców 150 pz (PE150) wykonywane na platformach Illumina NextSeq1000 i MiSeq.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Koncepcja biologiczna</td><td>3-07F04-H</td><td>Woda do biologii molekularnej, wolna od DNA / DNAse / RNazy, sterylna, bez inhibitorów PCR.</td></tr><tr><td>Mieszanka blokerów oligonukleotydów&nbsp;</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Pasek probówki do PCR</td><td>avantor, dostarczony przez firmę VWR&nbsp; &nbsp;</td><td>732-3608</td><td>Paski probówki do PCR z dołączonymi płaskimi nakrętkami.</td></tr><tr><td>Mieszanka podkładów po wychwyceniu</td><td>Technologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>Część zestawu do wzbogacania celów SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR).</td></tr><tr><td>Sonda RNA</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-6916&nbsp;</td><td>SureSelect Niestandardowa sonda Tier4 6Mb-11.9Mb, np. Identyfikator projektu S3465164).</td></tr><tr><td>Bloker RNaz</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR).</td></tr><tr><td>Bufor do płukania w temperaturze pokojowej</td><td>Technologie Agilent</td><td>5190-9687</td><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) o nazwie ''Wash buffer 1''.</td></tr><tr><td>Koraliki paciorkowca</td><td>Technologie Agilent</td><td>5191-5742</td><td>JasneWybierz koraliki Streptawidyny.</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Technologie Agilent</td><td>5500-0147</td><td>Część zestawu SureSelect XT HS2 Library Preparation Kit for ILM (Pre PCR) .</td></tr><tr><td>Metoda wzbogacania celu / metoda wychwytywania DNA</td><td>Technologie Agilent</td><td>G9983-90000</td><td>Zestaw SureSelect XT HS2 DNA z przygotowaniem biblioteki, szybkim wzbogacaniem celów i przepływem pracy po schwytaniu. Wersja protokołu F0, maj 2023 r. Dla platformy Illumina NGS</td></tr><tr><td>Zestaw sondy wzbogacającej cel dla C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum i M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Laboratorium Mikrobiologii Wzbogacającej (IMM, UZH)</td><td>Identyfikator wzoru S3465164</td><td>Specjalnie zaprojektowany zestaw sond (~242 000 sond) do multipleksowego wychwytywania czterech patogenów STI. Projektowanie w oparciu o wiele genomów referencyjnych.</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Termofischer</td><td>4375305</td><td>96-dołkowy termocykler Veriti.</td></tr></tbody></table>

generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Uzyskanie kompletnych genomów bakteryjnych zakażeń przenoszonych drogą płciową (STI) bezpośrednio z próbek klinicznych jest trudne ze względu na obecność ludzkiego DNA, mikrobioty i bardzo niskie obciążenie patogenami bakteryjnymi. Hodowla często nie wchodzi w grę, ponieważ gatunki te są wybredne, a większość próbek jest pobierana w pożywkach transportowych, które lizują mikroorganizmy, czyniąc je niezdolnymi do hodowli. Aby rozwiązać te problemy, użyliśmy panelu sond zaprojektowanego dla czterech gatunków w celu wygenerowania sekwencji całego genomu bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową i przeprowadziliśmy wzbogacanie celu, dwu- lub trzydniową procedurę hybrydyzacji przed sekwencjonowaniem genomu. Nasze wstępne wyniki dostarczyły doskonałych danych genomowych przy użyciu próbek, dla których bezpośrednie sekwencjonowanie nie powiodło się. Wzbogacanie celów okazało się bardzo skuteczne w sekwencjonowaniu genomów chorób przenoszonych drogą płciową bakterii, szczególnie gdy obciążenie patogenami było wysokie (Ct < 30). Badane próbki zawierające Mycoplasma genitalium często miały wartości Ct powyżej 30, co prowadziło do niższych wskaźników powodzenia odzyskiwania genomu; poprawę zaobserwowano po optymalizacji temperatury hybrydyzacji z 65 °C do 62,5 °C. Dostępność kompletnych genomów może nie tylko umożliwić nadzór genomowy, ale także dostarczyć cennych informacji na temat oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, takich jak identyfikacja determinantów nabytej oporności związanych z Neisseria gonorrhoeae. Metoda ta doprowadziła już do zidentyfikowania nowej linii Chlamydia trachomatis lymphogranuloma venereum w Buenos Aires, ompA-genotyp L4, podkreślając potencjał tego podejścia w odkrywaniu nowej różnorodności genomowej i poprawie nadzoru nad chorobami przenoszonymi drogą płciową.

Badanie nad wybuchem epidemii Lv C. trachomatis w Buenos Aires w Argentynie wykazało pewne nowe cechy w próbkach, a mianowicie 10 podstawień nukleotydów w genie ompA w porównaniu z genotypem L1 ompA oraz niezwykłą sekwencję typu 2 17,18,19 (Multi-Locus Sequence Typing) (MLST). Naszym celem było zbadanie genomów z tych próbek klinicznych, umieszczając je w kontekście danych globalnych. Aby to osiągnąć, porównaliśmy wydajność podejścia do wzbogacania docelowego z bezpośrednim sekwencjonowaniem metagenomicznym dla WGS bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych, próbując przezwyciężyć wyzwania związane z niskim obciążeniem bakteryjnym oraz obfitym ludzkim i mikrobiologicznym DNA.
Wykorzystane DNA pochodziło z próbek wymazów z odbytu pobranych w latach 2017-2023 w Buenos Aires w Argentynie, umieszczonych w pożywce 2-SP (pożywka sacharozowo-fosforanowa) uzupełnionej 2% płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (gentamycyna 25 μg/ml, wankomycyna 0,5 mg/ml i amfoterycyna B 2,5 μg/ml) i przechowywane w temperaturze -80 °C, lub zbiorcze wymazy z cewki moczowej, odbytnicy i gardła pobrane w Szpitalu Uniwersyteckim w Zurychu (USZ) w buforze NAAT (Nucleic Acid Amplification Tests). DNA z próbek z Buenos Aires zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawu do ekstrakcji ręcznej na bazie krzemionki, podczas gdy DNA z próbek USZ zostało wyekstrahowane za pomocą zautomatyzowanego systemu opartego na kulkach magnetycznych.
Wszystkie próbki kliniczne uwzględnione w tym badaniu zostały potwierdzone dodatnim wynikiem za pomocą opracowanego przez nas multipleksowego testu PCR w czasie rzeczywistym (patrz tabela materiałów) z wartościami progowymi cyklu qPCR (Ct) w następującym zakresie: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 i M. genitalium: 30-37. Stężenie DNA określono ilościowo za pomocą testu fluorometrycznego o wysokiej czułości przed sekwencjonowaniem w celu scharakteryzowania materiału wejściowego próbek klinicznych (patrz Tabela materiałów).
Aby porównać bezpośrednie sekwencjonowanie metagenomiczne ze wzbogaceniem docelowym, użyliśmy 32 próbek, z których 29 było dodatnich dla C. trachomatis, dziewięć dla N. gonorrhoeae, pięć dla T. pallidum i trzy dla M. genitalium. Bezpośrednie sekwencjonowanie metagenomiczne nie dało żadnych kompletnych genomów, a w rzeczywistości ledwo osiągnęło dane docelowe powyżej wartości wyjściowej obserwowanej w próbkach ujemnych. Wzbogacenie celu za pomocą hybrydyzacji w temperaturze 65 °C dało znacznie lepsze wyniki dla każdego patogenu, a w wielu przypadkach uzyskano udane genomy dzięki tej metodzie (ryc. 1). 
Aby ocenić optymalny wybór próbki do wzbogacenia docelowego, oceniliśmy związek między diagnostycznymi wartościami qPCR Ct a skutecznością odzyskiwania genomu, mierzoną procentem odczytów na miejscu (%OTR). Wskaźnik ten odzwierciedla proporcję odczytów sekwencjonowania, które odwzorowują genom organizmu docelowego i jest powszechnie stosowany do oceny wydajności wzbogacania. Stwierdzono istotną korelację między obciążeniem patogenem a sukcesem sekwencjonowania C. trachomatis, z punktem odcięcia Ct dla powodzenia około Ct30. Chociaż dane dotyczące innych docelowych patogenów były ograniczone, zaobserwowano podobny trend, w którym sukces sekwencjonowania genomu wystąpił głównie w próbkach z ładunkiem patogenu poniżej Ct30 (ryc. 2).
Ten eksperyment z temperaturą hybrydyzacji 65 °C dał wskaźniki powodzenia sekwencjonowania genomu ze wzbogaceniem docelowym o 75%-80% dla C. trachomatis, N. gonorrhoeae i T. pallidum, na podstawie próbek o wartościach Ct poniżej 30. Trzy próbki dodatnie M. genitalium miały wartości Ct 30-37 i osiągnęły niższe pokrycie genomu oraz średnią głębokość odczytu. Aby poprawić te wyniki, eksperymentowaliśmy z obniżeniem temperatury hybrydyzacji, co poprawia hybrydyzację ze względu na niską zawartość %G+C w genomie M. genitalium . Stosując niższe temperatury hybrydyzacji, takie jak obecnie zalecana temperatura 62,5 °C, możemy poprawić odzyskiwanie genomów M. genitalium bez uszczerbku dla odzyskiwania innych genomów (ryc. 3). Wyniki te pokazują, że wzbogacanie docelowe jest skutecznym podejściem do uzyskiwania cennych informacji genomowych z próbek klinicznych i może być dostosowane do szerokiego zakresu genomów, również w ramach projektu panelowego.
Analiza filogenetyczna pomyślnie wzbogaconych genomów C. trachomatis wykazała, że większość próbek z Buenos Aires skupia się w obrębie kladu ompA-genotyp L2b, co sugeruje udaną linię o globalnym obiegu. Analiza ujawniła również obecność nowej, odrębnej linii rodowej w Argentynie, powodującej LGV. Próbki z tego kladu różnią się o około 600 SNP od innych linii LGV, a linia ta jest proponowana jako genotyp L4 ompA (ryc. 4). Szczegółowy opis próbek użytych na rys. 1, rys. 2 i rys. 4 znajduje się w tabeli uzupełniającej 1.
Odkrycia te podkreślają wartość wzbogacania celu w badaniu różnorodności patogenów i wykazują wysoki stopień sukcesu sekwencjonowania genomu na podstawie próbek klinicznych.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Wzbogacanie genomów za pomocą wzbogacania docelowego w porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem metagenomicznym. Odsetek odczytów po osiągnięciu celu (%OTR), zdefiniowany jako odsetek odczytów sekwencjonowania mapujących genom organizmu docelowego, pokazuje stopień wzbogacenia osiągnięty dzięki wzbogaceniu docelowemu. Linia reprezentuje medianę wszystkich punktów danych, a pole wskazuje 50% przedział międzykwartylowy (IQR). Kolory punktów danych odpowiadają źródłu próbki: bladoniebieski dla Argentyny i czerwony dla Szwajcarii. Sukces sekwencjonowania genomu, zdefiniowany jako pokrycie &gt;95% i średnia głębokość odczytu &gt;10, jest reprezentowany przez duże punkty, podczas gdy niepowodzenie jest wskazywane przez małe punkty. Zwróć uwagę na różne skale na osi y. Skróty: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Liczba ta została zmodyfikowana z10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Korelacja %OTR ze wzbogacenia celu z diagnostycznymi wartościami qPCR Ct. Kolory punktów danych reprezentują źródło próbki: bladoniebieski dla Argentyny i czerwony dla Szwajcarii. Powodzenie sekwencjonowania genomu, zdefiniowane jako pokrycie &gt;95% i średnia głębokość odczytu &gt;10, jest oznaczone dużymi punktami, podczas gdy niepowodzenie jest reprezentowane przez małe punkty. Zwróć uwagę na różne skale na osi y. Skróty: CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Liczba ta została zmodyfikowana z10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Rycina 3: Wpływ temperatury hybrydyzacji na odzyskiwanie kompletnych genomów wszystkich patogenów bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową w dziesięciu próbkach. Ludzkie DNA w zakresie próbek klinicznych zostało wzbogacone znanymi stężeniami docelowego bakteryjnego DNA osobno (pojedyncze), a także razem, aby reprezentować próbkę z wieloma infekcjami (połączone). Przeprowadzono dwa eksperymenty, każdy z pięcioma patogenami/kombinacjami: 0,01% i 0,03%, aby przedstawić przybliżony procent DNA z każdego mikroorganizmu w stosunku do całkowitego DNA w próbce (pozostałe DNA odpowiada ludzkiemu DNA). Regeneracja M. genitalium poprawia się w niższych temperaturach. C. trachomatis (C. trachomatis) DNA zostało wzbogacone w niskim stężeniu; Dalsze eksperymenty pokazują, że temperatury nie wpłynęły na odtworzenie genomów C. trachomatis (dane nie pokazane). Skróty: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Rycina 4: filogeneza skorygowana o rekombinację szczepów LGV z Argentyny. Analiza obejmuje wszystkie dostępne genomy LGV wraz z opublikowanymi danymi. Metadane wyświetlane po prawej stronie filogenezy obejmują zduplikowane próbki pacjentów, bayesowską analizę struktury populacji (BAPS; klaster = klad, z polifiletycznym klastrem BAPS 6 reprezentującym różnorodność genetyczną populacji), metodę sekwencjonowania genomu (dane z tego badania), genotyp ompA , kraj i rok, jak wskazano w kluczu w lewym górnym rogu. Brakujące dane są wyświetlane w kolorze białym. Nazwy genomów z tego badania są wyróżnione kolorem jasnoniebieskim dla Argentyny i ciemnoniebieskim dla Finlandii (nie uzyskano ich przez docelowe wzbogacenie). Kolory te są używane wyłącznie do rozróżnienia genomów wygenerowanych w tym badaniu. Wartości bootstrap z 1000 ultraszybkich bootstrapów są wyświetlane jako wartości procentowe w głównych gałęziach. Liczba ta została zmodyfikowana z13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Opis materiałów, odczynników, przyrządów i sprzętu wykorzystanych w badaniu. Tabela zawiera szczegółowe informacje na temat nazwy handlowej, producenta i numeru katalogowego składników używanych do ekstrakcji DNA, przygotowania biblioteki, wzbogacania celu i sekwencjonowania. Obejmuje również pozycje używane do wewnętrznych testów qPCR i ogólnych procedur biologii molekularnej. Równoważne alternatywy mogą być stosowane w przypadku produktów oznaczonych gwiazdką (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

W tym miejscu przedstawiamy protokół umożliwiający sekwencjonowanie całego genomu bakteryjnych infekcji przenoszonych drogą płciową z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania docelowego. Ta nowatorska, panelowa metoda syndromiczna pozwala przezwyciężyć wyzwania związane z obfitością ludzkiego DNA i niskim obciążeniem bakteryjnym, ułatwiając nadzór genomiczny nad Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma genitalium.

Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

Genomy mogą dostarczyć informacji o pochodzeniu, transmisji i możliwościach patogenu. W przypadku bakterii, które nie nadają się do hodowli, informacje te można uzyskać tylko poprzez wzbogacenie docelowe. Sekwencjonowanie patogenów bakteryjnych bezpośrednio z próbek klinicznych jest wyzwaniem ze względu na przytłaczające ludzkie DNA, różnorodną mikrobiotę i wyjątkowo niskie obciążenie bakteriami.W wielu przypadkach hodowla nie wchodzi w grę ze względu na metodę pobierania próbek i wybredne bakterie. Stosując tę technologię do bakterii przenoszonych drogą płciową, odkryliśmy nową linię LGV Chlamydia trachomatis o nazwie ompA-genotyp L4 i potwierdziliśmy globalną ekspansję dominującej linii LGV, dostarczając kluczowych informacji dla diagnostyki molekularnej i nadzoru epidemiologicznego. Ten protokół wzbogacania postępu umożliwia pełne odzyskanie genomu z dodatnio zdiagnozowanych próbek klinicznych chorób przenoszonych drogą płciową.Odkryliśmy, że ta technika przewyższa głębokie sekwencjonowanie metagenomiczne, zubożenie DNA gospodarza i sekwencjonowanie adaptacyjne nanoporowe. Badamy krążące szczepy tych patogenów w Europie i Argentynie. Ma to potencjał informacyjny w zakresie przenoszenia i zarządzania środkami przeciwdrobnoustrojowymi.Na początek zmierz stężenie DNA w ekstraktach DNA z próbek klinicznych przy użyciu czułej i dokładnej metody opartej na fluorescencji. Rozcieńczyć każdą próbkę DNA za pomocą wody wolnej od nukleaz do 10 do 200 nanogramów w końcowej objętości 17 mikrolitrów w każdym pasku probówki PCR. Dodać 3 mikrolitry głównej mieszanki rozdrobnienia do każdej studzienki zawierającej 17 mikrolitrów rozcieńczonego DNA.Pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Następnie uszczelnij pasek probówki do PCR. Wiruj pasek z dużą prędkością przez 10 sekund i krótko obracaj, aby zebrać zawartość.Następnie umieść pasek probówki PCR w termocyklerze i uruchom zaprogramowany protokół fragmentacji i inkubacji. Następnie przygotuj naprawę końcową i główną mieszankę dA-tailing, jak pokazano w tabeli. Wiruj i zakręć rurką, jak pokazano wcześniej, i trzymaj ją na lodzie.Następnie odpipetować 20 mikrolitrów wzorca naprawy końcowej i dA-tailing do każdej studzienki zawierającej 50 mikrolitrów fragmentów DNA. Uszczelnij pasek i wiruj z dużą prędkością przez osiem sekund. Po krótkim odkręceniu paska umieść go z powrotem w termocyklerze.Po zakończeniu programu termocyklera umieść pasek probówki PCR na lodzie. Następnie dodaj 25 mikrolitrów głównej mieszanki ligacji w temperaturze pokojowej, która została przygotowana 30 do 45 minut wcześniej, do każdej studzienki zawierającej fragmenty DNA. Dodaj 5 mikrolitrów mieszanki oligo adaptera dla bibliotek oznaczonych NBC do każdej studzienki.Natychmiast umieść pasek probówki PCR z powrotem w termocyklerze i kontynuuj program. Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, wyjmij kulki magnetyczne z 4 stopni Celsjusza i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem. Następnie dodaj 80 mikrolitrów do każdej studzienki próbki.Umieść pasek probówki PCR na stojaku magnetycznym i umyj każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami 70% etanolu. Odczekaj minutę podczas każdego prania i ostrożnie usuń etanol, nie naruszając kulek magnetycznych. Po wymieszaniu i inkubacji kulek z 35 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz przez pięć minut, ostrożnie zassać oczyszczony supernatant z każdej studzienki i przenieść go do odpowiedniej studzienki w nowym pasku probówki do PCR.Umieść nowy pasek probówki PCR na lodzie i wyrzuć kulki magnetyczne. Weź przygotowaną mieszaninę reakcyjną PCR przed wychwytywaniem i dodaj jej 11 mikrolitrów do każdej studzienki próbki zawierającej oczyszczoną bibliotekę DNA. Dodać 5 mikrolitrów wybranej naprawy prime indeksowej do każdej reakcji i uszczelnić pasek probówki PCR.Uruchom program termocyklera do amplifikacji PCR, jak określono w tabeli, aby przeprowadzić PCR przed wychwytywaniem. Dodaj pasek probówki do PCR dopiero wtedy, gdy termocykler osiągnie 98 stopni Celsjusza. Po zakończeniu PCR przed przechwyceniem wykonaj kolejne czyszczenie za pomocą koralików, aby oczyścić bibliotekę.Inkubować produkt PCR za pomocą kulek magnetycznych. Następnie umieść probówkę z paskiem PCR na urządzeniu do separacji magnetycznej i odczekaj 5 do 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Podczas gdy pasek pozostaje na stojaku magnetycznym, ostrożnie usuń i wyrzuć przezroczysty supernatant z każdej studzienki.Następnie eluuj DNA w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i zmierz stężenie DNA w oczyszczonej bibliotece DNA. W celu hybrydyzacji próbki zaprogramuj termocykler zgodnie z określonym tutaj protokołem. Uruchom program i natychmiast wstrzymaj bieg.Rozcieńczyć 500 do 1 000 nanogramów przygotowanych bibliotek DNA do końcowej objętości 12 mikrolitrów przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Po wirowaniu i odwirowaniu mieszanki blokerów oligonukleotydów dodaj 5 mikrolitrów do każdej probówki z próbką. Uszczelnij pasek probówki PCR i umieść go w termocyklerze.Wstrzymaj termocykler, gdy osiągnie krok trzeci protokołu. Dodaj 13 mikrolitrów przygotowanej mieszanki hybrydyzacyjnej sondy temperatury pokojowej do każdej próbki, utrzymując pasek wewnątrz termocyklera. Powoli pipetuj w górę i w dół od 8 do 10 razy, aby wymieszać.Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza i umieść pasek z powrotem w termocyklerze. Następnie upewnij się, że wszystkie rurki są szczelnie zamknięte. Aby przechwycić zhybrydyzowaną bibliotekę, przenieś całą objętość z każdej probówki do odpowiednich probówek zawierających 200 mikrolitrów wstępnie umytych kulek streptawidyny.Zbierz kulki streptawidyny przed umyciem ich buforem do mycia o temperaturze pokojowej. Po wyjęciu paska probówki do PCR z separatora magnetycznego dodaj 200 mikrolitrów wysokotemperaturowego buforu do płukania wstępnie podgrzanego do 70 stopni Celsjusza i ponownie zawiesij kulki, pipetując w górę iw dół. Uszczelnij pasek rury, wiruj z dużą prędkością i szybko wiruj, jak pokazano wcześniej.Umieść szczelnie zamknięty pasek probówki w bloku termocyklera w temperaturze 70 stopni Celsjusza i inkubuj przez 5 minut. Przenieś pasek probówki PCR z termocyklera z powrotem do separatora magnetycznego w temperaturze pokojowej. Odczekaj minutę, aż roztwór stanie się klarowny.Następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do każdej probówki zawierającej kulki. Zaprogramuj termocykler zgodnie z tabelą pokazaną tutaj.Dodać 25 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej PCR po wychwyceniu do każdej probówki z próbką. Mieszać reakcję, aż zawiesina będzie jednolita, i bezpiecznie uszczelnić pasek probówki do PCR, nie obracając jej w dół. Umieść szczelnie zamknięty pasek probówki PCR w termocyklerze.Po przeniesieniu produktu PCR do świeżej probówki, dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny kulek do każdej probówki z próbką i wykonaj czyszczenie DNA, jak pokazano wcześniej. Zmierzyć stężenie DNA w końcowym oczyszczonym DNA z biblioteki przy użyciu metody kwantyfikacji opartej na fluorescencji. Wzbogacenie celu skutkowało znacznie wyższym odsetkiem odczytów docelowych, a tym samym kompletnymi genomami w porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem wszystkich testowanych patogenów, w tym Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum i Mycoplasma Genitalium.Powodzenie sekwencjonowania genomu zaobserwowano głównie w próbkach o wartościach progowych cyklu qPCR poniżej 30 dla wszystkich czterech patogenów. Z wyraźną odwrotną korelacją między wartościami CT a odsetkiem docelowych odczytów dla Chlamydia trachomatis. Zastosowanie temperatury hybrydyzacji wynoszącej 62,5 stopnia Celsjusza w porównaniu z poprzednimi 65 stopniami Celsjusza, poprawiło pokrycie genomu Mycoplasma genitalium bez zmniejszania wydajności innych docelowych patogenów.Analiza filogenetyczna genomów Chlamydia trachomatis z Argentyny wykazała, że wiele próbek skupia się w obrębie kladu L2b i ujawniła nową linię zaproponowaną jako genotyp L4 ompA, oddzieloną od wszystkich poprzednich genomów LGV przez około 600 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.

generating-whole-bacterial-genomes-from-clinical-samples-using-target

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Poznaj metodę sekwencjonowania całych genomów bakterii z próbek klinicznych przy użyciu wzbogacania celu. Protokół umożliwia odzyskanie kompletnych genomów Chlamydia trachomatis i innych patogenów STI, przewyższając skutecznośćą metagenomiczne sekwencjonowanie głębokie.

Generowanie całych genomów bakteryjnych z próbek klinicznych przy użyciu przepływu pracy wzbogacania celu

Przeglądaj więcej filmów