Name: Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj skaningową transmisyjną tomografię elektronową w wirusologii. Naucz się przygotowywać próbki metodą zamrażania pod wysokim ciśnieniem i substytucji zamrożonej, aby uzyskać obrazy 3D komórek zakażonych wirusami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja jest częścią Globalnej Strategii Rozwoju Technologicznego i została wspierana przez Globalne Zarządzanie Technologią w Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals. Dziękujemy Renate Kunz i Janie Apolloni za doskonałą pomoc techniczną oraz pomocne dyskusje dotyczące przygotowania próbek. Dziękujemy Reinhardowi Weihowi za doskonałą pomoc w kwestiach technicznych oraz konserwacji urządzeń. Dziękujemy Torstenowi Friedrichowi za pomocną dyskusję i pomoc przy ustawieniu mikroskopu. Prace Clarissy Read, Julii LaRoche i Jana Müncha zostały sfinansowane z grantu Cooperative Research Centre Niemieckiej Fundacji Badawczej (SFB1279).

<ol><li>Laue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+1+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 1 electron microscopy of viruses.</a> Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).</li>
<li>Goldsmith, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+electron+microscopy+for+identifying+viruses+in+diseases+of+unknown+cause%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause.</a> Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).</li>
<li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+electron+microscopy+in+virus+diagnosis+and+advanced+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches.</a> J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).</li>
<li>Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+cytomegalovirus+secondary+envelopment+by+advanced+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).</li>
<li>Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+HCMV+entry+into+host+cells+by+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography.</a> J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).</li>
<li>Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+replication+in+glioblastoma+cells%3A+electron+microscopic+tomography+shows+3D+arrangement+of+endoplasmic+reticulum%2C+replication+organelles%2C+and+viral+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins.</a> Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).</li>
<li>Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-native+visualization+of+SARS-CoV-2+induced+membrane+remodeling+and+virion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis.</a> Viruses. 14 (12), 2786(2022).</li>
<li>Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+infection+at+high+magnification%3A+3D+electron+microscopy+methods+to+analyze+the+architecture+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells.</a> Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).</li>
<li>Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-SEM+as+a+volume+electron+microscopy+approach+to+study+cellular+architectures+in+SARS-CoV-2+and+other+viral+infections%3A+a+practical+primer+for+a+virologist%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist.</a> Viruses. 13 (4), 611(2021).</li>
<li>Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+of+high-pressure+frozen+and+freeze-substituted+cells%3A+a+comparison+of+image+stacks+obtained+at+200+kV+or+300+kV%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV.</a> Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).</li>
<li>Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+STEM+tomography+at+200+kV%3A+setup%2C+performance%2C+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations.</a> J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).</li>
<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+transmission+electron+microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+imaging+techniques%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell imaging techniques, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).</li>
<li>Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+preparation+by+high-pressure+freezing%2C+microwave-assisted+contrast+enhancement%2C+and+minimal+resin+embedding+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging.</a> J Vis Exp. (145), e59156(2019).</li>
<li>Read, C., Walther, P., von Einem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegaloviruses%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegaloviruses, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).</li>
<li>Romero-Brey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+organelles+in+situ+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography.</a> J Vis Exp. (196), (2023).</li>
<li>McDonald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+28+%26%2334%3Btips+and+tricks%26%2334%3B+for+high-pressure+freezing+of+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 28 &#34;tips and tricks&#34; for high-pressure freezing of model systems.</a> Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+chemical+fixation+procedures+with+high-pressure+freezing+and+freeze+substitution+preserves+highly+labile+tissue+ultrastructure+for+electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications.</a> J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+enhancing+EF-C+peptide+nanofibrils+are+endocytosed+by+macropinocytosis+and+subsequently+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded.</a> Biomaterials. , 317(2025).</li>
<li>Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+H7-protein+is+required+for+the+organization+of+the+viral+scaffold+protein+into+hexamers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers.</a> Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).</li>
<li>Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB%2FSEM+tomography+with+TEM-like+resolution+for+3D+imaging+of+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells.</a> Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).</li>
<li>Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Golgi+apparatus+and+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+the+SARS-CoV-2+replication+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex.</a> Viruses. 13 (9), 1798(2021).</li>
<li>Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+%28S3EM%29+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).</li>
<li>Lewczuk, B., Szyryńska, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-emission+scanning+electron+microscope+as+a+tool+for+large-area+and+large-volume+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies.</a> Animals. 11 (12), 3390(2021).</li>
<li>Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mitochondrial+ultrastructure+of+Drosophila+indirect+flight+muscle+revealed+by+serial-section+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography.</a> J Vis Exp. (130), e56567(2017).</li>
<li>Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+structural+and+functional+model+of+the+coronavirus+replication+organelle%3A+tracking+down+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Biol%22%5BJournal%5D)">A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis.</a> PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).</li>
<li>Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+three-dimensional+architecture+of+the+dengue+virus+replication+and+assembly+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites.</a> Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).</li>
<li>Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+Zika+virus+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories.</a> Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).</li>
<li>Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+infection+cycle+of+VSV-%CE%94G-spike+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus.</a> Viruses. 14 (12), 2828(2022).</li>
<li>Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+permanganate+is+an+excellent+alternative+to+osmium+tetroxide+in+freeze-substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution.</a> Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).</li>
</ol>

JGW, RH, EP, JSR oraz MD są pracownikami firmy Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, firmy farmaceutycznej zainteresowanej opracowywaniem i produkcją produktów opartych na wirusach. Nie miało to wpływu na projekt gazety; Dlatego nie zgłaszamy żadnych konfliktów interesów.

Tomografia STEM oferuje rozdzielczość porównywalną z tomografią TEM, w połączeniu z możliwością badania objętości o grubości do 1 μm. Dlatego uważamy ją za idealną do obrazowania zmian struktur wewnątrzkomórkowych wywołanych przez wirusa, takich jak remodelowanie błony 4,6,25, pączkowanie wirionów7 czy endocytoza5. W zależności od pytania badawczego, mogą być rozważone inne techniki VolumeEM. Dla techniki zapewniającej większe pole widzenia o porównywalnej rozdzielczości zalecamy tomografię FIB-SEM. Tomografia FIB-SEM będzie wolniejsza niż tomografia STEM przy obrazowaniu porównywalnej objętości o podobnej rozdzielczości, ponieważ czas obrazowania wzrasta wraz ze wzrostem rozdzielczości. Często jest to następnie mierzone przez obrazowanie mniejszych pól widzenia. Ponadto rozdzielczość z 6,8 nm (rysunek 6) byłaby technicznie trudna przy frezowaniu wiązki jonowej. Dlatego FIB-SEM jest optymalny do obrazowania większych struktur, takich jak komórki całe i tkanki 9,10,26,27, choć zwykle o (izotropowych) rozmiarach pikseli rzędu kilkudziesięciu nanometrów. Ponadto tomogramy FIB-SEM nie wykazują efektów "brakującego klina", co jest typowe dla tomogramów rekonstruowanych z serii przechylenia. Ponadto, wraz z rozwojem maszyn plazmowych FIB, obecnie wprowadzane są alternatywy zapewniające szybsze i nadal precyzyjne frezowanie.
Jeśli wysoka rozdzielczość w z nie jest kluczowa, alternatywą może być obrazowanie TEM lub SEM przekrojów seryjnych, umożliwiającą badanie bardzo dużego pola widzenia w krótkim czasie28,29, jednak zazwyczaj z rozdzielczością anizotropową. W tomografii TEM można łączyć różne tomogramy z szeregowych grubych przekrojów30,31. To samo jest możliwe w tomografii STEM; jednak ze względu na grubość przekrojów, które można badać, jest mniejsza potrzeba łączenia wielu tomogramów. W wirusologii tomografia TEM jest często wykorzystywana do charakteryzowania remodelowania błony indukowanego przez wirusa 32,33,34,35. Chociaż sama tomografia TEM dostarcza cennych informacji na temat cyklu replikacji wirusów, większość przypadków skorzystałaby na możliwości tomografii STEM do obrazowania grubszych objętości. Dotyczy to szczególnie wirionów o morfologii anizotropowej, takich jak rhabdoviridae, gdzie tomografia TEM może uchwycić tylko kilka kompletnych wirionów w jednym tomogramie35 lub obrazować kilka wirionów otaczających w przedziale replikacyjnej o rozmiarze kompleksu cytoplazmatycznego wirusa (cVAC) ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV)4.
Tomografia STEM w warunkach kriogenicznych oferuje dodatkowe funkcjonalne informacje19 , a dostępny jest protokół wideo20. Nasz protokół różni się procesem przygotowania próbki, który zamiast zachować próbkę w stanie natywnym, zapewnia niemal naturalną ultrastrukturalną ochronę. Chociaż tomografia STEM próbek zamrożonych i zamienionych w wysokociśnieniowym zamrożeniu nie jest w stanie osiągnąć ultrastrukturalnej ochrony i rozdzielczości atomowej jak w kriogenicznym EM, korzysta z zalet prostszego sprzętu, bardziej stabilnych próbek i wyższej przepustowości.
Następujące kroki są kluczowe dla sukcesu metody:
Po pierwsze, jasny cel eksperymentu obrazowania. Ze względu na pracochłonność tej techniki potrzebny jest dobrze zaplanowany eksperyment z jasnym celem obrazowania. Szczegółowa wiedza o systemie modelowym – linii komórkowej i wirusie – powinna być generowana wcześniej, stosując inne metody, które są łatwiejsze do wykonania. Dlatego zachęcamy do optymalizacji wskaźników zakaźności w eksperymentach przedeksperymentalnych opartych na mikroskopii świetlnej oraz dostosowywania warunków eksperymentalnych do systemu biologicznego. Parametry optymalizacyjne obejmują liczbę komórek, wielokrotność infekcji (MOI) oraz punkty czasowe w zależności od wirusa i zdarzenia, które ma być obrazowane. Zapewni to wysoki udział wartościowych komórek w próbce.
Po drugie, wysokiej jakości przygotowanie próbek. Podkreślamy znaczenie wysokiej jakości przygotowania próbek. Obecnie uważamy witryfikację przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem za złoty standard dla grubych próbek, takich jak komórki. Zamrożenie, zanurzanie i późniejsze obrazowanie w temperaturze pokojowej to solidny sposób uzyskiwania wysokiej jakości wyników w połączeniu z tomografią STEM. Dlatego ustanowienie stabilnej rutyny przygotowywania próbek jest kluczowe. W związku z tym chcielibyśmy podkreślić literaturę dotyczącą zamarzania pod wysokim ciśnieniem14,21. Jeśli ma być stosowany mniej toksyczny roztwór zamrożenia i podstawienia, zalecamy stosowanie nadmanganianu potasu jako zamiennika czterotlenku osmu, jak opisują Schauflinger i in.36.
Na koniec, należy ustalić płynny przepływ pracy przy pozyskiwaniu serii pochyleń, w tym dobrze wyrównany mikroskop, zgodnie z instrukcjami użytkownika STEM i będzie się różnił w zależności od mikroskopu. Ustalenie płynnego przepływu zależy również od generatora skanowania oraz oprogramowania do akwizycji obrazów.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig1v3.jpg" /> 
Rysunek 1: Porównanie różnych technik mikroskopii 3D, biorąc pod uwagę rozdzielczość, instrumentację, czas akwizycji i wysiłek. Maksymalna dopuszczalna objętość techniki mieści się między technicznie wymagającą tomografią krio-TEM oferującą rozdzielczość molekularną, a mikroskopią świetlną, gdzie rozdzielczość jest ograniczona przez granicę dyfrakcyjną światła. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; STEM = skanujący TEM; SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; FIB = skupiona wiązka jonów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig1v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Struktury i systemy związane z wirusami obejmują skalę od reżimu subangstromowego (np. małe cząsteczki do wirusoterapii, izolowane białka wirusowe) do kilku metrów (np. całe zainfekowane organizmy). Cząstki wirusa mają zakres od 20 do 1000 nm i są badane głównie w kontekście biologicznym, takim jak komórki gospodarza i linie komórkowe producentów wirusów, które mieszczą się w zakresie μm. Wizualizacja konkretnych struktur związanych z wirusami zależy więc od wyboru techniki, która zapewnia wystarczające pole widzenia i odpowiednią rozdzielczość. Badanie komórek i fragmentów tkanek zakażonych wirusem opiera się na technikach mikroskopii (Rysunek 1). Podczas gdy obrazy przeglądowe komórek i tkanek można uzyskać za pomocą klasycznej mikroskopii świetlnej, struktury wewnątrzkomórkowe zaangażowane w replikację wirusów są często badane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). Chociaż obecnie EM jest głównie wykorzystywany w podstawowych badaniach wirusologicznych, jest również wykorzystywany w diagnostyce 1,2 i znalazł swoje miejsce w zastosowaniach biofarmaceutycznych3.
Często podejścia 2D EM, takie jak klasyczna transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), nie są w stanie wystarczająco odpowiedzieć na dane pytanie biologiczne. W wirusologii jest to szczególnie widoczne przy badaniu interakcji wirus-gospodarz-komórka, takich jak przyczepianie i wejście wirionu, tworzenie fabryk wirusów czy morfogeneza wirionów 4,5,6,7,8,9. Dlatego tomografia elektromagnetyczna jest wykorzystywana do analizy ultrastruktury 3D próbek biologicznych. W zasadzie istnieją dwa sposoby pozyskania tomogramu określonej próbki: 1) stopniowe obrazowanie wycinków szeregowych, które później są łączone w stos obrazów 3D, lub 2) pozyskiwanie projekcji z różnych kątów widzenia próbki, a następnie obliczeniowa rekonstrukcja informacji do wirtualnego stosu obrazów.
Techniki pierwszego typu obejmują obrazowanie przekrojów szeregowych za pomocą TEM lub SEM (tomografia matrycowa SEM), SEM z blokami szeregowymi oraz tomografię wiązki jonów skupionych (FIB)-SEM. Obrazowanie SEM i TEM przekrojów szeregowych nie ma rozdzielczości w z, która jest ograniczona grubością przekroju, ale zapewnia szerokie pole widzenia i opiera się na sprzęcie dostępnym w większości laboratoriów EM4. Tomografia FIB-SEM może zapewnić rozdzielczość izotropową, ale koszty urządzeń i utrzymania mogą być wyzwaniem, a obrazowanie całych komórek w rozdzielczości izotropowej jest czasochłonne 9,10.
Drugi typ tomografii opiera się wyłącznie na przepuszczaniu wiązki elektronów przez próbkę. Można to zrobić za pomocą dwóch różnych metod obrazowania: TEM lub skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). Chociaż tomografia TEM jest bardziej powszechna i łatwiejsza do wdrożenia, grubość przekroju jest ograniczona do ~200 nm. Dlatego struktury większe niż grubość przekroju, takie jak mitochondria, pęcherzyki czy wiriony, nie mogą być obrazowane w jednym tomogramie. Tomografia STEM umożliwia obrazowanie próbek o grubości do 1 μm 11,12. Jednak wymaga to STEM o wysokim napięciu przyspieszającym (≥200 kV) oraz konfiguracji obsługującej wysokie kąty nachylenia oraz niewielki półzbieżny kąt13. Chociaż obrazowanie STEM jest powszechną techniką w nauce o materiałach, pozostaje rzadką techniką w laboratoriach biologii EM.
Przedstawiamy tutaj podejście oparte na zastosowaniu, polegające na wykorzystaniu tomografii STEM dla okazów wirusologicznych. Ze względu na wysoką złożoność i pracochłonność tomografii EM, wysokiej jakości przygotowanie próbki jest kluczowe. Chociaż kriogeniczna TEM (tomografia) jest bez wątpienia złotym standardem badań na poziomie molekularnym, obrazowanie w temperaturze pokojowej komórek zamrożonych i zamrożeniowych zapewnia solidne zachowanie i przejrzystość ultrastruktury komórkowej 7,14. Krótko mówiąc, komórki przyczepne hodowane są na dysku szafirowym i infekowane lub leczone według uznania. Ogniwa są następnie unieruchamiane przez zamrożenie pod wysokim ciśnieniem przy bardzo wysokim tempie chłodzenia, co skutkuje zwitrzaniem wody wewnątrz. Następnie woda jest zastępowana rozpuszczalnikiem, podczas gdy próbki są kontrastowane i stopniowo przywracane do temperatury pokojowej. Próbki są następnie stopniowo osadzane w żywicy.
Istnieje wiele protokołów dotyczących zamrożenia pod wysokim ciśnieniem i podstawienia metodą zamrożenia, które różnią się maszynerią, systemem nośnikowym i składem próbki. Opublikowano szczegółowe protokoły zamrażania pod wysokim ciśnieniem, w tym jeden autorstwa Walthera i in.15 oraz protokół wideo Steyera i in.16, który koncentruje się na przygotowaniu tkanek do FIB-SEM z wykorzystaniem mikrofalowego wzmacniania kontrastu. Dla badań wirusologicznych Read i in.17 oraz Romero-Brey18 opublikowali szczegółowe protokoły przygotowania komórek zakażonych wirusem poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem za pomocą dysków szafirowych oraz późniejszą analizę za pomocą tomografii elektronowej. Ultracienkie przekrojowanie było również wcześniej opisane15,17. Więcej szczegółów na temat tych podejść można znaleźć w cytowanej literaturze.
Tutaj przedstawiamy workflow, który jest dostosowaną i zaktualizowaną wersją wcześniej opublikowanych protokołów15,17, po raz pierwszy połączoną z szczegółowym przewodnikiem wideo. Protokół zapewnia sposób przygotowania próbek z wykorzystaniem zamrożenia pod wysokim ciśnieniem, podstawienia zamrożenia oraz osadzania w żywicy epoksydowej. Przekroje o grubości 800 nm do 1000 nm są cięte ultramikrotomem. Seria tilt jest pozyskiwana za pomocą 200 kV STEM, korzystając z narzędzi programowych EM. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem komórek przylegających i zapewnia kompleksowy przepływ pracy, jednocześnie umożliwiając modyfikacje dla innych typów próbek, takich jak komórki tkankowe lub zawiesiny. W przypadku tomografii STEM w warunkach kriogenicznych odwołuj się do pracy grupy19,20 Michaela Elbauma.

<table><tbody><tr><td>1-Heksadecene</td><td>Merck KGaA</td><td>8220640500</td><td></td></tr><tr><td>200 miedziana siatka z równoległymi prętami</td><td>Plano GmbH</td><td>G2014C</td><td></td></tr><tr><td>37 i stopni; Komora susząca C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0323</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR international GmbH</td><td>20066330</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Diatome Ltd</td><td>https://www.diatomeknives.com/ultra-35</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812 Resin</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia EM</td><td>TVIPS GmbH</td><td>Oprogramowanie TVIPS: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00983.2511</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtrujący</td><td>VWR international GmbH</td><td>516-0812</td><td></td></tr><tr><td>Flaschen mit Schnappdeckelglas 11 mL</td><td>VWR international GmbH</td><td>548-0625</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15830-25</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka substytucyjna zamrażania Leica EM AFS2</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/</td><td></td></tr><tr><td>Glod Sol 25 nm</td><td>AURION Immuno Gold Reagenty & Akcesoria</td><td>425.011</td><td></td></tr><tr><td>Złoty pinhole i oslash; 2000 i mu; m</td><td>Science Services GmbH</td><td>GA2000-AU</td><td></td></tr><tr><td>Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupfer</td><td>Plano GmbH</td><td>NH6C</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>MEDAX GmbH & Kompania KG</td><td>12501</td><td></td></tr><tr><td>System wapowania wysokiego próżniowego BAF 300</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka wysokociśnieniowa Wohlwend HPF Compact 01</td><td>Biuro inżynieryjne M. Wohlwend GmbH</td><td>https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik ciekłego azotu</td><td>H.Erben GmbH</td><td>94500</td><td></td></tr><tr><td>Azot (płyn)</td><td>VWR international GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Czterotlenek osmu</td><td>ChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH</td><td>006051</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik 120 stopni i stopni; C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0194</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easi-Glow</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lizyna 0,1% z aq. Rozwiązanie</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18026</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 0,5 mL</td><td>Eppendorf SE</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki na próbki (kapsuły Beem)</td><td>Plano GmbH</td><td>G360-1</td><td></td></tr><tr><td>Szafirowy dysk o średnicy 3 x 0,16 mm</td><td>Biuro inżynieryjne M. Wohlwend GmbH</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom Leica EM UC7</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranilu</td><td>Riedel de Ha&euml; n AG</td><td>31697</td><td></td></tr><tr><td>Komora UV</td><td>Dinies</td><td>ELG100S</td><td></td></tr></tbody></table>

skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3d próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Scanning Transmission Electron Microscopy Tomography in Virology: 3D Imaging of High-pressure Frozen, Freeze-substituted Samples

Mikroskopia elektronowa (EM), a zwłaszcza techniki trójwymiarowe (3D) EM, stały się uznanymi metodami w wirusologii strukturalnej. Badania zmian ultrastruktury komórkowej wywołanych przez wirusa, takich jak fabryki replikacji indukowane wirusem Zika (ZIKV) czy organelle replikacyjne koronawirusa, wymagają obrazowania 3D. Tomografia transmisyjna mikroskopii elektronowej (TEM) jest szeroko stosowaną metodą, mimo ograniczenia do próbek o grubości do 200 nm. Skupiona mikroskopia elektronowa (SEM) z wiązką jonów (SEM) może uzyskać dane 3D o większych objętościach z izotropową, choć zazwyczaj o niższej rozdzielczości. Do obrazowania większych objętości stosuje się alternatywne techniki, takie jak blokowa mikroskopia elektronowa skanująca twarz (BF-SEM), tomografia matrycowa SEM czy obrazowanie TEM przekrojów szeregowych. Jednak w porównaniu z wcześniej wymienionymi technikami, te techniki odbywają się znacznie niższą rozdzielczością wzdłuż osi Z próbki. Techniką dostarczającą informacje 3D o próbkach o grubości do 1 μm z izotropową rozdzielczością kilku nanometrów jest tomografia skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM).
Przedstawiamy tutaj protokół przygotowania próbek wirusologicznych mrożonych pod wysokim ciśnieniem, zamienionych przez zamrożenie i żywicę oraz ich analizę za pomocą tomografii STEM. Protokół ten korzysta z zalet obrazowania w temperaturze pokojowej, jednocześnie zachowując ultrastrukturę biologiczną w stanie bliskim naturalnym. Przedstawiamy dwa reprezentatywne przykłady pytań, na które można odpowiedzieć za pomocą tomografii STEM. Najpierw stosujemy protokół do badania morfogenezy wirionów wirusa wirusa szparkowego (VSV). Tomogramy STEM dostarczają informacji o rekombinowanym pączkowaniu VSV, które w innym przypadku nie byłyby dostępne za pomocą obrazowania 2D. Po drugie, pokazujemy korelacyjne mikroskopię światła i elektronów (CLEM) za pomocą obrazowania rezonansowego transferu energii Foerster (FRET) oraz tomografii STEM (FRET-3D-CLEM) nanofibril peptydowych EF-C. Ta niedawno opublikowana kombinacja dostarcza nowych informacji na temat przyjmowania i demontażu nanofibryli peptydowych wzmacniających infekcje, szczególnie korzystając z dużej objętości dostępnej dzięki tomografii STEM.

Tomografia STEM umożliwia obrazowanie grubszych przekrojów niż tomografia TEM z izotropową rozdzielczością w zakresie nanometrów i – w porównaniu do tomografii FIB-SEM – zapewnia stosunkowo efektywny w czasie proces obrazowania. W wirusologii jest to szczególnie przydatne, ponieważ pozwala na obrazowanie dużej liczby cech ultrastrukturalnych do analizy statystycznej w 3D lub podczas poszukiwania rzadkich zdarzeń. Tutaj przedstawiamy dwa reprezentatywne wyniki, które pokazują, jak tomografia STEM może być wykorzystywana w odniesieniu do tych dwóch aspektów.
Wizualizacja pączkujących rekombinowanych wirionów VSV
Istnieje wiele wirusów, które tworzą cząstki o różnych kształtach i rozmiarach. Aby przeanalizować kształt wirionów w zawiesinie wirusowej, często wystarczy prosta metoda, taka jak TEM z negatywnym barwieniem. Scharakteryzowanie morfologii wirionów w kontekście komórkowym jest trudniejsze. Dotyczy to szczególnie wirusów tworzących cząstki o morfologii anizotropowej, takich jak rhabdoviridae. VSV to rabdowirus, który tworzy wiriony w kształcie pocisków o długości ~180 nm. W komórkach zawiesinowych wiriony są losowo ułożone, co utrudnia zawsze rozpoznanie kształtu pocisku na obrazach 2D (rysunek 5A-C). Aby prawidłowo zdefiniować kształt pocisku wszystkich rekombinowanych wirionów VSV w próbce, potrzebna jest metoda 3D o rozdzielczości izotropowej – taka, która może również dostarczyć informacji wolumetrycznych na wystarczająco dużym obszarze próbki. Tomogram STEM może zawierać wiele kompletnych wirionów w jednym zbiorze danych (rysunek 5D,E). Dzięki temu możliwe jest obrazowanie dużej liczby wirionów do analizy statystycznej, nawet jeśli uzyskano tylko jeden tomogram na komórkę. Dla porównania, tomogram TEM przekroju o grubości 200 nm uchwyciłby tylko kilka pełnych rekombinowanych wirionów VSV (jak zaznaczono na Rysunku 5E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Tomografia STEM miejsc pączkowania rekombinowanych VSV. (A-C) Szczegóły z wirtualnego przekroju tomogramu STEM uzyskanego z przekroju o grubości 800 nm pokazują, że kształt pocisku nie zawsze jest widoczny z powodu (A,B) różnych orientacji wirionów. (C) Tylko wiriony ustawione równolegle do płaszczyzny widzenia występują jako dobrze zdefiniowane pociski. (D) Miejsca pączkowania rekombinowanego VSV przypominają duże skupiska wirionów bez preferowanej orientacji. (E) Widok boczny tomogramu pokazuje zdolność do uchwycenia wielu kompletnych rekombinowanych wirionów VSV w jednym przekroju za pomocą tomografii STEM. Wirtualny stos obrazów ma grubość około 600 nm w tej pozycji. Linie przerywane reprezentują przybliżoną grubość przekroju w tomografii TEM (200 nm), gdzie uwzględniałoby tylko kilka kompletnych wirionów w kształcie pocisku. Pasek skali = 500 nm (D). Skróty: STEM = skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa; VSV = wirus zapalenia szparków pęcherzykowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Degradacja nanofibrylów peptydowych EF-C
W kontekście terapii genowej nanofibrile peptydowe wzmacniające transdukcję stały się tematem zainteresowania. W niedawno opublikowanym badaniu24 zastosowano obrazowanie korelacyjne z wykorzystaniem obrazowania Foerster Resonance Energy Transfer (FRET) oraz tomografii STEM (FRET-3D-CLEM) do badania pobierania i rozkładania nanofibril peptydowych EF-C. Wysoka sprawność FRET, odpowiadająca parom FRET blisko siebie, emitują czerwoną fluorescencję odpowiadającą złożonym włókniom. Niska sprawność FRET, odpowiadająca parom FRET oddalonym od siebie, emitują zieloną fluorescencję, reprezentującą rozłożone włókna. Oba sygnały pojawiają się w komórkach podczas przyjmowania i rozkładu nanofibryli peptydowych EF-C. Obszary, gdzie występują wysokie i niskie efektywności FRET, są oznaczone na żółto (Rysunek 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig6v2.jpg" /> 
Rysunek 6: Obrazowanie degradacji nanofibryl peptydów EF-C za pomocą korelacyjnego obrazowania FRET i tomografii STEM (FRET-3D-CLEM). (A) Mikroskopia konfokalna komórki inkubowanej z nanofibrilami EF-C oznaczonymi parą FRET. Sygnały zielone odpowiadają rzekomo rozmontowanym włókniom. Czerwony odpowiada rzekomo nienaruszonym włókniom. Żółty odpowiada obszarom, gdzie wykrywana jest mieszanka sygnału czerwonego i zielonego. Nucleus. (B) Przegląd STEM przekroju o grubości 800 nm z tej samej komórki. (C) Wskazana jest pozycja tomogramu. Obraz jest kompozycją dwóch obrazów uzyskanych na różnych przekrojach, ponieważ komórka była częściowo zablokowana przez siatkę kresków na jednej z sekcji. Jądro jest oznaczone Nu w literach A, B i C. (C) Wirtualny przekrój z tomogramu. Czerwone grotki strzałek oznaczają obszary nakładające się na czerwone sygnały fluorescencji. Tomografia STEM potwierdza obecność nienaruszonych włókien. Zielony grot strzałki wskazuje na obszar z rozłożonymi włóknami. (D) Segmentacja tomogramu. Endocytowany filopodium ściska błonę pęcherzyka (biała strzałka). Duża objętość, którą można zbadać za pomocą tomogramu STEM (tutaj około 7 μm x 7 μm x 550 nm), ułatwia obserwację tak rzadkiego zdarzenia. (E) Wirtualne sekcje 19, 24 i 29 tomogramu. Przy rozmiarze piksela 6,8 nm, sekcje są oddalone od siebie o 27,2 nm. Figura została zaczerpnięta z danych opublikowanych przez Rauch-Wirth i in.24 . Paski skalowe = 5 μm (A), 1 μm (C). Skróty: STEM = skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa; FRET = Transfer energii rezonansu Foerstera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Wizualizacja została przeprowadzona tym podejściem korelacyjnym, aby potwierdzić, że włókna EF-C są przyjmowane przez komórkę i następnie degradowane. Mikroskopia świetlna pozwala nam wybrać komórki do mikroskopii elektronowej, które dostarczają sygnały czerwone i zielone, aby porównać wygląd ultrastrukturalny korelujący z różnymi sygnałami fluorescencji. Tomogramy STEM z tej samej komórki pokazują, że sygnał czerwony może pochodzić albo z włókien, które wciąż znajdują się poza komórką, albo być świeżo zinternalizowany przez makropinocytozę (rysunek 6C). Ponadto CLEM potwierdził, że sygnał zielony rzeczywiście pochodzi z rozłożonych włókien (rysunek 6B,C, który można znaleźć w lizosomach (rysunek 6C, największa pęcherzyk). Dzięki dużej objętości dostępnej za pomocą tomografii STEM oraz wizualizacji 3D struktur, łatwiej jest korelować sygnał z mikroskopii świetlnej z cechami ultrastrukturalnymi i interpretować je. Ponadto można wykryć rzadkie zjawiska, takie jak ściskanie filopodów wewnątrz lizosomu (rysunek 6D, E, biała strzałka), dzięki temu podejściu.

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Electron microscopy (EM) and especially three-dimensional (3D) EM techniques have become established methods in structural virology. Investigation of ...

Zakażenie wirusowe może powodować znaczące zmiany w infrastrukturze komórkowej. Aby zobrazować te zmiany w trzech wymiarach, stosujemy tomografię STEM do obrazowania komórek zakażonych wirusem. Tomografia STEM jest czasochłonna i wymaga dużo pracy.To sprawia, że optymalne przygotowanie próbek jest niezbędne do próbek biologicznych, takich jak zestawy zakażone wirusem. Tradycyjna tomografia STEM ogranicza się do chorób próbek o długości około 200 nanometrów. Nasz protokół umożliwia obrazowanie 3D grubszych przekrojów.Pozwala to na bardziej kompleksową wizualizację komórek zakażonych wirusem oraz ultrastrukturalnych zmian. Wiele wirusów onkolitycznych to już pierwotnie badania kliniczne, dlatego badacze i twórcy na całym świecie współpracują, a nauka przesuwa granice leczenia nowotworów, a nowoczesne metody, takie jak mikroskopia elektronowa i tomografia STEM, wnoszą nowe wnioski. Będziemy nadal odpowiadać na pytania wirusologiczne, stosując tomografię STEM i łącząc ją z nowymi protokołami przygotowawczym oraz innymi technikami mikroskopowymi.Na początek napełnij pudełko LN-środka ciekłym azotem w przygotowaniu do obsługi i przeniesienia zamrożonych szafirowych dysków z uchwytu wysokociśnieniowego (HPF) do kapsuł magazynowych. Trzymaj pod ręką dewar wypełniony ciekłym azotem, aby uzupełnić pojemnik LN-box w razie potrzeby podczas procesu zamrażania. Miej przy sobie parę izolowanych pęset.Przygotuj pojemniki na próbki, które po HPF pomieścią szafirowe dyski. Upewnij się, że mają pokrywkę i kilka otworów na wlewanie ciekłego azotu oraz małe ciężarki, aby nie unosiły się na powierzchnię. Włóż pojemnik z etykietami do pudełka LN, aby wstępnie ostygł przed użyciem.Następnie umieść próbki w inkubatorze. Przed rozpoczęciem zamrożenia pod mikroskopem świetlnym z odwróconym światłem obejrzyj szafirowe dyski, aby upewnić się, że jest wystarczająco dużo komórek i dobra jakość komórek. Aby wykonać HPF, weź jeden dysk szafirowy z misy hodowlanej i szybko natrzyj go na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar medium.Umieść dysk w uchwytie HPF tak, że bok pokryty węglem jest skierowany do góry, aby upewnić się, że numer dwa jest czytelny. Zanurz złotą dystansę w heksadekanie i delikatnie umieść ją na szafirowym dysku. Umieść drugi dysk szafirowy na górze dystansu, z bokiem pokrytym węglem skierowanym w dół, tworząc konfigurację kanapkową z ogniwami skierowanymi do siebie i upewnij się, że nie ma uwięzienia powietrza.Zamknij uchwyt HPF ostrożnie i szybko, aby zmniejszyć obciążenie próbki. Włóż uchwyt HPF do zamrażarki wysokociśnieniowej. Zamknij go zgodnie z instrukcjami producenta i rozpocznij proces zamrażania.Następnie przenieś uchwyt HPF do dekodera LN. Następnie przenieś końcówkę z szafirowymi dyskami do pudełka LN do przedchłodzenia. Ostrożnie wyjmij dyski z uchwytu.Umieść zamknięte fiolki kriogeniczne wypełnione roztworem swobodnego podstawienia do urządzenia do wolnego urządzenia podstawiowego, wstępnie schłodzonego do minus 90 stopni Celsjusza. Poczekaj, aż roztwór osiągnie tę samą temperaturę. Wstępnie schładzać pęsetę, skalpel i szczypce lub duże pęsety, zanurzając je w ciekłym azocie do przenoszenia szafirowych dysków.Przenieś próbki zamrożone pod wysokim ciśnieniem do urządzenia do wolnej substytucji. Oddziel szafirowe dyski pojedynczo, trzymając je w ciekłym azocie. I szybko przenieś każdy dysk osobno do fiolki kriogenicznej z roztworem swobodnego podstawiania, zapewniając pełne zanurzenie dysku.Po zamknięciu fiolki kriogenicznej natychmiast włóż ją z powrotem do wolnego urządzenia substytucyjnego. Gdy wszystkie próbki zostaną umieszczone, rozpocznij proces podstawiania. Gdy tylko próbki osiągną 20 stopni Celsjusza.Kontynuuj mycie próbek trzy razy przez 30 minut z 100% acetonem. Aby próbki wstępnie zanurzić, inkubuj je w jednej trzeciej żywicy epoksydowej i dwóch trzecich acetonu przez godzinę. Po wybiwaniu próbek z dwoma trzecimi żywicy epoksydowej i jedną trzecią acetonem przez godzinę, wymień roztwór z żywicą 100% epoksydową i inkubuj przez noc z otwartą pokrywką fiolki, aby pozostała aceton mogła odparować następnego dnia, a następnie przenieść płyty szafirowe do nowych, oznakowanych probówek reakcyjnych wypełnionych świeżo przygotowaną żywicą epoksydową.Umieść dyski poziomo podparte przez ściankę rurki, tak aby strona z komórkami była skierowana do góry. Następnie umieszczaj probówki reakcyjne z otwartymi pokrywkami w piekarniku ustawionym na 60 stopni Celsjusza i pozwól żywicy polimeryzować przez co najmniej 48 godzin. Po polimeryzacji żywicy epoksydowej zanurz końcówkę zamkniętej rurki reakcyjnej w ciekłym azocie na około 10 sekund.Uderz rurką reakcyjną o stół, żeby uwolnić blok żywicy. Szafirowy dysk łatwo oddziela się od warstwy węglowej, która pozostaje przyczepiona do osadzonych komórek. Wybierz obszar zainteresowania w osadzonej próbce i zawęż rozmiar próby do obszaru zainteresowania.Używając ultramikrotonu z nożem z diamentem, zbieraj przekroje o grubości około jednego mikrometra na siatce równoległej z naładowanym Poly-L-lizyną glotus do obrazowania STEM i tomografii STEM. Należy stosować fragmenty złotem koloidalnym jako znaki fiducial i nałożyć powłokę węglową. Po wycięciu i inspekcji ultracienkich przekrojów próbki są gotowe do obrazowania.Na podstawie pytania badawczego można wstawić detektor jasnego pola, detektor ciemnego pola lub oba. Aktywuj tryb skanowania i pobierz obraz testowy próbki. Wybierz powiększenie większe niż 800 000 razy, co jest większe niż docelowe pożądane powiększenie.W pobliżu interesującego obszaru dostosuj ostrość i skoryguj astygmatyzm, unikając bezpośredniej ekspozycji wiązki na krytyczne obszary próbki. Ustaw wysokość ekscentryczną tak, aby obszar zainteresowania, czyli zwrot z inwestycji, pozostał wyśrodkowany przez cały zakres nachylenia. Wybierz element blisko zwrotu z inwestycji, przybliż go do środka, skup się, skoryguj astygmatyzm i przechyl scenę stopniowo do minus 72 stopni.Aby wybrać pole widzenia, wróć do zwrotu z inwestycji, wyostrz je i zrób obraz przeglądowy. Ustaw docelowe powiększenie pożądane dla serii tilt. Ustaw automatyczne przechwytywanie zdjęć z serią pochyleń, w zakresie od minus 72 stopni do plus 72 stopni oraz obraz co 1,5 stopnia.Rozpocznij automatyczne pozyskiwanie serii tilt. Reprezentatywne wirtualne fragmenty termogramu STEM ilustrowały, jak orientacja wirionów wpływa na widoczność charakterystycznego kształtu pocisku w widokach dwuwymiarowych. Tylko wiriony ustawione równolegle do płaszczyzny widokowej miały pełną, dobrze zdefiniowaną morfologię pocisku, podczas gdy inne były okrągłe lub wydłużone, w zależności od kąta nachylenia.Aby przezwyciężyć ograniczenia orientacji obrazowania 2D, użyto tomografii STEM do uchwycenia dużych skupisk wironu wirusa wirusa pęcherzykowego pęcherzyka szparkowego, co umożliwiło ocenę kształtu wirionu w trzech wymiarach bez efektu kierunkowego. Widok z boku termogramu potwierdził wolumetryczną przewagę tomografii STEM uchwycającej wiele kompletnych wirionów w jednym przekroju o grubości 600 nanometrów, w przeciwieństwie do ograniczonego próbkowania możliwego przy 200-nanometrowym przekroju TEM.

scanning-transmission-electron-microscopy-tomography-virology-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj skaningową transmisyjną tomografię elektronową w wirusologii. Naucz się przygotowywać próbki metodą zamrażania pod wysokim ciśnieniem i substytucji zamrożonej, aby uzyskać obrazy 3D komórek zakażonych wirusami.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem (Wideo) | JoVE Journal

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Przeglądaj więcej filmów