Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Zakażenie wirusowe może powodować znaczące zmiany w infrastrukturze komórkowej. Aby zobrazować te zmiany w trzech wymiarach, stosujemy tomografię STEM do obrazowania komórek zakażonych wirusem. Tomografia STEM jest czasochłonna i wymaga dużo pracy.

To sprawia, że optymalne przygotowanie próbek jest niezbędne do próbek biologicznych, takich jak zestawy zakażone wirusem. Tradycyjna tomografia STEM ogranicza się do chorób próbek o długości około 200 nanometrów. Nasz protokół umożliwia obrazowanie 3D grubszych przekrojów.

Pozwala to na bardziej kompleksową wizualizację komórek zakażonych wirusem oraz ultrastrukturalnych zmian. Wiele wirusów onkolitycznych to już pierwotnie badania kliniczne, dlatego badacze i twórcy na całym świecie współpracują, a nauka przesuwa granice leczenia nowotworów, a nowoczesne metody, takie jak mikroskopia elektronowa i tomografia STEM, wnoszą nowe wnioski. Będziemy nadal odpowiadać na pytania wirusologiczne, stosując tomografię STEM i łącząc ją z nowymi protokołami przygotowawczym oraz innymi technikami mikroskopowymi.

Na początek napełnij pudełko LN-środka ciekłym azotem w przygotowaniu do obsługi i przeniesienia zamrożonych szafirowych dysków z uchwytu wysokociśnieniowego (HPF) do kapsuł magazynowych. Trzymaj pod ręką dewar wypełniony ciekłym azotem, aby uzupełnić pojemnik LN-box w razie potrzeby podczas procesu zamrażania. Miej przy sobie parę izolowanych pęset.

Przygotuj pojemniki na próbki, które po HPF pomieścią szafirowe dyski. Upewnij się, że mają pokrywkę i kilka otworów na wlewanie ciekłego azotu oraz małe ciężarki, aby nie unosiły się na powierzchnię. Włóż pojemnik z etykietami do pudełka LN, aby wstępnie ostygł przed użyciem.

Następnie umieść próbki w inkubatorze. Przed rozpoczęciem zamrożenia pod mikroskopem świetlnym z odwróconym światłem obejrzyj szafirowe dyski, aby upewnić się, że jest wystarczająco dużo komórek i dobra jakość komórek. Aby wykonać HPF, weź jeden dysk szafirowy z misy hodowlanej i szybko natrzyj go na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar medium.

Umieść dysk w uchwytie HPF tak, że bok pokryty węglem jest skierowany do góry, aby upewnić się, że numer dwa jest czytelny. Zanurz złotą dystansę w heksadekanie i delikatnie umieść ją na szafirowym dysku. Umieść drugi dysk szafirowy na górze dystansu, z bokiem pokrytym węglem skierowanym w dół, tworząc konfigurację kanapkową z ogniwami skierowanymi do siebie i upewnij się, że nie ma uwięzienia powietrza.

Zamknij uchwyt HPF ostrożnie i szybko, aby zmniejszyć obciążenie próbki. Włóż uchwyt HPF do zamrażarki wysokociśnieniowej. Zamknij go zgodnie z instrukcjami producenta i rozpocznij proces zamrażania.

Następnie przenieś uchwyt HPF do dekodera LN. Następnie przenieś końcówkę z szafirowymi dyskami do pudełka LN do przedchłodzenia. Ostrożnie wyjmij dyski z uchwytu.

Umieść zamknięte fiolki kriogeniczne wypełnione roztworem swobodnego podstawienia do urządzenia do wolnego urządzenia podstawiowego, wstępnie schłodzonego do minus 90 stopni Celsjusza. Poczekaj, aż roztwór osiągnie tę samą temperaturę. Wstępnie schładzać pęsetę, skalpel i szczypce lub duże pęsety, zanurzając je w ciekłym azocie do przenoszenia szafirowych dysków.

Przenieś próbki zamrożone pod wysokim ciśnieniem do urządzenia do wolnej substytucji. Oddziel szafirowe dyski pojedynczo, trzymając je w ciekłym azocie. I szybko przenieś każdy dysk osobno do fiolki kriogenicznej z roztworem swobodnego podstawiania, zapewniając pełne zanurzenie dysku.

Po zamknięciu fiolki kriogenicznej natychmiast włóż ją z powrotem do wolnego urządzenia substytucyjnego. Gdy wszystkie próbki zostaną umieszczone, rozpocznij proces podstawiania. Gdy tylko próbki osiągną 20 stopni Celsjusza.

Kontynuuj mycie próbek trzy razy przez 30 minut z 100% acetonem. Aby próbki wstępnie zanurzić, inkubuj je w jednej trzeciej żywicy epoksydowej i dwóch trzecich acetonu przez godzinę. Po wybiwaniu próbek z dwoma trzecimi żywicy epoksydowej i jedną trzecią acetonem przez godzinę, wymień roztwór z żywicą 100% epoksydową i inkubuj przez noc z otwartą pokrywką fiolki, aby pozostała aceton mogła odparować następnego dnia, a następnie przenieść płyty szafirowe do nowych, oznakowanych probówek reakcyjnych wypełnionych świeżo przygotowaną żywicą epoksydową.

Umieść dyski poziomo podparte przez ściankę rurki, tak aby strona z komórkami była skierowana do góry. Następnie umieszczaj probówki reakcyjne z otwartymi pokrywkami w piekarniku ustawionym na 60 stopni Celsjusza i pozwól żywicy polimeryzować przez co najmniej 48 godzin. Po polimeryzacji żywicy epoksydowej zanurz końcówkę zamkniętej rurki reakcyjnej w ciekłym azocie na około 10 sekund.

Uderz rurką reakcyjną o stół, żeby uwolnić blok żywicy. Szafirowy dysk łatwo oddziela się od warstwy węglowej, która pozostaje przyczepiona do osadzonych komórek. Wybierz obszar zainteresowania w osadzonej próbce i zawęż rozmiar próby do obszaru zainteresowania.

Używając ultramikrotonu z nożem z diamentem, zbieraj przekroje o grubości około jednego mikrometra na siatce równoległej z naładowanym Poly-L-lizyną glotus do obrazowania STEM i tomografii STEM. Należy stosować fragmenty złotem koloidalnym jako znaki fiducial i nałożyć powłokę węglową. Po wycięciu i inspekcji ultracienkich przekrojów próbki są gotowe do obrazowania.

Na podstawie pytania badawczego można wstawić detektor jasnego pola, detektor ciemnego pola lub oba. Aktywuj tryb skanowania i pobierz obraz testowy próbki. Wybierz powiększenie większe niż 800 000 razy, co jest większe niż docelowe pożądane powiększenie.

W pobliżu interesującego obszaru dostosuj ostrość i skoryguj astygmatyzm, unikając bezpośredniej ekspozycji wiązki na krytyczne obszary próbki. Ustaw wysokość ekscentryczną tak, aby obszar zainteresowania, czyli zwrot z inwestycji, pozostał wyśrodkowany przez cały zakres nachylenia. Wybierz element blisko zwrotu z inwestycji, przybliż go do środka, skup się, skoryguj astygmatyzm i przechyl scenę stopniowo do minus 72 stopni.

Aby wybrać pole widzenia, wróć do zwrotu z inwestycji, wyostrz je i zrób obraz przeglądowy. Ustaw docelowe powiększenie pożądane dla serii tilt. Ustaw automatyczne przechwytywanie zdjęć z serią pochyleń, w zakresie od minus 72 stopni do plus 72 stopni oraz obraz co 1,5 stopnia.

Rozpocznij automatyczne pozyskiwanie serii tilt. Reprezentatywne wirtualne fragmenty termogramu STEM ilustrowały, jak orientacja wirionów wpływa na widoczność charakterystycznego kształtu pocisku w widokach dwuwymiarowych. Tylko wiriony ustawione równolegle do płaszczyzny widokowej miały pełną, dobrze zdefiniowaną morfologię pocisku, podczas gdy inne były okrągłe lub wydłużone, w zależności od kąta nachylenia.

Aby przezwyciężyć ograniczenia orientacji obrazowania 2D, użyto tomografii STEM do uchwycenia dużych skupisk wironu wirusa wirusa pęcherzykowego pęcherzyka szparkowego, co umożliwiło ocenę kształtu wirionu w trzech wymiarach bez efektu kierunkowego. Widok z boku termogramu potwierdził wolumetryczną przewagę tomografii STEM uchwycającej wiele kompletnych wirionów w jednym przekroju o grubości 600 nanometrów, w przeciwieństwie do ograniczonego próbkowania możliwego przy 200-nanometrowym przekroju TEM.