Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Nasze laboratorium ma na celu strukturalne i biochemiczne scharakteryzowanie konserwatywnej endonukleazy występującej w nidowirusach, w tym koronawirusach, w celu opracowania modelu ewolucyjnego i zapewnienia podstawy dla celów terapeutycznych. Nukleazy mogą być trudne do ekspresji w systemach E. coli ze względu na aktywność enzymatyczną na komórkowym DNA lub RNA, co może skutkować powolnym wzrostem i słabą wydajnością białka. Nasze odkrycie pozwoli nam oczyścić toksyczne nukleazy z innych nidowirusów w celu przeprowadzenia dalszych badań biochemicznych i strukturalnych.

Na początek użyj jednej 50-mililitrowej wysterylizowanej kolby Erlenmeyera na każdy litr kultury i przygotuj dwie do trzech dodatkowych kolb jako kultury starterowe. Oznaczyć jedną z kolb gwiazdą, aby oznaczyć ją do kontroli gęstości optycznej, ponieważ jej pomiary będą reprezentować cały wzrost, chyba że istnieje wizualna różnica między kolbami. Za pomocą cylindra z podziałką przygotuj mieszankę główną, łącząc 60 mililitrów pożywki 2X TY i 60 mikrolitrów roztworu podstawowego ampicyliny rozmrożonego od minus 20 stopni Celsjusza.

Delikatnie zamieszać mieszaninę, aby połączyć i porcjować 10 mililitrów mieszanki wzorcowej do każdej kolby Erlenmeyera. Teraz wyjmij przekształconą płytkę agarową z inkubatora. Za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety oderwać pojedynczą izolowaną kolonię z płytki i przenieść ją bezpośrednio do kolby zawierającej podłoże.

Powtarzaj tę procedurę, aż każda kolba będzie zawierała wykałaczkę zaszczepioną kolonią. Umieścić zaszczepione kolby w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 210 obrotów na minutę i 37 stopni Celsjusza przez około pięć do siedmiu godzin. Aby sprawdzić gęstość optyczną przy 600 nanometrach, użyj pipety serologicznej, aby usunąć jeden mililitr pożywki z kolby oznaczonej gwiazdką.

Kontynuuj okresowe sprawdzanie, aż gęstość optyczna osiągnie zakres od 0,8 do 1,0. Po osiągnięciu docelowej gęstości optycznej dodać jeden mililitr jednego molowego roztworu IPTG rozmrożonego z minus 20 stopni Celsjusza do każdej kolby, aby wywołać nadekspresję białka. Następnie przenieś dwulitrowe kolby do inkubatora z wytrząsaniem ustawionego na 210 obrotów na minutę i 16 stopni Celsjusza w celu indukcji przez noc przez 14 do 16 godzin.

Ponownie zawiesić osad bakteryjny, dodając dwa mililitry buforu do lizy na każde 1,2 grama osadu. Dodaj 100 mikrolitrów jednego molowego AESBF na każde 10 mililitrów buforu do lizy jako inhibitor proteazy. Jeśli używasz osadu połączonego z czterech litrów kultury, wymieszaj go ze 100 mikrolitrami DNazy I, aby uzyskać końcowe stężenie 200 jednostek.

Po wirowaniu przez 30 sekund przenieś mieszaninę wirową do młynka do tkanek Dounce i użyj luźnego tłuczka do homogenizacji próbki za pomocą około 10 pociągnięć. Następnie przenieś homogenizowaną próbkę do metalowej zlewki w celu sonikacji. Aby zmaksymalizować odzysk próbki, przepłucz oryginalną probówkę z granulkami pięcioma mililitrami buforu do lizy i krótko przekręć wir.

Wlej płukankę do homogenizatora Dounce, zastosuj około pięciu pociągnięć tłuczkiem i przenieś zawartość do zlewki sonikacyjnej. Dodaj 75 mikrolitrów Triton X-100 do metalowej zlewki, aby wspomóc lizę membrany i solubilizację. Umieść metalową zlewkę w łaźni lodowej, aby utrzymać próbkę w niskiej temperaturze podczas sonikacji.

Teraz włóż sondę sonikacyjną do metalowej zlewki i sonikuj próbkę przez sześć minut i 30 sekund, z impulsami co dwie sekundy i amplifikacją ustawioną na 70% Następnie, za pomocą pipety serologicznej, przenieś lizat do probówki wirówkowej. Dodać jeden molowy AEBSF w rozcieńczeniu 1 do 100 do tej samej probówki, co świeży inhibitor proteazy i odwirować próbkę przy 26,915 G przez 50 minut w celu sklarowania lizatu. Po przeprowadzeniu chromatografii powinowactwa przez filtrację grawitacyjną, eluować białko nsp15 znakowane Hisem w trzech etapach, przy czym pierwsza i druga elucja powinny być użyte przy użyciu dwóch mililitrów buforu elucyjnego, a trzecia przy użyciu jednego mililitra.

Przygotuj rozcieńczenie odczynnika Bradforda w wodzie jeden do jednego, aby uzyskać szybki jakościowy test białka. Przenieś 10 mikrolitrów z każdej elucji do oddzielnych probówek i delikatnie odwróć do wymieszania. Oceń zmianę koloru na niebieski, aby oszacować zawartość białka i zdecydować, jak odpowiednio połączyć elutiony.

Po okresie rozszczepienia, za pomocą pipety serologicznej, nanieść mieszaninę reakcyjną rozszczepienia zawierającą poprzedni eluent bezpośrednio na żywicę i zebrać eluent do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Umyj żywicę dwukrotnie dwoma mililitrami bufora do rozszczepienia, zbierając oba popłuczyny do tej samej 15-mililitrowej tubki. Dodaj AEBSF do tej probówki, aby wygasić trombinę i osiągnąć końcowe stężenie 10 milimolów.

Na koniec przenieś całą ponownie przekazaną próbkę do nowego koncentratora odcięcia masy cząsteczkowej o masie cząsteczkowej 30 kilodaltonów. Odwirować próbkę o sile 3000 G przez 10 minut, aby zmniejszyć objętość do 500 mikrolitrów lub mniej, a następnie przenieść skoncentrowaną próbkę białka do 0,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Ekspresja dzikiego typu nsp15 w Escheria coli spowodowała powolny wzrost komórek z przybliżonym czasem podwojenia wynoszącym jedną godzinę, podczas gdy katalityczny martwy mutant wykazywał normalny czas podwojenia wynoszący około 20 minut.

Podczas oczyszczania powinowactwa na torze elucji pojawiło się wyraźne pasmo odpowiadające dzikiemu typowi nsp15, co wskazuje na udaną izolację, pomimo niskiej ekspresji. Katalityczny martwy nsp15 jest również eluowany jako silne pojedyncze pasmo, co wskazuje na wysoką wydajność. Rozszczepienie trombiny zmniejszyło masę cząsteczkową nsp15 o około dwa kilodaltony, potwierdzając udane usunięcie znacznika His.

Chromatografia wykluczania wielkości dzikiego nsp15 wykazała dwa piki, przy czym pik 11 mililitrów odpowiadał aktywnej formie heksameerycznej, a pik 15 mililitrów nieaktywnej formie monomerycznej. W teście rozszczepienia RNA opartym na fluorescencji tylko heksameryczny dziki typ nsp15 wykazywał widoczną degradację RNA w czasie, podczas gdy monomeryczny typ dziki i wszystkie formy katalitycznego martwego nsp15 pozostały nieaktywne.