Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową
14 listopada 2025
Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.
Skupiamy się na biologii specjalnej, aby lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy raka jajnika, z nadzieją na znalezienie nowych celów terapeutycznych i biomarkerów przewidujących przeżycie pacjentów. Jednym z obecnych wyzwań IMC jest sekcja białka o niższej obsadności, praca związana z walidacją i miareczkowaniem przeciwciał, a także złożona i czasochłonna klasyfikacja pikseli podczas analizy. Zacznij od usunięcia nadmiaru płynu z przygotowanych szkiełek FFPE.
Wyjmij blachę do kontroli wilgotności z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy. Następnie dokładnie przeszukaj vortex RNA-ISH Amplifier 3 i dodaj tyle reagenta, by całkowicie pokryć każdą sekcję tkanki na szkiełkach. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 stopniach Celsjusza.
Podczas inkubacji przygotuj mieszankę oligonukleotydów metalu, rozcieńczając każdy oligometryk w proporcji jeden do 15. Dokładnie wymieszaj metal-oligo i pozostaw w temperaturze pokojowej do dalszego użycia. Teraz wyjmij tacę do kontroli wilgotności z piekarnika.
Wyjmij uchwyt na suwak z blachy i włóż blachę z powrotem do piekarnika. Następnie umieść szkiełka w przezroczystym uchwytie na preparaty, które zostało wcześniej umyte wodą wolną od nukleazy. Myj szkiełka w buforze do prania przy lekkim poruszeniu przez dwie minuty.
Po usunięciu nadmiaru płynu ze szkiełek wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika i włóż uchwyt na zasuwkę do blachy. Dodaj oligonukleotydy z mieszanką metali przygotowane wcześniej, aby całkowicie pokryć każdą część tkanki. Teraz całkowicie zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 45 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Wyjmij tacę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego, wyjmij uchwyt na suwak i wróć pustą blachę do piekarnika. Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, dodaj wystarczającą objętość buforu blokującego, aby całkowicie pokryć każdy fragment tkanki na szkiełku, i inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Podczas inkubacji preparatów przygotuj mieszankę przeciwciał, rozcieńczając je za pomocą buforu rozcieńczającego przeciwciała.
Po zakończeniu inkubacji usuń bufor z tkanek i podasz wystarczającą ilość wcześniej przygotowanej mieszanki przeciwciał, aby całkowicie pokryć fragmenty tkanki. Następnie umieść preparaty w komorze wilgotności i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować świeży roztwór interkalatora irydu, wykonaj rozcieńczenie w stopniu 1 do 2 000 z roztworu zapasowego o pojemności 500 mikromolów, używając TBS wolnego od RNazy.
Włóż szkiełka do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego wodą bez nukleazy i myj je w buforze TBS-T, delikatnie mieszając przez pięć minut. Następnie, aby zabarwić szkiełki, dodaj przygotowany roztwór roboczy irydu i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść szkiełka w przezroczystym uchwytie na preparaty wcześniej umytym wodą wolną od nukleazy.
Przemyj szkiełka dwa razy w buforze TBS-T z lekkim mieszaniem przez pięć minut. Następnie szybko zanurz szkiełka w podwójnie destylowanej wodzie, aby zapobiec krystalizacji soli przez TBS na tkance. Susz preparaty pod chemicznym okapem przez 10 minut i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przejęcia obrazu.
Załaduj przygotowane szkiełko do komory ablacyjnej systemu cytometrii masowej obrazującej. Zrób panoramy slajdu, aby zidentyfikować obszar zainteresowania. Za pomocą oprogramowania do akwizycji zaznacz pożądane obszary zainteresowania na zdjęciu panoramy.
Zastosuj szablon akwizycji w oprogramowaniu do akwizycji obrazów. I dostosowują moc lasera w zależności od typu próbki. Teraz rozpocznij proces ablacji laserowej.
Zmierz ilość każdego izotopu za pomocą detektora, który przekształca dane w formę cyfrową do analizy. Status aktywacji komórek CD8 T oceniano za pomocą współdetekcji granzymu B zarówno na poziomie mRNA, jak i białka, wraz z dodatnim wynikiem interferon-gamma. Wykazano, że fibroblasty związane z rakiem wykazują ekspresję białka MFAP5 i mRNA POSTN, oba markery agresywności fibroblastów związanych z rakiem.
Wykazano, że komórka CD4 T współekspresuje mRNA IL17A i IL6, co jest zgodne z tożsamością komórek TH17. Zaobserwowano, że komórki T CD4 wyrażają mRNA IL13. W pobliżu komórki CD8 T wykazano komórki nowotworowe z dodatnim wynikiem keratyny CD47.
Wykazano, że aktywowana komórka T CD8 wykazuje ekspresję białka CD25. Porównywalne barwienie mRNA THBS2 i CD47 zaobserwowano pomiędzy protokołami sprzężonymi z metalem a znakowaniem fluorescencyjnym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodologię multipleksowej detekcji mRNA z wykorzystaniem obrazowania masowej cytometrii białek w sekcjach tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Celem jest zrozumienie mechanizmów molekularnych raka jajnika w celu zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych i biomarkerów.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Onkologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie raka jajnika na poziomie molekularnym.
- Wyzwania w wykrywaniu białek o niskiej zawartości.
- Konieczność walidacji i miareczkowania przeciwciał.
- Złożoność klasyfikacji pikseli podczas analizy.
Cel badania
- W celu znalezienia nowych celów terapeutycznych w leczeniu raka jajnika.
- W celu zidentyfikowania biomarkerów pozwalających przewidzieć przeżywalność pacjentów.
- W celu udoskonalenia metod detekcji białek w próbkach tkankowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie preparatów FFPE.
- Użycie tacek do kontroli wilgotności podczas hybrydyzacji.
- Zastosowanie odczynnika RNA-ISH Amplifier 3.
- Hybrydyzacja w kontrolowanej temperaturze.
Główne wyniki
- Skuteczna detekcja multipleksowa mRNA i białek.
- Udoskonalona metodologia analizy przekrojów tkankowych.
- Wgląd w mechanizmy molekularne raka jajnika.
- Potencjał w identyfikacji nowych biomarkerów.
Wnioski
- Protokół ten pogłębia zrozumienie biologii raka jajnika.
- Odnosi się on do wyzwań związanych z detekcją białek.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych opracowań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Integracja wielokrotnej detekcji mRNA z obrazowaniem masowym cytometrii białek umożliwia jednoczesne profilowanie przestrzenne transkryptomu i proteomu w jednym przekroju tkanki, co usprawnia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w badaniach nad nowotworami. To podejście dwumodalne pokonuje ograniczenia detekcji opartej wyłącznie na przeciwciałach oraz problem nakładania się widm fluorescencji, zapewniając wyższą pewność prognostyczną w identyfikacji biomarkerów i celów terapeutycznych. Metoda ta wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie informacji molekularnych, które są kluczowe dla wczesnych etapów odkryć i badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią korelację ekspresji mRNA i białek w obrębie tego samego mikrośrodowiska komórkowego.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ujawnienie zarówno primingu transkrypcyjnego, jak i sygnalizacji na poziomie białka.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie aktywności szlaków i stanu komórek w tkance istotnej dla danej choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla potencjalnych celów i biomarkerów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych, multipleksowych układów tkankowych do późniejszego przesiewania i oceny związków.
- Zapewnia ilościowe i powtarzalne wyniki dla analitów mRNA oraz białek in situ.
- Zmniejsza redundancję testów poprzez integrację detekcji analitów w ramach jednego schematu postępowania.
- Minimalizuje wymagania dotyczące przetwarzania końcowego i kompensacji w porównaniu z metodami opartymi na fluorescencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przestrzenne profilowanie molekularne z architekturą tkanki istotną dla choroby w celu odkrywania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając uzyskanie multipleksowych, rozdzielczych przestrzennie odczytów.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając rzetelnych danych dla wielu analitów z próbek istotnych klinicznie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten dwumodalny schemat pracy łączy wczesny etap odkryć, walidację celu oraz badania translacyjne, umożliwiając kompleksową kartografię molekularną w sekcjach tkanek FFPE.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez mapowanie koekspresji mRNA i białek in situ.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy, multipleksowe przekroje tkanek z ilościowymi wynikami do dalszej oceny.
- Analityka: Generuje cyfrowe pomiary oparte na izotopach, umożliwiając rzetelne statystyczne porównanie fenotypów komórkowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i walidację w kontekście chorób w złożonych mikrośrodowiskach tkankowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę do przestrzennego profilowania wielu analitów w ramach portfolio onkologicznego i immunologicznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu celów terapeutycznych i biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w detekcji multipleksowej i minimalizuje artefakty techniczne wynikające z ograniczeń fluorescencji lub przeciwciał.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym sortowanie portfela projektów w oparciu o solidne dane molekularne.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów i biomarkerów o wysokim stopniu pewności.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach obrazowania cytometrii masowej oraz hybrydyzacji in situ.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury do detekcji opartej na sondach metalicznych oraz analizy cyfrowej.
- Konieczna jest rygorystyczna walidacja przeciwciał i sond w celu zapewnienia specyficzności i czułości.
- Może być wymagana adaptacja do różnych typów tkanek lub modeli chorób, w zależności od zawartości analitytów i architektury tkanki.
- Złożoność analizy rośnie wraz z większą liczbą parametrów (plexity) i rozdzielczością przestrzenną, co wymaga zastosowania zaawansowanych narzędzi obliczeniowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:32
Hybridizing RNA-ISH Amplifier 3 to Ovarian Cancer FFPE Sections
1:47
Hybridizing Metal Oligos to the Tissue Sections
2:30
Hybridizing Metal Conjugated Antibodies to the Tissue Sections
3:20
DNA Staining to Prepare Tissue Sections for Imaging
4:33
Image Acquisition
5:35
Results
