Name: Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj metodę kartografii molekularnej z podwójną modalnością do badania raka jajnika. Technika łączy detekcję mRNA z obrazowaniem białek, umożliwiając identyfikację nowych celów terapeutycznych i biomarkerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te zostały przeprowadzone we współpracy z Flow Cytometry and Cellular Imaging Core Facility, które jest częściowo wspierane przez National Institutes of Health poprzez grant M. D. Andersona na wsparcie ośrodków onkologicznych P30 CA016672. Badania te były również częściowo wspierane przez grant rozwojowy MD Anderson's Cancer Center, Imaging Mass Cytometry Spatial Transcriptomics via RNAscope, P30CA016672, NIH/NCI, PI - Pisters. Wysiłki JKB były częściowo wspierane przez CA016672 P30 oraz NCI Research Specialist 1 R50 CA243707-01A1. Działania SFB były częściowo wspierane przez Ovarian Cancer Research Alliance (OCRA 811621 i 891490), Fundację Honorable Tina Brozman na rzecz badań nad rakiem jajnika, MDACC Ovarian Cancer SPORE Developmental Research Program, NIH 1R01CA261952-01A1. Wysiłki SFB, JKB i BG były częściowo wspierane przez grant 1U01CA294459-01. Autorzy pragną podziękować Samuelowi Mokowi, który podzielił i udostępnił użyte próbki.

Protokół ten wykorzystuje tkanki z parafiną utrwaloną formaliną (FFPE) pobrane od wcześniej nieleczonych pacjentów poddawanych pierwotnej operacji cytoredukcyjnej w leczeniu wysokostopieńowego surowiczego raka jajnika. Wszystkie dane kliniczne zostały pozyskane z repozytorium Katedry Onkologii Ginekologicznej i Medycyny Rozrodu zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Instytucjonalną Uniwersytetu Teksańskiego MD Anderson. Uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów, a badania przeprowadzono zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi.
1. Środki ostrożności i przygotowania
<ol>
	<li>Zawsze używaj wody wolnej od nukleazy (NFW) do przygotowania wszystkich potrzebnych odczynników.</li>
	<li>Wszystkie kroki wykonuj przy użyciu plastikowych pojemników i bez użycia szkła, aby zmniejszyć wiązanie metalu ze szkłem i zanieczyszczenie metalami.</li>
	<li>Utrzymuj miejsce pracy w czystości i spryskuj powierzchnie oraz pipety roztworem dekontaminacyjnym RNazy, a następnie 70% etanolem przygotowanym w NFW.</li>
	<li>Skonżone tiolowane sondy wykrywające mRNA (T1-T12) do właściwych metali za pomocą linkera malemidowego, opisanego przez Schulza i in.7, szczegółowo opisanego w protocol.io roku w Tabeli Materiałów. UWAGA: Należy wybierać cele białkowe, aby wskazać lokalizację komórki w tkance (markery strukturalne), identyfikować, które komórki są obecne (markery fenotypowe) oraz co komórki robią (markery funkcjonalne). Ponieważ niektóre markery funkcjonalne są ekspresyjne przejściowo, włączenie celów mRNA umożliwia identyfikację komórek generujących te cele.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i wstępne przetwarzanie
<ol>
	<li>Upiecz kawałki chusteczki na noc w suchym piecu w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Wykonaj deparafinizację: trzy rundy ksylenu po 5 minut w każdej rundzie oraz 10 rund nawodniania (100% etanolu (EtOH) raz2, 95% EtOH 2, 70% EtOH 2, 50% EtOH 2, 30% EtOH 2), przez 3 minuty na każdą rundę. Raz umyj sólą tris-buffered (TBS) przez 2 minuty. W zależności od liczby próbek przetwarzanych jednocześnie, należy używać stożkowych lamp o pojemności 50 mL (maksymalnie 2 szkiełka) lub kaset barwiących IHC o pojemności 350 mL (maksymalnie 24 szkiełki). UWAGA: Ten etap odwoszczenia, choć zalecany, jest opcjonalny i zależy od typu tkanki.</li>
	<li>Należy nałożyć roztwór 3,7% paradehydu (PFA) przez 10 minut, inkubując szkiełka tkankowe w probówce 50 mL z wystarczającą ilością roztworu PFA, aby pokryć przekrój tkanki.</li>
	<li>Pobieranie antygenów indukowanych cieplem (HEIR) za pomocą mikrofali: Używając mikrofalówki monitorowanej temperaturą, napełnij jedną tackę buforem pobierającym antygen HEIR o pH 6 (350 mL), a pozostałe tacki NFW. Umieść fragmenty tkanek w stojaku do barwienia do szkiełek mikroskopowych i dodaj je do tacy z buforem antygenowym. UWAGA: Podczas pobierania antygenów upewnij się, że bufor antygenowy znajduje się w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenów w temperaturze 107 °C przez 15 minut, a następnie pozwól tkanki schłodzić się w RT przez 20 minut w okapu chemicznym.</li>
	<li>Podczas pobierania antygenów opłucz papier nawilżający wodą, umieść go w tacce do plamowania z kontrolą wilgotności i umieść tackę w piekarniku hybrydyzacyjnym w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Płukam w TBS bez RNazy przez 3 minuty, potem suszę przez 3 minuty.</li>
</ol>
3. Leczenie proteazą
<ol>
	<li>Narysuj barierę hydrofobową wokół każdego fragmentu tkanki za pomocą długopisu bariery hydrofobowej. Pozwól barierze całkowicie wyschnąć przez około 2 minuty.</li>
	<li>Załaduj suche zamki do uchwytu na suwak wilgoci, otwierając zacisk obrotowy.</li>
	<li>Dodaj wystarczająco dużo proteazy, aby całkowicie pokryć tkankę. Wyjmij wcześniej podgrzaną tacę kontrolną wilgotności (60 °C, krok 2,6) z piekarnika hybrydyzacyjnego i włóż uchwyt do tacy kontroli wilgotności. Ponownie uszczelnij tacę do kontroli wilgotności i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego. Inkubuj w 40 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas tej inkubacji przygotuj materiały do testu RNA-ISH.<ol>
		<li>Przygotuj 500 mL bufora prania 1x RNA-ISH przez rozcieńczenie 50x buforu NFW. Przechowywać w RT do miesiąca. UWAGA: Jeśli w buforze płukania 50x występuje opadanie, należy ponownie zawiesić przez podgrzewanie bufora do 40 °C przez 10-20 minut przed przygotowaniem buforu 1x płukania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1 litr DTBS-T (0,5% Tween) w NFW, dodając 5 ml Tween do 1 L DPBS-T.</li>
	<li>Przygotuj sondy docelowe w parze RNA-podobnej do ZZ:<ol>
		<li>Ogrzej sonda mRNA i rozcieńczalnik RNA-ISH w temperaturze 40 °C w suchym piekarniku przez 10 minut. Zwij sondy i obróć je w mini wirówce stołowej.</li>
		<li>Przygotuj 1x mieszankę (do 12 sond, Tabela 1) rozcieńczając oryginalne sondy 50x w rozcieńczalniku RNA-ISH, upewniając się, że jest wystarczająco dużo końcowej objętości, by pokryć cały fragment tkanki.</li>
		<li>Dobrze zawortkuj i zostawij mieszane sondy oraz rozcieńczalnik RNA-podobny do RT aż do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Myj slajdy w NFW z lekkim poruszeniem przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórz krok mycia z świeżym NFW przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja sond docelowych
<ol>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy.</li>
	<li>Dodaj wystarczająco dużo odpowiedniej mieszanki sondy, aby całkowicie pokryć każdą część tkanki. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika na 2 godziny w 40 °C.</li>
	<li>Umieść odczynnik RNA-ISH Amplifier 1 (drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T1 do T4) tak, aby wyrównał się w RT 30 minut przed końcem inkubacji, aby użyć go w kroku 5.2.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji wyjmij tacę kontrolną wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i wyjmij uchwyt na zsuwanie. Wróć blachę do piekarnika.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.</li>
</ol>
5. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 1
<ol>
	<li>Usuń nadmiar płynu z preparatów i umieść je w uchwytie na podnoszenie wilgoci. Włóż uchwyt na suwak do tacy do kontroli wilgotności.</li>
	<li>Vortex RNA-ISH Amplifier 1 i dodaj go, aby całkowicie objąć każdą sekcję. Zamknij tackę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w temperaturze 40 °C. Umieść RNA-ISH Amplifier 2 (ZZ tail trees dla ogonów T5 do T8) odczynnik w RT, aby użyć go w kroku 6.2.</li>
	<li>Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz proces mycia z nowym 1x buforem przez 2 minuty w RT.</li>
</ol>
6. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 2
<ol>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy</li>
	<li>Vortex RNA-ISH Amplifier 2 i dodaj go, aby pokryć każdą sekcję. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 °C.</li>
	<li>Umieść reagent RNA-ISH Amplifier 3 (drzewa ogonowe ZZ dla ogonów T9 do T 12) na RT, aby użyć go w kroku 7.2. Wyjmij uchwyt na suwak z tacy. Włóż blachę z powrotem do piekarnika.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórz proces mycia z nowym 1x buforem przez 2 minuty w RT.</li>
</ol>
7. Hybrydyzuj wzmacniacz RNA-ISH 3
<ol>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy</li>
	<li>Vortex RNA-ISH Amplifier 3 i dodaj go, aby całkowicie pokryć każdą sekcję. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 °C.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj mieszankę metalu oligosystemyczną do kroku 8. Każdy oligo stosuje się w stężeniu 1:15 (z zapasu 10uM, dbając o wystarczającą objętość na cały fragment tkanki). Dobrze zacznij wirować i zostawić oligometryki z mieszanką metali w stanie RT do użycia. Wyjmij blachę do kontroli wilgotności z piekarnika, a następnie zdejmij uchwyt na suwak z blachy. Następnie odłóż blachę do piekarnika</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.</li>
</ol>
8. Hybrydyzacja oligomorfoidów metali
<ol>
	<li>Usuń nadmiar płynu ze szkiełek. Wyjmij tacę z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy. Dodaj oligometryki z mieszanką metali przygotowane w kroku 7.3 (wir przed użyciem).</li>
	<li>Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 45 minut w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Wyjmij tackę do kontroli wilgotności z piekarnika hybrydyzacyjnego i zdejmij uchwyt na suwak. Wróć blachę do piekarnika.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Umyj szkiełka w 1x buforze z lekkim poruszeniem przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtarzam proces mycia z świeżym 1x Wash Buffer przez 2 minuty w RT.</li>
</ol>
9. Przeciwciała sprzężone z metalami
<ol>
	<li>Aby zablokować miejsca niespecyficzne, nałóż wystarczającą objętość buforu blokującego, aby pokryć cały przekrój tkanki i inkubuj przez 30 minut w RT.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj mieszankę przeciwciał do użycia w kroku 10.1, rozcieńczając je (Tabela 1) w buforze rozcieńczającym przeciwciała.</li>
</ol>
10. Inkubacja z przeciwciałami sprzężonymi z metali
<ol>
	<li>Po zablokowaniu inkubacji buforowej usuń bufor blokujący z tkanek i wydaj wystarczającą objętość mieszanki Ab (od kroku 9.2), aby pokryć cały przekrój tkanki.</li>
	<li>Umieść preparat w komorze wilgotności i inkubuj przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
11. Barwienie DNA
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór Ir-Intercalatora.<ol>
		<li>Z roztworu zapasowego 500 μM przygotuj roztwór roboczy w skali 1:2000 w TBS wolnym od RNazy. Roztwór roboczy można alicytować i przechowywać w temperaturze -20 °C (nie zamarzać i rozmrażać).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Płucz szkiełka w buforze TBS-T z lekkim pomieszaniem przez 5 minut.</li>
	<li>Powtarzaj pranie w TBS-T.</li>
	<li>Bejcuj roztworem roboczym IR (od kroku 11.1.1) przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Włóż zamki do przezroczystego uchwytu na preparaty wcześniej umytego NFW. Płucz szkiełka w buforze TBS-T z lekkim pomieszaniem przez 5 minut.</li>
	<li>Powtarzaj pranie w TBS-T.</li>
	<li>Pierz dwa razy w TBS, 5 minut (mieszaj powoli).</li>
	<li>Szybko zanurz szkiełko w ddH2O, aby uniknąć krystalizacji soli obecnych w TBS na tkance.</li>
	<li>Susz preparat pod chemiczną okrycią (10 min) i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania zdjęcia.</li>
</ol>
12. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Załaduj szkiełko do komory ablacyjnej IMC.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcie panoramy, aby zidentyfikować obszar zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Zmapuj zwroty z inwestycji w oprogramowaniu do akwizycji obrazów.</li>
	<li>Zastosuj szablon akwizycji.</li>
	<li>Dostosuj moc lasera (energię ablacji) w zależności od typu próbki. Domyślne ustawienie jest na 0 dB. UWAGA: Zaleca się badanie energii ablacji na wielu małych obszarach tkanek (30 μm x 30 μm), zwiększając moc o 1 dB za każdym razem. Wybierz najniższą energię ablacji, która oczyszcza próbkę bez wypalania preparatu. Zazwyczaj daje to moc lasera na poziomie 3-4 dB. Czasami, jeśli tkanka jest grubsza niż zalecano, moc lasera wzrasta do 5 dB.</li>
	<li>Rozpocznij ablację laserową. System kieruje laser na ROI i abluje białka oznaczone metalem, generując strumienie aerozoli przenoszone do indukcyjnie sprzężonego palnika plazmy (ICP), gdzie te strumy są odparowywane, atomizowane i jonizowane w plazmie.</li>
	<li>Zmierz ilość każdego izotopu mierzonego przez detektor i przekształcanego w dane.</li>
</ol>

<ol><li>Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+spatial+bioimaging+for+combination+therapy+design%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design.</a> Trends Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).</li>
<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+blockade%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncol. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li>
<li>Parolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastic+contamination+in+snow+from+western+Italian+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Microplastic contamination in snow from western Italian Alps.</a> Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 768(2021).</li>
<li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+epithelial+phenotype+of+cancer+cells+in+primary+tumors+leads+to+increased+colonization+of+liver+metastasis+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Stabilized epithelial phenotype of cancer cells in primary tumors leads to increased colonization of liver metastasis in pancreatic cancer.</a> Cell Rep. 35 (2), 108990(2021).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precis Oncol. 4 (1), 1-12 (2020).</li>
<li>Ferri-Borgogno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((metabolic%2C+and+subcellular+mapping+of+the+tumor+immune+microenvironment+via+3D+targeted+and+non-targeted+multiplex+multi-omics+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses.</a> Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).</li>
<li>Schulz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiplexed+imaging+of+mRNA+and+proteins+with+subcellular+resolution+in+breast+cancer+tissue+samples+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiplexed imaging of mRNA and proteins with subcellular resolution in breast cancer tissue samples by mass cytometry.</a> Cell Syst. 6 (1), 25-36.e25 (2018).</li>
<li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).</li>
<li>Ferri-Borgogno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+depict+ligand-receptor+cross-talk+heterogeneity+at+the+tumor-stroma+interface+in+long-term+ovarian+cancer+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors.</a> Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).</li>
<li>Mok, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+signature+predictive+for+outcome+in+advanced+ovarian+cancer+identifies+a+survival+factor%3A+microfibril-associated+glycoprotein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A gene signature predictive for outcome in advanced ovarian cancer identifies a survival factor: microfibril-associated glycoprotein 2.</a> Cancer Cell. 16 (6), 521-532 (2009).</li>
<li>Yeung, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+immunotherapy+by+MFAP5+blockade+inhibits+fibrosis+and+enhances+chemosensitivity+in+ovarian+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anticancer immunotherapy by MFAP5 blockade inhibits fibrosis and enhances chemosensitivity in ovarian and pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 25 (21), 6417-6428 (2019).</li>
<li>Ogura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+promotes+autoimmunity+by+triggering+a+positive-feedback+loop+via+interleukin-6+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 promotes autoimmunity by triggering a positive-feedback loop via interleukin-6 induction.</a> Immunity. 29 (4), 628-636 (2008).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+microbleeding+facilitates+IL-6-+and+IL-17-dependent+arthritis+in+the+absence+of+tissue+antigen+recognition+by+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Local microbleeding facilitates IL-6- and IL-17-dependent arthritis in the absence of tissue antigen recognition by activated T cells.</a> J Exp Med. 208 (1), 103-114 (2011).</li>
<li>Hou, W., Jin, Y. -H., Kang, H. S., Kim, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+and+IL-17+synergistically+promote+viral+persistence+by+inhibiting+cellular+apoptosis+and+cytotoxic+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibiting cellular apoptosis and cytotoxic T cell function.</a> J Virol. 88 (15), 8479-8489 (2014).</li>
<li>Geskin, L. J., Viragova, S., Stolz, D. B., Fuschiotti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+is+overexpressed+in+cutaneous+T-cell+lymphoma+cells+and+regulates+their+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 is overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates their proliferation.</a> Blood. 125 (18), 2798-2805 (2015).</li>
<li>Aspord, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+instructs+dendritic+cells+to+prime+interleukin+13-secreting+CD4%2B+T+cells+that+facilitate+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Breast cancer instructs dendritic cells to prime interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development.</a> J Exp Med. 204 (5), 1037-1047 (2007).</li>
<li>Votava, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+profiles+of+CD47+in+the+tumor+microenvironment+of+salivary+gland+cancers%3A+a+next+step+in+histology-driven+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The expression profiles of CD47 in the tumor microenvironment of salivary gland cancers: a next step in histology-driven immunotherapy.</a> BMC Cancer. 22 (1), 1-12 (2022).</li>
<li>Liu, X., Kwon, H., Li, Z., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+CD47+an+innate+immune+checkpoint+for+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Is CD47 an innate immune checkpoint for tumor evasion.</a> J Hematol Oncol. 10 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Salerno, F., Guislain, A., Cansever, D., Wolkers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-mediated+innate+production+of+IFN-%CE%B3+by+CD8%2B+T+cells+is+independent+of+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-mediated innate production of IFN-γ by CD8+ T cells is independent of glycolysis.</a> J Immunol. 196 (9), 3695-3705 (2016).</li>
<li>Kalia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+interleukin-2R%CE%B1+expression+on+virus-specific+CD8%2B+T+cells+favors+terminal-effector+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Prolonged interleukin-2Rα expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo.</a> Immunity. 32 (1), 91-103 (2010).</li>
<li>Cancino-Díaz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+receptor+in+psoriatic+keratinocytes%3A+overexpression+of+the+mRNA+and+underexpression+of+the+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 receptor in psoriatic keratinocytes: overexpression of the mRNA and underexpression of the protein.</a> J Invest Dermatol. 119 (5), 1114-1120 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Marlin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+process+for+H%26E%2C+immunofluorescence%2C+and+imaging+mass+cytometry+on+a+single+slide+with+a+concise+analytics+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline.</a> Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).</li>
<li>Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+and+young+investigator+award+abstracts%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Regular and young investigator award abstracts.</a> Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).</li>
<li>Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+cytometry+for+in+situ+immune+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging mass cytometry for in situ immune profiling.</a> Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).</li>
<li>Chevrier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+of+signal+spillover+in+suspension+and+imaging+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry.</a> Cell Syst. 6 (5), 612-620.e15 (2018).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+JS+%22In+situ+hybridization+methods%22">In situ hybridization methods</a>. , Springer. New York, NY. (2015).</li>
<li>Rivest, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+sequential+immunofluorescence+%28seqIF%29+for+hyperplex+spatial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics.</a> Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+intraductal+papillary+mucinous+neoplasms+of+the+pancreas+identifies+NKX6-2+as+a+driver+of+gastric+differentiation+and+indolent+biological+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential.</a> Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).</li>
<li>Glasson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+high-dimensional+imaging+mass+cytometry%3A+one+step+beyond+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Single-cell high-dimensional imaging mass cytometry: one step beyond in oncology.</a> Semin Immunopathol. 46 (1), 1-12 (2023).</li>
</ol>

Jared K. Burks jest konsultantem w Standard BioTools.

Multi-omika multipleksów to kluczowa ewolucja w zbieranych danych, ukierunkowana na interakcje komórka do komórki oraz komórka z sąsiedztwem, które wpływają na postęp choroby i leczenie. Analiza tych danych w tej samej próbce, a więc w tej samej komórce, jest kluczowa, ponieważ wiele celów białkowych jest ekspresowanych przejściowo lub różni się w poziomie mRNA i ekspresji białek, co pozwala na akomodację trudnych do wykrycia lub różnicowych celów21. Najnowsze osiągnięcia w integracji technologii ...

Nowotwory wykazują zróżnicowanie strukturalne i funkcjonalne u różnych pacjentów. Mikrośrodowisko nowotworowe (TME), złożone z komórek normalnych i złośliwych, jest zróżnicowane wśród pacjentów. Przerzuty powstają w wyniku ucieczki reszty pierwotnego guza do krwiobiegu w formie skupisk komórek i pojedynczych komórek, co dostarcza wskazówek dotyczących postępu choroby i odpowiedzi terapeutycznej 1,2. Złożoność tych mikrośrodowisk wymaga zrozumienia:1. Chociaż guzy zawierają wiele typów komórek, standard kliniczny opiera się na jednym markerze, który zaczyna się zmieniaćw 1,2. Technologie obrazowania multipleksowego otworzyły nowe kierunki w patologii. Przestrzennie rozdzielona proteomika, genomika, metabolomika i lipidomika nowotworów ludzkich są obecnie możliwe przy rozdzielczości pojedynczej komórki lub blisko niej 3,4,5,6.
Technologie te mogą analizować heterogeniczne lokalizacje komórek i interakcje w guzach. Wykorzystanie odpowiedniej metodologii bioobrazowania pojedynczych komórek pozwala na tworzenie profili wielu biomarkerów białek związanych z chorobą w biopsjach pacjentów, co pozwala na projektowanie terapii onkologicznych. Wnioski z map komórkowych przestrzennych pozwolą na wybór terapii skojarzonej, która skutecznie eliminuje nowotwory przy zmniejszonej liczbie nieprawidłowości, oporności i nawrotach1. Chodzi o możliwość zrzeszania tych wielu różnorodnych technologii, które zazwyczaj nie działają ze sobą na tym samym odcinku tkanki7. Protokół ten, przedstawiony wizualnie na Rysunku 1, daje możliwość przestrzennego badania zarówno proteomiki, jak i docelowego podzbioru mRNA w tym samym przekroju tkanki i tej samej komórce, jednocześnie z większą plekscytacją niż jest to możliwe przy jednoczesnym fluorescencyjnym białku+RNA-ISH8. Może to również służyć jako pomost do analizy równoległej 3,4,6, mającej na celu rozproszenie analizy danych. Chociaż obecne jest podwójne wykrywanie, można również badać komórki, które szybko zainicjowały produkcję mRNA, ale dla których wydzielane białko pozostaje niewykrywalne ze względu na ograniczoną czułość i brak amplifikacji sygnału, charakterystyczną dla bezpośrednio znakowanych metod przeciwciał pierwotnych, co czyni wykrywanie wydzielanych cząsteczek szczególnie trudnym. Poniższy protokół został zaadaptowany z detekcji fluorescencyjno-chromogenicznej 12-plex do wykrywania metalowego za pomocą sond zmodyfikowanych o redukcji tiolu do jednoczesnego wykrywania w IMC.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.</td><td>Protocols.IO</td><td>dx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2</td><td>Konjugacja oligonukleotyd-polimer do obrazowania cytometrii masowej V.2&nbsp;</td></tr><tr><td>10x TBS RNAse wolnych od</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>J62780. K7</td><td>Do przerywanych płukań między krokami</td></tr><tr><td>System hybrydyzacji ACD HybEZ II</td><td>ACD Biotechne</td><td>321711</td><td>Piekarnik do preparatów do pieczenia</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S0809&nbsp;</td><td>Bufor rozcieńczający przeciwciała</td></tr><tr><td>Przeciwciało: B7-H3</td><td>Bethyl</td><td>A700-025CF, A700-026CF</td><td>Klon: BLR025F, BLR026F</td></tr><tr><td>Przeciwciało: B7-H4</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>14-5949-82</td><td>Klon: H74</td></tr><tr><td>Przeciwciała: BRD4(6F11)</td><td>Bethyl</td><td>A700-005CF</td><td>Klon: BL-151-6F11</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CCR6</td><td>R& D</td><td>MAB195-100</td><td>Klon: 53103</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD11b</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab209970</td><td>Klon: EPR1344</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD25</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab215378</td><td>Klon: EPR6452</td></tr><tr><td>Przeciwciała: CD278/ICOS</td><td>CST&nbsp;</td><td>89601BF</td><td>Klon: D1K2T</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD31</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab207090</td><td>Klon: EPR3094</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD33</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab238784</td><td>Klon: SP266</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD3e&nbsp;</td><td>CST</td><td>85061BF</td><td>Klon: D7A6E</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD4</td><td>Abcam</td><td>ab181724</td><td>Klon: EPR6855</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD44</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>MA1-10225</td><td>Klon: IM7</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>14-9457-82</td><td>Klon: CD45-2B11</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD8a</td><td>CST&nbsp;</td><td>85336BF</td><td>Klon: D8A8Y</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CXCL13</td><td>R& D</td><td>AF801</td><td>Klon: Poliklonalny</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CXCR5</td><td>R& D</td><td>MAB190-100</td><td>Klon: CXCR5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: gamma-H2AX</td><td>Bethyl</td><td>A700-053CF</td><td>Klon: BLR053F</td></tr><tr><td>Przeciwciało: Granzym B</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8022 X</td><td>Klon: 2C5</td></tr><tr><td>Przeciwciało: KAP1</td><td>Bethyl</td><td>A700-014CF</td><td>Klon: BL-248-2G6</td></tr><tr><td>Przeciwciało: Ki67</td><td>Bethyl</td><td>A700-021CF</td><td>Klon: BLR021E</td></tr><tr><td>Przeciwciało: LCK&nbsp;</td><td>CST</td><td>2984BF</td><td>Klon: D88</td></tr><tr><td>Przeciwciała: MFAP5</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>PMID: 31332047 / Klon: 130A&nbsp; (Uwaga: zaprojektowane na zamówienie) &nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało: SMA</td><td>CST</td><td>56856BF</td><td>Klon: 1A4</td></tr><tr><td>Przeciwciała: VEGF</td><td>STB-Fluidigm</td><td>3163028D</td><td>Klon: G153-494</td></tr><tr><td>Przeciwciało: VISTA</td><td>CST</td><td>64953BF</td><td>Klon: D1L2G</td></tr><tr><td>AZ-AR1 Elegance Citra&nbsp;</td><td>BioGeneX</td><td>HK546-XAK</td><td>Bufor odzyskiwania antygenów</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 100% (200 proof)</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>Dla deparafinizacji</td></tr><tr><td>EZ &ndash; Retriever IR</td><td>BioGeneX</td><td>MW016-IR</td><td>System pobierania antygenów dla przekrojów tkanek FFPE</td></tr><tr><td>System hybrydyzacji HybEZ II</td><td>ACD Biotechne</td><td>321710</td><td>System składa się z: piekarnika HybEZ (PN 321710/321720), tacy do kontroli wilgotności (PN 310012) oraz papieru nawilżającego HybEZ (2 arkusze PN 310025), tacy do prania EZ-Batch (PN 321717), uchwytu na ślizgi EZ-Batch (PN 321716)</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowa Bariera PAP Pen&nbsp;</td><td>VectorLabs</td><td>H-4000</td><td>Hydrofobowe zagroda barierowe</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Interkalatora IR</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>NC1038184</td><td>Wykorzystywane do identyfikacji komórek jądrowych</td></tr><tr><td>KERATYNA 8/18</td><td>CST&nbsp;</td><td>4546BF</td><td>Klon: C51</td></tr><tr><td>Metalowe Oligos</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Metalowy tag w zakresie od T1 do T12, w zależności od potrzebnego</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleazy (NFW)</td><td>Corning &nbsp;</td><td>46-000-CM&nbsp;</td><td>Do czyszczenia i przygotowania całego sprzętu oraz do używania go jako rozcieńczacza, gdy jest to konieczne</td></tr><tr><td>RNAscope Protease Plus&nbsp;</td><td>ACD Biotechne</td><td>322331&nbsp;</td><td>Wykorzystywane do przepuszczania błon komórkowych próbek</td></tr><tr><td>Uchwyt szkiełka RNAscope EZ-Batch</td><td>ACD Biotechne</td><td>310017</td><td>Zaprojektowany do ręcznego przetwarzania wsadowego do 20 slajdów efektywnie</td></tr><tr><td>RNAscope HiPlex12 Reagent Kit v2&nbsp;</td><td>ACD Biotechne</td><td>324409</td><td>Reagenty do RNASkopy</td></tr><tr><td>RNAscope HiPlex sonda - sondy docelowe</td><td>ACD Biotechne</td><td>Różne</td><td>Zakres od T1 do T12, w zależności od tego, który jest potrzebny</td></tr><tr><td>Roztwór RNazy RNaze RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9782</td><td>Roztwór dekontaminacji powierzchni, który niszczy RNazy</td></tr><tr><td>Uchwyt na uchwyt na uchwyt na szkiełko mikroskopu do barwienia 24 miejsca, plastik odporny na chemikalia</td><td>Optymalna nauka</td><td>3028</td><td>Do barwienia wielu szkiełów</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>AAJ20605AP</td><td>Do przerywanych płukań między krokami</td></tr><tr><td>Blok białkowy ultrawizji</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp;</td><td>TA125PBQ</td><td>Bufor blokujący</td></tr></tbody></table>

kartografia molekularna z podwójną modalnością: integracja detekcji multipleksowego mrna z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Dual-modality Molecular Cartography: Integrating Multiplex mRNA Detection with Protein Imaging Mass Cytometry

Możliwość wykrywania białka i mRNA w tym samym badaniu pomaga zrozumieć, jak komórka przygotowuje się na przybycie i jakie sygnały otrzymuje podczas podróży i interakcji w środowisku, w którym się znajduje. Obrazowanie wyższego pleksu pozwala obecnie na jednoczesną charakterystykę przestrzennie rozdzielonego mRNA (transkryptomika przestrzenna) i białka (proteomika przestrzenna). Aby uniknąć redundancji, analizowane substancje można analizować w pojedynczym przekroju tkanki. Istnieje wiele technologii umożliwiających tworzenie wielu białek i niewielu mRNA lub odwrotnie, ale ponieważ centralnie działające anality to białka, ten artykuł koncentruje się na integracji obrazowania białek (IMC) z hybrydyzacją mRNA in situ (ISH) z wykorzystaniem sond metalowych. Pozwala nam to zrozumieć, jakie sygnały komórka wysyła lub wysyła szybko do świata, komunikując się w swoim mikrośrodowisku. Pozwala także pokonać ograniczenia związane z wykrywaniem wydzielanych białek lub wymagających markerów, które zwykle trudno ilościowo określić i zobrazować wyłącznie przy użyciu przeciwciał. Protokół ten minimalizuje również potrzebę kompensacji lub postprocessingu, co występuje w metodach opartych na fluorescencji o wyższym plexie, ponieważ w systemie detekcji opartym na metalowych sondach nie występuje fluorescencyjne przelewanie spektralne, ani nie uwzględnia się specyficznych dla tkanek autofluorescencji.

Możliwość wykrywania białka i mRNA w tym samym badaniu pomaga nam zrozumieć, jak komórka przygotowuje się na przybycie, ale także jakie kolejki otrzymuje podczas podróży i interakcji ze środowiskiem. Jak widać w reprezentatywnych danych, wykrywanie mRNA i białek jest kluczowym elementem badań biologii przestrzennej, ponieważ dolne granice wykrywania mogą być dość trudne w zależności od postępów znakowania, wykrywania i/lub obrazowania. Samo włączenie proteaz może komplikować krytyczne markery w protokołach połączonych, d...

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

The ability to detect protein and mRNA in the same assay helps us understand how the cell is priming for an arrival and what cues it receives as it ...

Skupiamy się na biologii specjalnej, aby lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy raka jajnika, z nadzieją na znalezienie nowych celów terapeutycznych i biomarkerów przewidujących przeżycie pacjentów. Jednym z obecnych wyzwań IMC jest sekcja białka o niższej obsadności, praca związana z walidacją i miareczkowaniem przeciwciał, a także złożona i czasochłonna klasyfikacja pikseli podczas analizy. Zacznij od usunięcia nadmiaru płynu z przygotowanych szkiełek FFPE.Wyjmij blachę do kontroli wilgotności z piekarnika i włóż uchwyt na suwak do blachy. Następnie dokładnie przeszukaj vortex RNA-ISH Amplifier 3 i dodaj tyle reagenta, by całkowicie pokryć każdą sekcję tkanki na szkiełkach. Zamknij blachę i włóż ją do piekarnika hybrydyzacyjnego na 30 minut w 40 stopniach Celsjusza.Podczas inkubacji przygotuj mieszankę oligonukleotydów metalu, rozcieńczając każdy oligometryk w proporcji jeden do 15. Dokładnie wymieszaj metal-oligo i pozostaw w temperaturze pokojowej do dalszego użycia. Teraz wyjmij tacę do kontroli wilgotności z piekarnika.Wyjmij uchwyt na suwak z blachy i włóż blachę z powrotem do piekarnika. Następnie umieść szkiełka w przezroczystym uchwytie na preparaty, które zostało wcześn

dual-modality-molecular-cartography-integrating-multiplex-mrna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Demonstrujemy metodę obrazowania wielu cząsteczek w heterogenicznych nanostrukturach z dokładnością do pojedynczej cząsteczki, wykorzystując sekwencyjne wiązanie i elucję fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Wysoce multipleksowane obrazowanie limfocytów T w superrozdzielczości przy użyciu madSTORM

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Analiza obrazu z multipleksowanym kodowaniem kreskowym ostatnio poprawiła charakterystykę mikrośrodowiska guza, umożliwiając kompleksowe badania składu komórki, stanu funkcjonalnego i interakcji komórka-komórka. W niniejszym artykule opisano protokół barwienia i obrazowania z wykorzystaniem kodowania kreskowego przeciwciał sprzężonych z oligonukleotydami i obrazowania cyklicznego, który pozwala na zastosowanie techniki wysokowymiarowej analizy obrazu.

Multipleksowa analiza obrazu z kodowaniem kreskowym do charakterystyki immunoprofilowania i mapowania przestrzennego w analizie pojedynczej komórki próbek tkanek parafinowych

Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący projektowania multipleksowego panelu przeciwciał immunofluorescencyjnych do obrazowania mysich tkanek czerniaka FFPE na podstawie kodów kreskowych. Opisujemy również proces analizy obrazu przy użyciu narzędzi typu open source do generowania przestrzennych wglądów proteomicznych w mikrośrodowisku immunologicznym mysiego czerniaka.

Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Poznaj metodę kartografii molekularnej z podwójną modalnością do badania raka jajnika. Technika łączy detekcję mRNA z obrazowaniem białek, umożliwiając identyfikację nowych celów terapeutycznych i biomarkerów.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową (Wideo) | JoVE Journal

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Przeglądaj więcej filmów