Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Celem naszych badań było opracowanie i walidacja testu, który jednocześnie wykrywa i ilościowo określa mikroRNA oraz wiele białek w tkance FFPE, aby lepiej obserwować przestrzennie relacje między nimi w TME. W rzeczywistości przezwycięża typowe ograniczenia istniejącego sekwencjonowania molekularnego i dość tradycyjnego, zapewniając bezpośrednią ilościową identyfikację, kolokalizację oraz jednoczesną przestrzenną detekcję mikroRNA i białek, wszystko bez niszczenia tkanki i zachowując lokalizację komórek oraz podkomórkowych. Ta technologia potencjalnie toruje drogę zarówno do podstawowych badań nad sieciami regulacyjnymi, mechanizmami chorób, jak i badań translacyjnych lub klinicznych poszukujących lepszych biomarkerów i celów terapeutycznych.

Zacznij od pobrania próbek ludzkiego guza jajnika z parafiną utrwalonym formaliną, przechowywanych przez noc w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Używając wody wolnej od RNA, dokładnie czyść cały sprzęt i narzędzia. Następnie po deparafinizacji zanurz próbki w ksylenie trzy razy na pięć minut każda.

Nawilżaj tkanki 10 seriami rozcieńczonego etanolu, każda przez trzy minuty. Następnie przemyj próbki raz w TBS przez dwie minuty. Na próbki należy nałożyć 3% roztwór nadtlenku wodoru przez 10 minut.

Przemyj próbki dwa razy przez dwie minuty za pomocą TBS. Następnie nałóż roztwór paradehydu 3,7% przez 10 minut. Następnie rozpocznij pierwszą rundę pobierania antygenów za pomocą łatwego systemu podczerwieni retrievera.

Zanurz szkiełka w świeżym buforze EZ-AR 1 i podgrzej w mikrofalówce w 95 stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie płukam próbki w TBS przez dwie minuty, a następnie dwa dwuminutowe płukania w TBST. Na początek narysuj barierę wokół każdego fragmentu tkanki za pomocą hydrofobowego długopisu barierowego.

Dodaj roztwór blokujący przeciwciała i inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności. Następnie nałóż przeciwciało główne rozcieńczone tym samym roztworem blokującym, aby całkowicie pokryć przekrój tkanki i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności. Po trzykrotnym umyciu szkiełek w TBST dodaj roztwór peroksydazy chrzanu króliczego i przeciwmyszego, aby pokryć tkankę, i inkubuj w komorze wilgotności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Teraz rozcieńcz pierwszy fluoro-4 w stosunku 1:100 za pomocą rozcieńczacza wzmacniającego. Nałóż tę mieszankę na tkankę i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności, unikając bezpośredniego światła. Po przeprowadzeniu drugiej rundy pobierania i blokowania antygenów, jak pokazano wcześniej, rozcieńcz drugie przeciwciało pierwotne tym samym roztworem blokującym.

Nałóż rozcieńczone przeciwciało, aby pokryć cały fragment tkanki i inkubuj przez noc co najmniej 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza wewnątrz komory wilgotności. Następnego dnia myj szkiełka trzy razy po dwie minuty w TBST i inkubuj roztworem peroksydazy chrzanu króliczego, jak pokazano wcześniej. Następnie nałóż rozcieńczony drugi fluoro-4 na preparaty i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności.

Do aplikacji sondowej myj szkiełka trzy razy po dwie minuty w TBST. Aby rozpocząć trzecie i ostatnie pobieranie antygenów, zanurz preparaty w buforze EZ-AR 1 Elegance i podgrzej w mikrofali w temperaturze 107 stopni Celsjusza przez 15 minut. Schłodzić szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a potem raz je wyprać przez trzy minuty w TBS.

Wystarczy nałożyć RNAscope Protease Plus, aby pokryć obszar tkanek i inkubuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut w piekarniku. Następnie podgrzej mikroRNA zablokowaną sondę z kwasem nukleinowym do 90 stopni Celsjusza przez cztery minuty, aby ją denaturować. Natychmiast rozcieńcz zdenaturowaną sondę buforem in situ in situ hybrydyzacyjnym.

Po wirowaniu i obracaniu przygotowanej sondy dodaj ją, aby pokryła cały obszar tkanek i inkubuj przez godzinę w piekarniku w 60 stopniach Celsjusza. Umyj zamki raz przez pięć minut w 5x SSC Buffer. Wykonaj pięć rygorystycznych płukań w temperaturze 60 stopni Celsjusza, używając bufora SSC przez pięć minut każdy.

Następnie myj szkiełka raz przez pięć minut w 0,2 razy SSC w temperaturze pokojowej. Aby przygotować bufor blokujący, połącz TBS z proszkiem blokującym 0,5%. Nałóż bufor blokujący i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze.

Następnie nałóż sprzężony antydigoksynę i nadoksydazę chrzanu myszego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze. Po trzech płukaniach TBST należy zastosować rozcieńczenie wzmacniania sygnału tyramidowego wraz z cyjaniną 3 na szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotności. Myj slajdy jeszcze trzy razy po pięć minut w TBST.

Nałóż wystarczającą ilość rozpuszczonego roztworu DAPI w skali 1:1000 w TBS, aby całkowicie pokryć przekrój tkanki. Inkubuj preparaty przez pięć minut w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze z wilgotnością otoczenia. Myj slajdy trzy razy po pięć minut w TBST.

Naklej pokrywki za pomocą materiału montażowego i pozwól szkiełkom wyschnąć przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przechowuj wysuszone preparaty w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin przed obrazowaniem lub do trzech miesięcy w celu dłuższego przechowywania. Ekspresja miRNA miR-181c-3p była konsekwentnie wykrywana zarówno w testach kontrolnych, jak i barwionych przeciwciałami, z wyraźnie silniejszymi sygnałami skoncentrowanymi w regionach komórek nowotworowych.

Zastosowanie przeciwciała anty-EpCAM z fluoroforem emisji 620 nanometrów zabarwiło komórki nowotworowe w próbce HGSC. Zastosowanie przeciwciała anty-CD8 za pomocą fluoroforów emisji 620 nanometrów oznaczonych jako CD8 dodatnia komórka T. Połączone wykrywanie białek i miRNA umożliwiło lokalizację przestrzenną miR-181c-3p w porównaniu do komórek nowotworowych z EpCAM i komórek odpornościowych z dodatnim wynikiem CD8.

Sonda z dodatnim kontrolowaniem celująca w małe jądrowe RNA U6 wydawała silne sygnały fluorescencyjne we wszystkich typach tkanek, potwierdzając skuteczność i integralność tkanek. Sonda kontrolna z ujemną reakcją, która wykorzystywała zaszyfrowaną sekwencję miRNA, nie wykazała wykrywalnego sygnału w żadnym typie tkanki, co wskazuje na brak niespecyficznego wiązania. Docelowa sonda dla miR-181c-3p wykazała silną ekspresję w wysokiej jakości tkance raka surowicy bez sygnału w prawidłowej tkance jajnika lub tkance jajowodów, co świadczy o specyficzności i dokładności sondy i testu.