Name: Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę tomografii krioelektronowej do badania konformacji hemaglutininy wirusa grypy przy wiązaniu receptora. Protokół umożliwia wizualizację struktury wirusa w rozdzielczości subnanometrowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby wyrazić podziękowania za pomocne rozmowy z Schiffer Lab. Chcielibyśmy również podziękować placówce UMass Chan Core CryoEM za pomoc w pozyskiwaniu danych oraz za wsparcie i doradztwo. Prace te były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences R01GM143773 na magisterium i R35GM151996 na C.A.S.

<ol><li>Young, L. N., Villa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+structure+to+cell+biology+with+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography.</a> Annu Rev Biophys. 52, 573-595 (2023).</li>
<li>Navarro, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Quantitative cryo-electron tomography.</a> Front Mol Biosci. 9, 934465(2022).</li>
<li>Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+resolution+revolution+and+a+surge+of+in+situ+virological+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries.</a> Annu Rev Biophys. 52, 339-360 (2023).</li>
<li>Turk, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+the+challenges+of+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The promise and the challenges of cryo-electron tomography.</a> FEBS Lett. 594 (20), 3243-3261 (2020).</li>
<li>Huang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+analysis+of+influenza+virus+by+cryo-electron+tomography+and+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural analysis of influenza virus by cryo-electron tomography and convolutional neural networks.</a> Structure. 30 (5), 777-786.e3 (2022).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).</li>
<li>Mangala Prasad, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-ET+of+Env+on+intact+HIV+virions+reveals+structural+variation+and+positioning+on+the+Gag+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-ET of Env on intact HIV virions reveals structural variation and positioning on the Gag lattice.</a> Cell. 185 (4), 641-653.e17 (2022).</li>
<li>Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtomogram+analysis%3A+the+sum+of+a+tomogram%27s+particles+reveals+molecular+structure+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">Subtomogram analysis: the sum of a tomogram's particles reveals molecular structure in situ.</a> J Struct Biol X. 6, 100063(2022).</li>
<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+%C3%85+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells.</a> Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li>
<li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+translation+dynamics+at+atomic+detail+inside+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell.</a> Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+reveals+the+microtubule-bound+form+of+inactive+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography reveals the microtubule-bound form of inactive LRRK2.</a> Elife. 13, e97222(2024).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+protein+identification+in+mammalian+sperm+using+in+situ+cryoelectron+tomography+and+AlphaFold2+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking.</a> Cell. 186 (23), 5041-5053.e19 (2023).</li>
<li>Kelley, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+community-driven+visual+proteomics+with+large-scale+cryo-electron+tomography+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Towards community-driven visual proteomics with large-scale cryo-electron tomography of Chlamydomonas reinhardtii.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+structure+and+snapshots+of+copia+retrotransposons+in+intact+tissue+by+cryo-ET%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In-cell structure and snapshots of copia retrotransposons in intact tissue by cryo-ET.</a> Cell. 188 (8), 2094-2110.e18 (2025).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+basal+body+inner+junctions+from+Tetrahymena+revealed+by+electron+cryo-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The structure of basal body inner junctions from Tetrahymena revealed by electron cryo-tomography.</a> EMBO J. 44 (7), e1975-e2001 (2025).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+underlying+fascin-mediated+bundling+of+actin+filaments+unveiled+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).</li>
<li>Waltz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+architecture+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In-cell architecture of the mitochondrial respiratory chain.</a> Science. 387 (6740), 1296-1301 (2025).</li>
<li>Huang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion-associated+influenza+hemagglutinin+clusters+upon+sialic+acid+binding+visualized+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Virion-associated influenza hemagglutinin clusters upon sialic acid binding visualized by cryo-electron tomography.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Turoňová, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+SARS-CoV-2+spike+reveals+flexibility+mediated+by+three+hinges%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of SARS-CoV-2 spike reveals flexibility mediated by three hinges.</a> Science. 370 (6513), 203-208 (2020).</li>
<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).</li>
<li>Calcraft, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+cryoEM+structure+of+a+spumaretrovirus+reveals+cross-kingdom+evolutionary+relationships+and+the+molecular+basis+for+assembly+and+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated cryoEM structure of a spumaretrovirus reveals cross-kingdom evolutionary relationships and the molecular basis for assembly and virus entry.</a> Cell. 187 (16), 4213-4230.e19 (2024).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTomo%3A+an+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> J Struct Biol X. 6, 100068(2022).</li>
<li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+for+electron+tomography+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning.</a> Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+data+processing+workflow+for+cryo-ET+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging.</a> Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).</li>
<li>Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open3D%3A+a+modern+library+for+3D+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Open3D: a modern library for 3D data processing.</a> arXiv. , (2018).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+approach+to+single-particle+electron+cryo-tomography+in+RELION-4.0%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0.</a> Elife. 11, e83724(2022).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+ChimeraX%3A+structure+visualization+for+researchers%2C+educators%2C+and+developers%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers.</a> Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+framework+for+multi-particle+refinement+in+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography.</a> PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ebola+virus+nucleocapsid+assembly+revealed+by+in+situ+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography.</a> Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).</li>
<li>Woldeyes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+thin+filament+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+its+response+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Env+trimers+asymmetrically+engage+CD4+receptors+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes.</a> Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).</li>
<li>Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+guide+to+efficient+subtomogram+averaging+of+virus-like+particles+with+Dynamo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo.</a> PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Tran, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structures+of+chimeric+hemagglutinin+displayed+on+a+universal+influenza+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Lepsze zrozumienie struktury kluczowych białek wirusowych może przyspieszyć odkrywanie nowych metod leczenia tych wirusów. W ostatniej dekadzie rewolucja rozdzielczości przyspieszyła wyznaczanie wysokorozdzielczych struktur wirusowych za pomocą cryoEM, jednak metoda ta ogranicza się do oczyszczonych białek lub wirusów nieobtoczonych o symetrii dwudziestościennej. Dla porównania, cryoET jest w stanie wizualizować morfologicznie zróżnicowane błoniaste wiriony w 3D, ale jego rozdzielczość jest ograniczona. Przedstawiony tut...

Krio-elektronowa tomografia (cryoET) była stosowana w ostatnich dekadach do rejestrowania zdjęć kompleksów białkowych, wirusów, komórek i organizmów. CryoET, będąca metodą mikroskopii krioelektronowej (cryoEM), to metoda biologii strukturalnej, w której próbka biologiczna jest szybko zamrażana, a następnie obrazowana w różnych orientacjach za pomocą pochylenia 1,2,3. Obrazy wykonane w każdej orientacji są następnie obliczeniowo wyrównywane do wspólnej osi nachylenia i rekonstruowane w tomogram, aby uzyskać trójwymiarowy widok4.
Podczas gdy krystalografia rentgenowska i cryoEM pojedynczych cząstek wymagają oczyszczonych, strukturalnie jednorodnych cząsteczek, cryoET może obrazować cząsteczkę bezpośrednio w jej natywnym kontekście4. Dlatego jedną z głównych zalet cryoET jest jego zdolność do wizualizacji próbek pleomorficznych, takich jak wirusy błoniaste, w tym grypa 5,6,7. Kolejną zaletą cryoET jest zdolność do obrazowania na różnych skalach. Chociaż tomogramy zazwyczaj nie są rozdzielane powyżej 5-10 nm8, całkowanie uśredniania subtomogramów, gdzie kopie tej samej cząstki są identyfikowane, wyrównywane i uśredniane, może skutkować niemal atomową rozdzielczością w niektórych cząsteczkach biologicznych, takich jak rybosomy 9,10. Jednak tylko ograniczone typy cząsteczek mogą osiągnąć tę rozdzielczość; średnie wartości subtomogramu zazwyczaj nie przekraczają rozdzielczości 10-15 Å. Dla porównania, cryoEM pojedynczej cząstki rutynowo osiąga rozdzielczość 3-4 Å po rewolucji rozdzielczości11. Najnowsze osiągnięcia zarówno w zakresie wyższej przepustowości oprogramowania do pozyskiwania i analizy danych cryoET, umożliwiły określenie struktury struktury dodatkowych cząsteczek biologicznych w rozdzielczości subnanometrowej w ich natywnym kontekście 12,13,14,15,16,17,18.
Jednym z powszechnych zastosowań cryoET jest wizualizacja morfologii, organizacji i struktury wirusa. Pomimo niższej rozdzielczości oferowanej przez tę technikę w porównaniu z krylografią pojedynczą, krylografią rentgenowską lub krystalografią rentgenowską, cryoET w połączeniu ze średnią subtomogramową może dostarczyć informacji o zachowaniu białek wirusowych w ich środowisku rodzimym oraz dostarczyć kluczowych informacji o ich organizacji w kontekście wirionu. Częstym celem krioET wirusów są glikoproteiny powierzchniowe, które są powszechnie wykorzystywane do przyczepiania i fuzji komórek gospodarza, ponieważ często są głównymi antygenami i celami terapii lub szczepionek. Dzięki ostatnim postępom w pakietach przetwarzania krioET, coraz bardziej możliwe staje się osiągnięcie średnich rozdzielczości subnanometrów dla tych glikoprotein: 19,20,21,22. Przykładem jest hemaglutynina (HA), główne białko na powierzchni wirionów grypy. To białko nie tylko przewodzi zarówno wiązaniu receptorów, jak i fuzji błonowej, ale także pokrywa wirion w niezwykle gęsty sposób, z setkami do tysięcy HAs na pojedynczym wirionie5. Protokół przedstawiony tutaj (Rysunek 1) integruje kilka powszechnie używanych pakietów z własnymi skryptami, aby wyznaczyć etapy od wstępnego przetwarzania do udoskonalania modelu, tworząc subtomogramową średnią HAA grypy.

<table><tbody><tr><td>AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WX</td><td>AMD</td><td>https://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html</td><td></td></tr><tr><td>AreTomo 1.3.4</td><td>UC San Francisco</td><td>https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_</td><td></td></tr><tr><td>EMAN2 2.99.52</td><td>Baylor College of Medicine</td><td>https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td><td></td></tr><tr><td>IMOD 4.12.27</td><td>Uniwersytet Kolorado w Boulder</td><td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td></td></tr><tr><td>Skrypty analizy grypy</td><td>Szkoła Medyczna UMass Chan</td><td>https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis</td><td></td></tr><tr><td>IsoNet 0.3</td><td>UCLA</td><td>https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet</td><td></td></tr><tr><td>M 2.0.0</td><td>Genentech</td><td>https://warpem.github.io/warp/home/m/</td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA A4000</td><td>NVIDIA&nbsp;</td><td>https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/</td><td></td></tr><tr><td>Open3D&nbsp;</td><td>Intel Labs</td><td>https://www.open3d.org/</td><td></td></tr><tr><td>PHENIX 1.21-5207</td><td>Narodowe Laboratorium Lawrence'a Berkeley</td><td>phenix-online.org</td><td></td></tr><tr><td>RELION 4.0</td><td>Laboratorium Biologii Molekularnej MRC</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/</td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu 20.04</td><td>Ubuntu</td><td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td><td></td></tr><tr><td>UCSF ChimeraX 1.6.1</td><td>UC San Francisco</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td><td></td></tr><tr><td>Warp 2.0.0</td><td>Genentech</td><td>http://warpem.github.io/warp/</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Subnanometer-Resolution Structural Determination of Hemagglutinin from Cryo-Electron Tomography of Influenza Viruses

Tomografia krioelektronowa jest potężnym narzędziem do wizualizacji próbek heterogenicznych, a jednym z głównych zastosowań jest charakteryzacja strukturalna wirusów pleomorficznych. W ostatnich latach subtomogramowe uśrednianie glikoproteiny wirusowych pojawiło się jako metoda bezpośredniej wizualizacji tych kluczowych białek na powierzchni nienaruszonych wirionów. Jednym z ważnych celów jest glikoprotein hemaglutyny (HA) wirusa grypy, który gęsto pokrywa otoczkę wirusa i odpowiada za wiązanie receptorów grypowych oraz fuzję błon. Chociaż średnie subtomogramów dotyczące HA grypy zostały zgłoszone, ich rozdzielczość była ograniczona ze względu na niski stosunek sygnału do szumu charakterystyczny dla krioET oraz ręczny wysiłek wymagany do analizy heterogennych wirusów grypy. Przedstawiono tutaj pipeline analizy cryoET, który integruje kilka pakietów oprogramowania do efektywnej i solidnej analizy danych tomograficznych wirusów grypy. Protokół ten opisuje wyznaczenie strukturalne HA na podstawie wirusów grypy, poprzez etapy od początkowej korekty ruchu aż do ostatecznej budowy modelu. Po tym procesie uzyskano rekonstrukcję HA o rozdzielczości 6,0 Å z dwóch zestawów danych krioET zebranych ze szczepu grypy A/Puerto Rico/8/34 (PR8).

Aby wykazać wykorzystanie tego protokołu przetwarzania (Rysunek 1), wcześniej opisany workflow zastosowano do dwóch zbiorów danych po 25 tomogramów połączonych, uzyskanych ze szczepu wirusa grypy A H1N1 (A/Portoryko/8/1934). Parametry zbierania danych przedstawiono w Tabeli 1. Rysunek 2 ilustruje reprezentatywny tomogram oraz powiększone widoki pleomorficznych wirusów grypy. Tomogram ten uchwycił różnorodne morfologie, ponieważ wiriony mają kszt...

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Cryo-electron tomography is a powerful tool to visualize heterogeneous samples, with one major application being structural characterization of ...

Nasze laboratorium wykorzystuje biologię strukturalną do badania wirusów oraz ewolucji oporności na leki. W obecnych badaniach charakteryzujemy, jak hemaglutinina grypa zmienia konformację po wiązaniu receptorów. Wykorzystaliśmy tomografię krioelektronową do wizualizacji morfologii, organizacji i struktury wirusa.Konkretnie, zastosowaliśmy tę metodę mikroskopii krioelektronowej do obrazowania pleomorficznego wirusa grypy. Nasz protokół pozwala nam badać organizację i strukturę hemaglutininy grypy in situ na nienaruszonych wirusach z rozdzielczością poniżej nanometrów. Ta wyższa rozdzielczość pozwala nam wizualizować wcześniej ukryte interakcje.Na początek uruchom terminal Linux do aktywacji środowiska Conda. Użyj terminala, aby aktywować środowisko Conda z zainstalowaną siecią ISO. Utwórz podfolder o nazwie tomo folder, a następnie przenieś do niego wszystkie pliki tomogramów.Następnie użyj kodu do wygenerowania pliku gwiazdkowego w folderze projektu. Za pomocą edytora tekstu otwórz wygenerowany plik gwiazdy i wprowadź przybliżoną wartość defokusu dla obrazów o nachyleniu zerowym do czwartej kolumny. Teraz uruchom komendę splotu CTFD w terminalu.Po dekonwolucji aktywuj środowisko GUI EMAN2, aby rozpocząć wstępne przetwarzanie do pobierania cząstek. W sekcji tomografia kliknij lewym przyciskiem strzałki obok surowych danych, wybierz import tomogramów z menu rozwijanego i wybierz pliki. Następnie kliknij strzałkę obok segmentacji i wybierz tomogramy wstępnie przetworzone.Używaj odpowiednich parametrów domyślnych. Po wstępnym przetwarzaniu automatycznie zostanie utworzony katalog informacji z pustymi plikami JSON odpowiadającymi nazwom bazowym plików tomografii procesowej. Dodaj informacje o pikselach angstrom do plików przed kontynuowaniem.Aby wytrenować sieć neuronową splotową, czyli CNN, do rozpoznawania glikoproteiny HA, zmień katalog roboczy na lokalizację tomogramów, które mają być użyte. Następnie otwórz interfejs szkoleniowy CNN za pomocą terminala. Sprawdź, że cztery okna są otwarte.Jedno zawierało informacje o parametrach CNN i tomogramach w katalogu, a pozostałe trzy okna zawierały obrazy dobrych referencji, złych referencji i cząstek wybranych przez CNN. W interfejsie CNN kliknij nową opcję inicjalizacji CNN z domyślną częstotliwością uczenia się 0,0001 i rozmiarem pola ośmiu. W kolumnie nazwy pliku kliknij lewym przyciskiem na reprezentatywny tomogram, aby go otworzyć.Najedź kursorem na otwarty tomogram i kliknij kółko przewijania, aby otworzyć nowe okno. Kliknij lewym przyciskiem suwaka liczby N, aby przejść wzdłuż osi Z. Następnie na otwartym tomogramie użyj panelu dobrych odniesień, aby wybrać 10 do 20 cech odpowiadających HA. W pozytywnym oknie pojawiają się pozytywne obrazy.Aby usunąć jeden, przytrzymaj shift i kliknij lewym przyciskiem. Teraz przełącz się do panelu błędnych referencji i wybierz 10 do 20 odniesień odpowiadających cechom takim jak puste łaty membran, gęstość RNP, markery fiducial i zanieczyszczenia. Ustaw liczbę iteracji na 50 i kliknij ikonę pociągu, aby rozpocząć szkolenie CNN.Po zakończeniu szkolenia naciśnij aplikuj. Wybrane cząstki będą wyświetlane na tomogramie jako niebieskie kółka lub widoczne w oknie cząstek. Kontynuuj udoskonalanie, wybierając dodatkowe pozytywne i negatywne odniesienia, okresowo klikając zapisz, aby zachować postęp.Gdy CNN działa zadowolony, kliknij "zastosuj wszystko", aby uruchomić pobieranie cząstek. Następnie oceniam wyniki na kilku tomogramach i w razie potrzeby przeszkolenia się ponownie. Aby zapisać współrzędne dla każdego tomogramu, ponownie otwórz interfejs EMAN2 za pomocą polecenia e2projectmanager.py.Kliknij strzałkę w sekcji średnia subtomogramu i wybierz boks manualny. Teraz wpisz nazwę tomogramu i kliknij "startuj". Następnie klikaj kolejno na plik, na kabel z pudełkiem zapisu i tomogram_ha.txt, aby zapisać współrzędne. Przejdź do podfolderu sieci neuronowej oraz podfolderów info, aby zrobić kopię zapasową i zapisać w sieci. HDF, treningi.HDF, segouts. hdf oraz boxes3Dref.hdf. Wytrenuj drugi CNN do wykrywania warstwy białkowej M1 i obecności VRNP, zmieniając rozmiar pola treningowego z ośmiu na czternaście.Aby selekcjonować cząstki, najpierw pobierz notatniki z repozytorium GitHub. Następnie otwórz notatnik CNN particle cleaning w zeszycie IPYNB i załaduj wymagane moduły. Wczytuj pliki tekstowe z współrzędnymi HA i M1 do notesu.Zobacz je jako chmury 3D za pomocą otwartej biblioteki 3D. Następnie odfiltruj wartości odstawczej współrzędnych HA za pomocą otwartej metody 3D statystycznego usuwania odstających odstających. Następnie oblicz odległości między chmurami punktów HA i M1, identyfikując punkty HA powyżej 20 pikseli od M1 jako wartości odstające i zapisz pozostałe współrzędne do pliku tekstowego wyjściowego.Połącz wszystkie cząstki i zapisz je jako pliki gwiazdkowe za pomocą pliku gwiazdek pts2. IPYNB. Za pomocą WarpTools wyodrębnij cząstki o współczynniku zginania cztery i wykonaj początkowe uśrednianie subtomogramów w RELION minus cztery za pomocą kodu. Przekonwertuj plik gwiazdy warp do formatu RELION 4.Następnie generuj początkową referencję za pomocą RELION refine MPI na podzbiorze cząstek. Wykonaj automatyczne dopracowywanie 3D na subtomogramach za pomocą RELION refine MPI. Po zbieżności powtórz automatyczne dorafinowanie z przesuniętym na osiem i krokiem do dwóch.Wykorzystanie klasyfikacji 2D do usuwania cząstek śmieciowych za pomocą rafinacji RELION. Stwórz pliki gwiazdkowe z dobrymi klasami za pomocą kodu, a następnie połącz poszczególne pliki gwiazdek. Reprezentatywne tomogramy ujawniły pleomorficzne wiriony o kształtach od kulistych po wydłużone.Ostateczna średnia subtomogramu osiągnęła globalną rozdzielczość 6,0 angstremów z lokalną rozdzielczością od pięciu do siedmiu angstremów. Helisy alfa i arkusze beta zostały rozwiązane w ostatecznej rekonstrukcji HA, co wspiera jakość strukturalną dopracowanej mapy. Miejsca glikozylacji można było zidentyfikować w czterech miejscach na głowicy i łodygu HA, co potwierdza widoczność gęstości glikanu w końcowej rekonstrukcji.

subnanometer-resolution-structural-determination-hemagglutinin-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Przedstawiono podejście do określania struktur kompleksów glikoprotein błony wirusowej za pomocą kombinacji kriotomografii elektronowej i uśredniania sub-tomogramu za pomocą pakietu obliczeniowego Jsubtomomo.

Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę tomografii krioelektronowej do badania konformacji hemaglutininy wirusa grypy przy wiązaniu receptora. Protokół umożliwia wizualizację struktury wirusa w rozdzielczości subnanometrowej.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Przeglądaj więcej filmów