Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Nasze laboratorium wykorzystuje biologię strukturalną do badania wirusów oraz ewolucji oporności na leki. W obecnych badaniach charakteryzujemy, jak hemaglutinina grypa zmienia konformację po wiązaniu receptorów. Wykorzystaliśmy tomografię krioelektronową do wizualizacji morfologii, organizacji i struktury wirusa.

Konkretnie, zastosowaliśmy tę metodę mikroskopii krioelektronowej do obrazowania pleomorficznego wirusa grypy. Nasz protokół pozwala nam badać organizację i strukturę hemaglutininy grypy in situ na nienaruszonych wirusach z rozdzielczością poniżej nanometrów. Ta wyższa rozdzielczość pozwala nam wizualizować wcześniej ukryte interakcje.

Na początek uruchom terminal Linux do aktywacji środowiska Conda. Użyj terminala, aby aktywować środowisko Conda z zainstalowaną siecią ISO. Utwórz podfolder o nazwie tomo folder, a następnie przenieś do niego wszystkie pliki tomogramów.

Następnie użyj kodu do wygenerowania pliku gwiazdkowego w folderze projektu. Za pomocą edytora tekstu otwórz wygenerowany plik gwiazdy i wprowadź przybliżoną wartość defokusu dla obrazów o nachyleniu zerowym do czwartej kolumny. Teraz uruchom komendę splotu CTFD w terminalu.

Po dekonwolucji aktywuj środowisko GUI EMAN2, aby rozpocząć wstępne przetwarzanie do pobierania cząstek. W sekcji tomografia kliknij lewym przyciskiem strzałki obok surowych danych, wybierz import tomogramów z menu rozwijanego i wybierz pliki. Następnie kliknij strzałkę obok segmentacji i wybierz tomogramy wstępnie przetworzone.

Używaj odpowiednich parametrów domyślnych. Po wstępnym przetwarzaniu automatycznie zostanie utworzony katalog informacji z pustymi plikami JSON odpowiadającymi nazwom bazowym plików tomografii procesowej. Dodaj informacje o pikselach angstrom do plików przed kontynuowaniem.

Aby wytrenować sieć neuronową splotową, czyli CNN, do rozpoznawania glikoproteiny HA, zmień katalog roboczy na lokalizację tomogramów, które mają być użyte. Następnie otwórz interfejs szkoleniowy CNN za pomocą terminala. Sprawdź, że cztery okna są otwarte.

Jedno zawierało informacje o parametrach CNN i tomogramach w katalogu, a pozostałe trzy okna zawierały obrazy dobrych referencji, złych referencji i cząstek wybranych przez CNN. W interfejsie CNN kliknij nową opcję inicjalizacji CNN z domyślną częstotliwością uczenia się 0,0001 i rozmiarem pola ośmiu. W kolumnie nazwy pliku kliknij lewym przyciskiem na reprezentatywny tomogram, aby go otworzyć.

Najedź kursorem na otwarty tomogram i kliknij kółko przewijania, aby otworzyć nowe okno. Kliknij lewym przyciskiem suwaka liczby N, aby przejść wzdłuż osi Z. Następnie na otwartym tomogramie użyj panelu dobrych odniesień, aby wybrać 10 do 20 cech odpowiadających HA. W pozytywnym oknie pojawiają się pozytywne obrazy.

Aby usunąć jeden, przytrzymaj shift i kliknij lewym przyciskiem. Teraz przełącz się do panelu błędnych referencji i wybierz 10 do 20 odniesień odpowiadających cechom takim jak puste łaty membran, gęstość RNP, markery fiducial i zanieczyszczenia. Ustaw liczbę iteracji na 50 i kliknij ikonę pociągu, aby rozpocząć szkolenie CNN.

Po zakończeniu szkolenia naciśnij aplikuj. Wybrane cząstki będą wyświetlane na tomogramie jako niebieskie kółka lub widoczne w oknie cząstek. Kontynuuj udoskonalanie, wybierając dodatkowe pozytywne i negatywne odniesienia, okresowo klikając zapisz, aby zachować postęp.

Gdy CNN działa zadowolony, kliknij "zastosuj wszystko", aby uruchomić pobieranie cząstek. Następnie oceniam wyniki na kilku tomogramach i w razie potrzeby przeszkolenia się ponownie. Aby zapisać współrzędne dla każdego tomogramu, ponownie otwórz interfejs EMAN2 za pomocą polecenia e2projectmanager.py.

Kliknij strzałkę w sekcji średnia subtomogramu i wybierz boks manualny. Teraz wpisz nazwę tomogramu i kliknij "startuj". Następnie klikaj kolejno na plik, na kabel z pudełkiem zapisu i tomogram_ha.

txt, aby zapisać współrzędne. Przejdź do podfolderu sieci neuronowej oraz podfolderów info, aby zrobić kopię zapasową i zapisać w sieci. HDF, treningi.

HDF, segouts. hdf oraz boxes3Dref.hdf. Wytrenuj drugi CNN do wykrywania warstwy białkowej M1 i obecności VRNP, zmieniając rozmiar pola treningowego z ośmiu na czternaście.

Aby selekcjonować cząstki, najpierw pobierz notatniki z repozytorium GitHub. Następnie otwórz notatnik CNN particle cleaning w zeszycie IPYNB i załaduj wymagane moduły. Wczytuj pliki tekstowe z współrzędnymi HA i M1 do notesu.

Zobacz je jako chmury 3D za pomocą otwartej biblioteki 3D. Następnie odfiltruj wartości odstawczej współrzędnych HA za pomocą otwartej metody 3D statystycznego usuwania odstających odstających. Następnie oblicz odległości między chmurami punktów HA i M1, identyfikując punkty HA powyżej 20 pikseli od M1 jako wartości odstające i zapisz pozostałe współrzędne do pliku tekstowego wyjściowego.

Połącz wszystkie cząstki i zapisz je jako pliki gwiazdkowe za pomocą pliku gwiazdek pts2. IPYNB. Za pomocą WarpTools wyodrębnij cząstki o współczynniku zginania cztery i wykonaj początkowe uśrednianie subtomogramów w RELION minus cztery za pomocą kodu. Przekonwertuj plik gwiazdy warp do formatu RELION 4.

Następnie generuj początkową referencję za pomocą RELION refine MPI na podzbiorze cząstek. Wykonaj automatyczne dopracowywanie 3D na subtomogramach za pomocą RELION refine MPI. Po zbieżności powtórz automatyczne dorafinowanie z przesuniętym na osiem i krokiem do dwóch.

Wykorzystanie klasyfikacji 2D do usuwania cząstek śmieciowych za pomocą rafinacji RELION. Stwórz pliki gwiazdkowe z dobrymi klasami za pomocą kodu, a następnie połącz poszczególne pliki gwiazdek. Reprezentatywne tomogramy ujawniły pleomorficzne wiriony o kształtach od kulistych po wydłużone.

Ostateczna średnia subtomogramu osiągnęła globalną rozdzielczość 6,0 angstremów z lokalną rozdzielczością od pięciu do siedmiu angstremów. Helisy alfa i arkusze beta zostały rozwiązane w ostatecznej rekonstrukcji HA, co wspiera jakość strukturalną dopracowanej mapy. Miejsca glikozylacji można było zidentyfikować w czterech miejscach na głowicy i łodygu HA, co potwierdza widoczność gęstości glikanu w końcowej rekonstrukcji.