Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy
November 7th, 2025
W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.
Nasze laboratorium wykorzystuje biologię strukturalną do badania wirusów oraz ewolucji oporności na leki. W obecnych badaniach charakteryzujemy, jak hemaglutinina grypa zmienia konformację po wiązaniu receptorów. Wykorzystaliśmy tomografię krioelektronową do wizualizacji morfologii, organizacji i struktury wirusa.
Konkretnie, zastosowaliśmy tę metodę mikroskopii krioelektronowej do obrazowania pleomorficznego wirusa grypy. Nasz protokół pozwala nam badać organizację i strukturę hemaglutininy grypy in situ na nienaruszonych wirusach z rozdzielczością poniżej nanometrów. Ta wyższa rozdzielczość pozwala nam wizualizować wcześniej ukryte interakcje.
Na początek uruchom terminal Linux do aktywacji środowiska Conda. Użyj terminala, aby aktywować środowisko Conda z zainstalowaną siecią ISO. Utwórz podfolder o nazwie tomo folder, a następnie przenieś do niego wszystkie pliki tomogramów.
Następnie użyj kodu do wygenerowania pliku gwiazdkowego w folderze projektu. Za pomocą edytora tekstu otwórz wygenerowany plik gwiazdy i wprowadź przybliżoną wartość defokusu dla obrazów o nachyleniu zerowym do czwartej kolumny. Teraz uruchom komendę splotu CTFD w terminalu.
Po dekonwolucji aktywuj środowisko GUI EMAN2, aby rozpocząć wstępne przetwarzanie do pobierania cząstek. W sekcji tomografia kliknij lewym przyciskiem strzałki obok surowych danych, wybierz import tomogramów z menu rozwijanego i wybierz pliki. Następnie kliknij strzałkę obok segmentacji i wybierz tomogramy wstępnie przetworzone.
Używaj odpowiednich parametrów domyślnych. Po wstępnym przetwarzaniu automatycznie zostanie utworzony katalog informacji z pustymi plikami JSON odpowiadającymi nazwom bazowym plików tomografii procesowej. Dodaj informacje o pikselach angstrom do plików przed kontynuowaniem.
Aby wytrenować sieć neuronową splotową, czyli CNN, do rozpoznawania glikoproteiny HA, zmień katalog roboczy na lokalizację tomogramów, które mają być użyte. Następnie otwórz interfejs szkoleniowy CNN za pomocą terminala. Sprawdź, że cztery okna są otwarte.
Jedno zawierało informacje o parametrach CNN i tomogramach w katalogu, a pozostałe trzy okna zawierały obrazy dobrych referencji, złych referencji i cząstek wybranych przez CNN. W interfejsie CNN kliknij nową opcję inicjalizacji CNN z domyślną częstotliwością uczenia się 0,0001 i rozmiarem pola ośmiu. W kolumnie nazwy pliku kliknij lewym przyciskiem na reprezentatywny tomogram, aby go otworzyć.
Najedź kursorem na otwarty tomogram i kliknij kółko przewijania, aby otworzyć nowe okno. Kliknij lewym przyciskiem suwaka liczby N, aby przejść wzdłuż osi Z. Następnie na otwartym tomogramie użyj panelu dobrych odniesień, aby wybrać 10 do 20 cech odpowiadających HA. W pozytywnym oknie pojawiają się pozytywne obrazy.
Aby usunąć jeden, przytrzymaj shift i kliknij lewym przyciskiem. Teraz przełącz się do panelu błędnych referencji i wybierz 10 do 20 odniesień odpowiadających cechom takim jak puste łaty membran, gęstość RNP, markery fiducial i zanieczyszczenia. Ustaw liczbę iteracji na 50 i kliknij ikonę pociągu, aby rozpocząć szkolenie CNN.
Po zakończeniu szkolenia naciśnij aplikuj. Wybrane cząstki będą wyświetlane na tomogramie jako niebieskie kółka lub widoczne w oknie cząstek. Kontynuuj udoskonalanie, wybierając dodatkowe pozytywne i negatywne odniesienia, okresowo klikając zapisz, aby zachować postęp.
Gdy CNN działa zadowolony, kliknij "zastosuj wszystko", aby uruchomić pobieranie cząstek. Następnie oceniam wyniki na kilku tomogramach i w razie potrzeby przeszkolenia się ponownie. Aby zapisać współrzędne dla każdego tomogramu, ponownie otwórz interfejs EMAN2 za pomocą polecenia e2projectmanager.py.
Kliknij strzałkę w sekcji średnia subtomogramu i wybierz boks manualny. Teraz wpisz nazwę tomogramu i kliknij "startuj". Następnie klikaj kolejno na plik, na kabel z pudełkiem zapisu i tomogram_ha.
txt, aby zapisać współrzędne. Przejdź do podfolderu sieci neuronowej oraz podfolderów info, aby zrobić kopię zapasową i zapisać w sieci. HDF, treningi.
HDF, segouts. hdf oraz boxes3Dref.hdf. Wytrenuj drugi CNN do wykrywania warstwy białkowej M1 i obecności VRNP, zmieniając rozmiar pola treningowego z ośmiu na czternaście.
Aby selekcjonować cząstki, najpierw pobierz notatniki z repozytorium GitHub. Następnie otwórz notatnik CNN particle cleaning w zeszycie IPYNB i załaduj wymagane moduły. Wczytuj pliki tekstowe z współrzędnymi HA i M1 do notesu.
Zobacz je jako chmury 3D za pomocą otwartej biblioteki 3D. Następnie odfiltruj wartości odstawczej współrzędnych HA za pomocą otwartej metody 3D statystycznego usuwania odstających odstających. Następnie oblicz odległości między chmurami punktów HA i M1, identyfikując punkty HA powyżej 20 pikseli od M1 jako wartości odstające i zapisz pozostałe współrzędne do pliku tekstowego wyjściowego.
Połącz wszystkie cząstki i zapisz je jako pliki gwiazdkowe za pomocą pliku gwiazdek pts2. IPYNB. Za pomocą WarpTools wyodrębnij cząstki o współczynniku zginania cztery i wykonaj początkowe uśrednianie subtomogramów w RELION minus cztery za pomocą kodu. Przekonwertuj plik gwiazdy warp do formatu RELION 4.
Następnie generuj początkową referencję za pomocą RELION refine MPI na podzbiorze cząstek. Wykonaj automatyczne dopracowywanie 3D na subtomogramach za pomocą RELION refine MPI. Po zbieżności powtórz automatyczne dorafinowanie z przesuniętym na osiem i krokiem do dwóch.
Wykorzystanie klasyfikacji 2D do usuwania cząstek śmieciowych za pomocą rafinacji RELION. Stwórz pliki gwiazdkowe z dobrymi klasami za pomocą kodu, a następnie połącz poszczególne pliki gwiazdek. Reprezentatywne tomogramy ujawniły pleomorficzne wiriony o kształtach od kulistych po wydłużone.
Ostateczna średnia subtomogramu osiągnęła globalną rozdzielczość 6,0 angstremów z lokalną rozdzielczością od pięciu do siedmiu angstremów. Helisy alfa i arkusze beta zostały rozwiązane w ostatecznej rekonstrukcji HA, co wspiera jakość strukturalną dopracowanej mapy. Miejsca glikozylacji można było zidentyfikować w czterech miejscach na głowicy i łodygu HA, co potwierdza widoczność gęstości glikanu w końcowej rekonstrukcji.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół badania konformacji hemaglutynininy grypy podczas wiązania z receptorem z wykorzystaniem krio-elektronowej tomografii. Protokół umożliwia wizualizacje morfologii i struktury wirusa z rozdzielczością sub-nanometrową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Wirologia
- Krio-elektronowa tomografia
Tło
- Wirusy grypy wykazują pleomorficzna morfologię.
- Hemaglutyninina jest kluczowym glikoproteinem zaangażowanym w wiązanie z receptorem.
- Zrozumienie zmian konformacyjnych może pomóc w badaniach nad opornością na leki.
- Krio-elektronowa tomografia zapewnia możliwość wykonywania wysokiej rozdzielczości obrazów.
Cel badania
- Zcharakteryzowanie zmian konformacyjnych hemaglutynininy podczas wiązania z receptorem.
- Wizualizacja organizacji i struktury wirusów grypy.
- Zgłębienie zrozumienia interakcji wirusowych na poziomie molekularnym.
Zastosowanie metod
- Krio-elektronowa tomografia do wizualizacji struktur wirusowych.
- Średnia subtomogramowa do udoskonalania modelu.
- Techniki wstępnej obróbki obrazu do poprawy danych.
- Wizualizacja hemaglutynininy in situ na nienaruszonych wirusach.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja hemaglutynininy grypy z rozdzielczością sub-nanometrową.
- Identyfikacja wcześniej ukrytych interakcji podczas wiązania z receptorem.
- Szczegółowe wglądy strukturalne w organizację wirusa.
- Ustalony protokół na przyszłe badania nad glikoproteinami wirusowymi.
Wnioski
- Protokół umożliwia analizę z wysoką rozdzielczością hemaglutynininy grypy.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia struktury i funkcji wirusa.
- To podejście może być zastosowane do innych badań wirusowych w biologii strukturalnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Subnanometer-resolution cryo-electron tomography of influenza hemagglutinin (HA) enables direct structural interrogation of viral glycoproteins in their native context, addressing a critical challenge in target validation for antiviral discovery. This workflow enhances predictive confidence in structure-based drug design and supports mechanistic de-risking at the earliest stages of antiviral portfolio development. The robust pipeline for HA visualization on intact virions positions structural biology as a foundational capability for translational virology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HA conformation and organization on pleomorphic influenza virions.
- Supports functional target validation by resolving glycosylation sites and protein-protein interactions at subnanometer scale.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural features relevant to receptor binding and membrane fusion.
- Improves predictive confidence for downstream inhibitor or vaccine design targeting HA.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for in silico screening and rational design workflows.
- Standardizes particle picking and subtomogram averaging for reproducible structural outputs.
- Enables quantitative assessment of glycoprotein density and distribution on virion surfaces.
- Supports assay development by confirming the presence and accessibility of key epitopes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural findings with disease-relevant viral strains and glycoprotein variants.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation of HA-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by providing high-resolution structural benchmarks.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoET pipeline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research for antiviral programs.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution structural data to test mechanistic hypotheses about HA function and viral entry.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative structural outputs for computational and experimental screening platforms.
- Analytics: Provides robust measurements of glycosylation, secondary structure, and protein organization for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by characterizing clinically relevant viral strains.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modular workflow for structural analysis of diverse viral glycoproteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target structure and function.
- Operational Value: Standardizes data processing and analysis for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated structural engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of antiviral assets based on structural benchmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron tomography, image processing, and neural network-based particle picking.
- Demands access to high-performance computing infrastructure and specialized software (e.g., EMAN2, RELION).
- Necessitates cross-team standardization of data formats, annotation, and quality control.
- Adaptation to other viral systems may require retraining of neural networks and protocol optimization.
- Resolution and throughput are limited by sample heterogeneity and data acquisition constraints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Preprocessing CryoElectron Tomograms and Convolutional Neural NetworkBased Particle Picking for HA Glycoprotein and M1 Protein Identification
5:32
Particle Curation and Subtomogram Averaging Workflow Using RELION and WarpTools
7:30
Results
