Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Nasze obecne badania koncentrują się na zrozumieniu chorób raka płuc oraz na opracowywaniu nowych metod leczenia zgodnych ze standardową terapią, w tym chemioterapii, radioterapii i immunoterapii. Nie udało nam się znaleźć ortotopowego modelu raka płuc, który ustanowiłby kryteria do konkretnego badania wczesnego stadium raka płuc. Pracujemy nad dostarczaniem jasnych i powtarzalnych wytycznych, które uzupełnią tę lukę w tym protokole.

Protokół ten jest minimalnie inwazyjny i prosty w wykonaniu. Dodatkowo, zgodnie z przedstawionymi przez nas kryteriami, protokół ten umożliwia dokładne badanie implantacji guza oraz umożliwia wczesne wykrycie guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Protokół ten umożliwia badaczom badanie wczesnego stadium raka płuc w tkance gospodarza, co umożliwia przedkliniczny rozwój nowych terapii nowotworowych oraz badania mikrośrodowiska nowotworowego.

Wykorzystamy tę technikę, aby ocenić mechanizmy i skuteczność ekscytujących nowych metod leczenia raka płuc przedklinicznie i mieć nadzieję, że doprowadzi ona do przyszłej opieki nad pacjentem. Na początek umieść znieczuloną mysz w stożku nosowym w pozycji leżącej na brzuchu na urządzeniu grzewczym i nałóż maść okulistą na oba oczy myszy. Gdy znieczulenie zostanie potwierdzone, użyj elektrycznych obcinaczek, aby usunąć sierść z prostokątnego obszaru o wymiarach dwa na trzy centymetry po lewej grzbietowej stronie myszy.

Gol się od kręgosłupa od środka, stołu od boku, ostatniego żebra od dołu i górnej krawędzi łopatki w kierunku głowy, aż futro nie będzie widoczne. Umieść mysz w pustej klatce na urządzeniu grzewczym. Obserwuj wzorzec oddechu, aż mysz odzyska czujność, a następnie wróć ją do klatki do czasu operacji.

W dniu pobierania komórek należy dodać świeże podłoże zawierające 50 miligramów gentamycyny na mililitr na płytkę hodowlową na trzy do czterech godzin przed pobraniem. Aspiruj podłoże z płytki hodowlowej i przemyj przymocowane komórki 1x PBS. Następnie inkubuj komórki roztworem trypsyny EDTA przez jedną do dwóch minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj świeże medium, aby zneutralizować trypsynę. Rozproszyj komórki, delikatnie stukając lub pipetując płytkę. Następnie zbieraj zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 50 milimetrów.

Teraz wiruj stożkową rurkę w temperaturze 1 200 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po potwierdzeniu obecności zwartego pelletu na dnie zasysaj supernatant i przemyj go PBS. Ponownie zawiesij wymyty pellet komórkowy w PBS, aby uzyskać stężenie około 1 do 2 milionów komórek na mililitr do liczenia.

Przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa o średnicy 40 mikrometrów przed dalszą pracą. Następnie połącz 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwowej z 10 mikrolitrami trypanowego niebieskiego. Załaduj zabarwioną próbkę do hemocytometru i policz komórki.

Oblicz całkowitą liczbę komórek i żywotność komórek. Ponownie wiruj ogniwa w 1 200 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i aspiruj PBS opuszczając pellet. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr żelu metra w PBS.

Dostosuj do pożądanej liczby komórek przy całkowitej objętości zastrzyku 50 mikrolitrów. Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie, aby zapobiec zastygnięciu matrigelu. Oczyść miejsce operacji u znieczulonego zwierzęcia trzy razy sterylną gazą, na przemian podawając betadynę i 70% etanolu.

Na mysz umieszcza sterylizowaną, fenestrowaną zasłonę chirurgiczną z otworem o wymiarach trzy na cztery centymetry i rozkłada na niej autoklawowe narzędzia chirurgiczne. Za pomocą kleszczy zidentyfikuj krawędź czaszki łopatki oraz krawędź piersiowej klatki piersiowej. Trzymając skórę napiętą między kciukiem a palcem wskazującym chirurga, wykonaj powierzchowne nacięcie skóry o średnicy pięciu milimetrów bezpośrednio poniżej łopatki, używając ostrza skalpela rozmiaru 10.

Następnie użyj prostych nożyczek 115 milimetrów, aby tępić tłuszcz podskórny z dala od żeber i mięśni międzyżebrowych, nie przecinając ich. Aby zatrzymać lekkie krwawienie spowodowane uszkodzeniem naczyń włosowatych, delikatnie przyciskaj sterylny aplikator z bawełnianym końcem na miejsce krwawienia. Trzymaj nacięcie otwarte za pomocą mikro ataków i kleszczy.

Zaczynając od siódmego prawdziwego żebra, użyj zakrzywionych kleszczy w punktach środkowych, aby liczyć w górę i lokalizować czwarte i piąte żebro. Oznacz ten obszar jako miejsce wstrzyknięcia. Teraz delikatnie odwróć rurkę zawiesiny ogniwowej trzy do czterech razy, aby wymieszać.

Tuż przed wstrzyknięciem nabierz 50 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej 300-mikrolitrowej strzykawki insulinowej 31 gauge 8 milimetrów, upewniając się, że nie ma żadnych bąbelków. Przyłóż do strzykawki taśmę o grubości czterech milimetrów wysterylizowanej taśmy metalowej, aby działać jako korek i kontrolować głębokość wstrzykiwania. Wstrzyknij zawiesinę ogniwa 50 mikrolitrów pod kątem 90 stopni w przestrzeń międzyżebrową między żebrami czwartym i piątym, bezpośrednio pod czwartym żebrem i utrzymuj igłę w pozycji przez dwie do trzech sekund.

Powoli wyjmij igłę pod tym samym kątem, pod jakim została włożona, i wyrzuć ją do pojemnika na ostre przedmioty. Na koniec zamknij nacięcie skórne za pomocą dwóch do trzech kwadratowych szwów szlachowanych i nałóż na szwy klej chirurgiczny weterynarii, aby wzmocnić zamknięcie rany. Obrazowanie bioluminescencyjne wykryło sygnały związane z nowotworem u myszy eksperymentalnych już jeden dzień po podaniu iniekcji, a promieniowanie widocznie wzrastało z czasem zarówno dla grupy 25 000, jak i 50 000 komórek na mys, z większą intensywnością obserwowaną w grupie 50 000 komórek.

Całkowity strumień nowotworów wzrósł wykładniczo zarówno w grupach 25 000, jak i 50 000 komórek, osiągając ponad 10 razy 10 do mocy ośmiu fotonów na sekundę do 21. dnia w grupie 50 000 komórek. Myszy fałszywe nie wykazywały luminescencji ani widocznego guza w rozciętych płucach, podczas gdy myszy eksperymentalne wykazywały wysoką luminescencję i czerwone masy guzów w tkance płucnej. 21 dni po podaniu iniekcji, włączone myszy wykazywały guzy ograniczone do lewego płata płuca, bez inwazji do okolicznych regionów.