Name: Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną metodę tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu raka płuc u myszy. Protokół umożliwia wczesne wykrywanie nowotworów dzięki obrazowaniu bioluminescencyjnemu i wspiera badania przedkliniczne nowych terapii onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratoriów Cartera i Sheffielda, Susan Walsh, Bryanowi Allenowi oraz Kranti Mapuskar, za cenne dyskusje. Chcielibyśmy również podziękować Samanthcie Eckley, starszej weterynarzce klinicznej w Biurze Zasobów Zwierzęcych, za jej wskazówki i rady. Chcielibyśmy podziękować za wykorzystanie systemu obrazowania IVIS Lumina S5 w Small Animal Imaging Facility Core, kluczowego zasobu wspieranego przez Wydział Radiologii Uniwersytetu Iowa. Ilustracje graficzne na podstawie figurek wygenerowanych za pomocą Biorender (https://biorender.com). Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health NCI R21CA256301 (C.S.C., V.C.S.), Program Biologii Promieniowania Wolnych Radykalnych NCI T32CA078586 (S.C.H.), system obrazowania IVIS Lumina S5 zakupiony na 1S10OD026835.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt są przeglądane i zatwierdzane przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Iowa (IACUC). Myszy C57BL6/N (w wieku 4-6 tygodni) są kupowane i aklimatyzowane przez co najmniej tydzień przed operacją. Wszystkie zwierzęta są na 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta są trzymane po 4 osoby w klatce i mają pełny dostęp do jedzenia i wody aż do momentu znieczulenia.
1. Selekcja i wzrost komórek do wstrzykiwania
<ol>
	<li>Wykonaj test lucyferazowy, aby wybrać linię komórkową opisaną w35.<ol>
		<li>Hodować komórki LLC-luc w zmodyfikowanym medium Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym o 10% płodowe surowicę bydła (FBS), L-glutaminę oraz penicylinę/streptomycynę w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C i wysokiej wilgotności. Wykonaj test, gdy komórki są w 50%-100% zbiegu.</li>
		<li>Przed wykonaniem testu przemyj komórki 1x PBS.</li>
		<li>Dodaj 200 μL buforu lizy/dołka (25 mM Tris/fosforan, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% glicerol) do płytki o pojemności 6 dołków. Zeskrobaj komórki z dołka i przenieś do rurki mikrowirówki. Komórki spinowe w temperaturze 16 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Potwierdź, że na dnie rurki powstaje zwarte ogniwo i zbierz supernatant do nowej rurki mikrowirówki.</li>
		<li>Przełóż połowę ekstraktu z komórki do nowej rurki mikrowirówki i zachowaj na ilościowe określenie białka. Dodaj 2 mM ditiotrytolu do pozostałej połowy i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Połącz 8 μL ekstraktu komórkowego zawierającego 2 mM ditiotreitolu z 42 μL buforu testowego (25 mM Tris/fosforan, 20 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM ditiotreitol). Dodaj 50 μL 0,5-1 mM lucyferyny.</li>
		<li>Mierz maksymalną luminescencję podawaną jako względne jednostki światła (RLU) i oceniaj zawartość białka za pomocą preferowanej metody ilościowania, aby zgłosić luminescencję jako RLU na mg białka (RLU/mg).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz linię komórkową o luminescencji między 8 000 a 15 000 RLU/mg. UWAGA: Unikaj wyboru wyższej ekspresji lucyferazy (>15 000 RLU/mg), ponieważ może to nasycić instrument BLI.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Hodować komórki LLC-luc w DMEM z dodatkiem 10% FBS, L-glutaminy oraz penicyliny/streptomycyny w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C i wysokiej wilgotności przez co najmniej tydzień przed użyciem. UWAGA: Monitoruj wzrost, aby ograniczyć konfluencję do 70%-80% i podzielić się użyciem 0,25% trypsyny-EDTA w razie potrzeby, aby osiągnąć pożądaną ilość do zastrzyków opisaną wcześniejw 36.</li>
</ol>
3. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Myszy z sierścią gol się dzień przed operacją.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej, aby znieczulić ją izofluranem. Ustaw przepływ tlenu na 2,0 L/min, a waporyzator na 2% izofluranu; Dostosuj to do rozmiaru indukowanej myszy.</li>
	<li>Monitoruj oddech myszy i stosuj odruch wycofania pedałów, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Umieść mysz w stożku nosowym w pozycji leżącej na urządzeniu do ogrzewania zatwierdzonym przez IACUC. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, korzystając z odruchu wycofania pedałów, zanim kontynuuuję.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy.</li>
	<li>Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, użyj elektrycznych obcinaczek, aby usunąć duży prostokątny obszar (2 cm x 3 cm) w lewej grzbietowej części myszy. Gol do kręgosłupa przyśrodkowo, stołu bocznie, aż futro nie jest widoczne, ostatnie żebro (13.) dolne, a górna krawędź łopatki w kierunku głowy.</li>
	<li>Umieść mysz w pustej klatce na urządzeniu do ogrzewania zatwierdzonym przez IACUC i obserwuj jej oddech, aż mysz się obudzi i stanie się czujna. W tym momencie odłóż mysz do jej domowej klatki do czasu operacji.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny komórkowej do wstrzykiwania
<ol>
	<li>W dniu pobierania komórek (krok 2.2) dodaj świeże medium z 50 mg/ml gentamycyny 3-4 godziny przed pobraniem, aby usunąć martwe i odłączone komórki.</li>
	<li>Aspiruj medium i myj komórki 1x PBS. Dodaj trypsynę-EDTA i inkubuj przez 1-2 minuty w 37 °C.</li>
	<li>Rozproszyć komórki i dodać podłoże, by zneutralizować trypsynę. Zbieraj komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mL.</li>
	<li>Wiruj przy 1200 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Potwierdź, że na dnie rurki powstaje zwarte ognisko, zasysaj supernatant i przemyj granulat 1x PBS. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1x PBS przy około 1-2 milionach komórek/mL do liczenia. Przefiltruj przez sitko komórek 40 μm przed liczeniem.</li>
	<li>Połącz 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL Trypan Blue i licz za pomocą hemocytometru. Zrób zawiesinę ogniw 2x i policz obie, aby zweryfikować liczbę ogniw. Oblicz całkowitą liczbę komórek i żywotność.</li>
	<li>Ogniwa odśrodkowane na 1 200 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej do ponownego zawieszenia w końcowej objętości zastrzyku. Aspiruj PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesij komórki w 0,5 mg/mL Matrigel w 1x PBS do pożądanej liczby komórek na zastrzyk w objętości 50 μL. Utrzymuj ostatnią zawiesinę komórkową na lodzie przez cały zabieg, aby zapobiec zastyganiu. UWAGA: Ten protokół wykorzystuje komórki LLC-luc. Wstrzyknij 25 000-50 000 komórek w objętości 50 μL na mysz.</li>
</ol>
5. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Wykonaj zabieg w gabinecie chirurgicznym zatwierdzonym przez IACUC w przypadku zabiegów aseptycznych. Umyj stół operacyjny zatwierdzonym przez weterynarza środkiem dezynfekującym.</li>
	<li>Umieść zdezynfekowany termofor zatwierdzony przez IACUC w obszarze operacyjnym. Połóż sterylną chirurgiczną zasłonę na termofor.</li>
</ol>
6. Znieczulenie chirurgiczne
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej, aby znieczulić ją izofluranem. Ustaw przepływ tlenu na 2,0 L/min, a waporyzator na 2% izofluranu. UWAGA: Stężenie izofluranu można dostosować w zależności od rozmiaru myszy.</li>
	<li>Monitoruj oddech myszy i stosuj odruch cofania pedałów, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Umieść mysz w stożku nosowym w prawej pozycji bocznej leżącej na sterylnej zasłonie chirurgicznej. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, korzystając z odruchu wycofania pedałów, zanim kontynuuuję.</li>
	<li>Podaj przedoperacyjny środek przeciwbólowy, meloksykam (2 mg/kg) podskórnie oraz maść okulistyczną do obu oczu.</li>
</ol>
7. Zastrzyk ortotopowy do płuc
<ol>
	<li>Oczyść miejsce operacji 3 razy, naprzemiennie stosując 70% etanolu i betadyny za pomocą sterylnej gazy. Załóż na mysz sterylną, fenestrowaną zasłonę chirurgiczną z otworem 3 cm x 4 cm. Umieść sterylizowane narzędzia autoklawowane na zasłonie chirurgiczne.</li>
	<li>Określ miejsce wykonania nacięcia, lokalizując krawędź czaszki łopatki oraz ogonową krawędź klatki piersiowej za pomocą kleszczy. Upewnij się, że skóra jest napięta, używając kciuka i palca wskazującego chirurga, a następnie wykonaj powierzchowne nacięcie o grubości 5 mm tylko przez skórę bezpośrednio pod łopatką za pomocą ostrza rozmiaru 10. UWAGA: Chirurg musi nosić sterylne rękawiczki.</li>
	<li>Użyj prostych nożyczek o średnicy 115 mm, aby tępo rozcinać tłuszcz podskórny z żeber i mięśni międzyżebrowych. Nie przecinaj mięśni międzyżebrowych. UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić tętnicy piersiowej i głębokiej gałęzi tętnicy poprzecznej szyjnej, które znajdują się w pobliżu łopatki. Lekkie krwawienie może wystąpić w wyniku przecięcia naczyń włosowatych w skórze oraz tkanki tłuszczowej podskórnej. Zatrzymaj krwawienie, delikatnie naciskając sterylnym aplikatorem z bawełnianymi końcówkami.</li>
	<li>Użyj kleszczy Micro-Adson, aby utrzymać nacięcie otwarte. Zaczynając od siódmego prawdziwego żebra, użyj zakrzywionych kleszczy średnich do liczenia w górę, aby zidentyfikować żebra cztery i pięć. Zwróć uwagę na ten obszar do zastrzyków.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę ogniwową, delikatnie odwracając 3-4 razy. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem użyj sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 300 μL 31 G 8 mm, aby pobrać 50 μL zawiesiny komórkowej i upewnić się, że nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Do igły przyłóż pasek sterylnej taśmy metalowej o grubości 4 mm, równo z strzykawką, aby działał jak korek. Dzięki temu igła wchodzi tylko 4 mm głęboko w płuco.</li>
	<li>Wstrzyknąć zawiesinę 50 μL bezpośrednio poniżej czwartego żebra w przestrzeni międzyżebrowej między żebrem czwartym a piątym pod kątem 90° prostopadle do płuca. Po wstrzyknięciu zawiesiny komórkowej trzymaj igłę na miejscu przez 2-3 sekundy, aby Matrigel stwardniał i uniemożliwił komórkom opuszczenie miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Powoli wyjmij igłę pod tym samym kątem i wyrzuć ją do pojemnika na ostre przedmioty.</li>
	<li>Zszyj skórę 2-3 szwami, zamykając za pomocą kwadratowych węzłów, i dodaj klej chirurgiczny weterynarii, aby rana była odpowiednio zamknięta.</li>
</ol>
8. Procedury pooperacyjne
<ol>
	<li>Umieść mysz w pustej klatce na urządzeniu grzewczym zatwierdzonym przez IACUC. Obserwuj mysz, aż całkowicie wyjdzie z znieczulenia, co powinno zająć 1-2 minuty.</li>
	<li>Gdy mysz będzie czujna i rusza, umieść ją w klatce z świeżą ściółką. Obserwuj mysz często w ciągu pierwszych 24 godzin pod kątem objawów bólu lub infekcji.</li>
	<li>Podawaj lek przeciwprzeciwzapalny NLPZ, meloksykam (2 mg/kg), przez zastrzyk podskórny przez 2 dni po operacji.</li>
</ol>
9. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą in vivo BLI
<ol>
	<li>Monitoruj wzrost guza w płucach za pomocą BLI już od dnia po operacji i nawet raz dziennie.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie in vivo za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS).<ol>
		<li>Zrób lucyferynę w dawce 15 mg/mL w 1x PBS bez magnezu i wapnia. Dla myszy o masie 20 g oznacza to wstrzyknięcie 200 μL roztworu lucyferyny 15 mg/mL. UWAGA: Chroń przygotowany roztwór lucyferyny przed światłem, przykrywając folią aluminiową, gdy nie jest używany, ponieważ jest on wrażliwy na światło.</li>
		<li>Otwarte oprogramowanie i ustaw parametry dla obrazowania bioluminescencyjnego. Ustaw czas naświetlania na auto. Ustaw współczynnik wyrzucenia na 4.</li>
		<li>Wstrzyknąć myszom dootrzewną 150 mg lucyferyny na kg masy.</li>
		<li>Podczas pierwszego obrazowania nowego modelu komórek nowotworowych wykonaj krzywą kinetyczną, aby określić optymalny czas pobierania lucyferyny, co jest oznaczane momentem, gdy luminescencja osiąga szczyt, zanim zacznie się stabilizować.<ol>
			<li>Wstrzykuj myszom lucyferynę. Poczekaj 3 minuty, aż lucyferyna się pojawi.</li>
			<li>Obrazuj myszy co 5-10 minut przez 60 minut. UWAGA: Optymalny czas wchłaniania dla różnych linii komórkowych zazwyczaj wynosi od 5 do 15 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przy wszystkich kolejnych sesjach obrazowych stosuj optymalny czas pobierania lucyferyny. Znieczulaj myszy w ramach przygotowań do obrazowania w tym czasie. Myszy umieść w komorze indukcyjnej o stężeniu 2% izofluranu o przepływie 2,0 L/min.</li>
		<li>Po zakończeniu pobierania zrób dwa obrazy, wybierając Zdobyć.<ol>
			<li>Najpierw wyobraź sobie mysz leżącą w prawej pozycji bocznej leżącej. Pozwala to kamerze uchwycić miejsce wstrzyknięcia, które znajduje się po lewej bocznej części myszy. Użyj tego widoku, aby ilościowo określić wzrost guza. Zdjęcia wykonane w tej pozycji będą oznaczone od teraz jako widok lewoboczny.</li>
			<li>Zaraz po ukończeniu pierwszego zdjęcia wykonaj drugie zdjęcie myszy w pozycji leżącej. Pozwala to kamerze rejestrować fotony emitowane z guza w jamie klatki piersiowej z widoku brzusznego. Użyj tego widoku (oznaczonego dalej jako widok brzuszny), aby oszacować położenie raka w jamie klatki piersiowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeanalizować obrazy, zmień jednostki z Counts na Radiance.</li>
	<li>Otwórz podniebienie narzędziowe. Przejdź do Image Adjust, wybierz Manual. Wybierz minimalny i maksymalny pasek kolorów, który najlepiej pasuje do wykonanych zdjęć.</li>
	<li>Otwórz narzędzia zwrotu z inwestycji (ROI). Wybierz rozwijane menu z kołem, aby dodać do obrazu okrąg obszaru zainteresowania (ROI). Przesuń okrąg nad nacięciem dla widoku lewego bocznego i nad środkiem klatki piersiowej dla widoku brzusznego.</li>
	<li>Wybierz ROI według pomiaru.</li>
</ol>
10. Ocena kryteriów włączenia i wykluczenia
<ol>
	<li>Najpierw potwierdz obecność luminescencji guza w płucach, obserwując obraz z lewej strony bocznej.</li>
	<li>Następnie potwierdź obecność luminescencji guza w lewej jamie klatki piersiowej na zdjęciu brzusznym. Następnie potwierdzić, że z obrazu brzusznego jest tylko jedno miejsce luminescencji.</li>
	<li>Jeśli spełnione są te dwa kryteria (kroki 10.1, 10.2), należy ocenić kryteria wykluczenia, upewniając się, że luminescencja nie przecina linii środkowej w jamie klatki piersiowej na obrazie brzusznym. Jeśli po dwóch kolejnych obrazach IVIS w ciągu 4 dni po operacji nie wykryto luminescencji w widoku lewej strony bocznej, należy wykluczyć tę mysz z dalszych badań, ponieważ komórki nowotworowe prawdopodobnie nie zostały przyjęte.</li>
</ol>
11. Ocena guzów na końcu badań
<ol>
	<li>Gdy całkowity strumień luminescencji guza osiągnie 1× 108 fotonów /s (p/s) lub więcej, należy zebrać myszy do oceny końcowej.</li>
	<li>Pobierz guz do analizy anatomicznej lub histologii, wykonując następujące kroki znieczulenia i perfuzji płuc, jak opisano wcześniej37.<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej, aby znieczulić ją izofluranem. Ustaw przepływ tlenu na 2,0 L/min, a waporyzator na 2% izofluranu. Monitoruj oddech myszy i stosuj odruch cofania pedałów, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie. UWAGA: Stężenie izofluranu można dostosować w zależności od rozmiaru myszy.</li>
		<li>Umieść mysz w stożku nosowym w pozycji leżącej. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, korzystając z odruchu wycofania pedałów, zanim kontynuuuję.</li>
		<li>Otwórz jamę klatki piersiowej myszy, aby zobaczyć płuca i serce za przeponą.</li>
		<li>Wykonaj długie, pionowe cięcie wzdłuż linii środkowej myszy. Przesuń jelita, aby zobaczyć lewą tętnicę nerkową.</li>
		<li>Przetnij przeponę, aby zobaczyć serce.</li>
		<li>Przetnij lewą tętnicę nerkową.</li>
		<li>Wstrzyknąć około 5-10 mL 1x PBS przez prawą komorę serca z częstotliwością około 5 mL/min.</li>
		<li>Zrób nacięcie wzdłuż szyi. Usuń wszelki tłuszcz podskórny znajdujący się powyżej tchawicy. Uważaj, żeby nie przeciąć tchawicy.</li>
		<li>Przekłuj tchawicę równolegle igłą, aby wstrzyknąć 10% formaliny bezpośrednio do tchawicy, aby napompować i ustabilizować płuca.</li>
		<li>Płuca wyciągnij z jamy klatki piersiowej, przecinając tchawicę powyżej wierzchołka płuca oraz przecinając opłucną i więzadła łączące płuco z klatką piersiową.</li>
		<li>Wlej 10% formaliny do utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2022%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).</li>
<li>Luo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+worldwide+variation+and+trends+in+incidence+of+lung+cancer+by+histological+subtype+in+2022+and+over+time%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Estimated worldwide variation and trends in incidence of lung cancer by histological subtype in 2022 and over time: a population-based study.</a> Lancet Respir Med. 13 (4), 348-363 (2025).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+lung+cancer+in+2022+and+projections+to+2050%3A+incidence+and+mortality+estimates+from+GLOBOCAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN.</a> Cancer Epidemiol. 93, 102693(2024).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACancer+statistics%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">ACancer statistics, 2023.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Friedlaender, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+alterations+in+advanced+NSCLC%3A+a+molecular+super-highway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic alterations in advanced NSCLC: a molecular super-highway.</a> Biomark Res. 12 (1), 24(2024).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+targeted+therapies+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+Basel%22%5BJournal%5D)">Emerging targeted therapies in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Cancers Basel. 15 (11), 2899(2023).</li>
<li>Chavan, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+key+signaling+pathways+for+the+therapeutic+targeting+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Unravelling key signaling pathways for the therapeutic targeting of non-small cell lung cancer.</a> Eur J Pharmacol. 998, 177494(2025).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+trends+among+patients+with+metastatic+non-small+cell+lung+cancer+before+and+after+the+approval+of+immunotherapy+in+the+United+States%3A+a+SEER+database-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Survival trends among patients with metastatic non-small cell lung cancer before and after the approval of immunotherapy in the United States: a SEER database-based study.</a> Cancer. 131 (1), e35476(2025).</li>
<li>Doki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediastinal+lymph+node+metastasis+model+by+orthotopic+intrapulmonary+implantation+of+Lewis+lung+carcinoma+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mediastinal lymph node metastasis model by orthotopic intrapulmonary implantation of Lewis lung carcinoma cells in mice.</a> Br J Cancer. 79 (7-8), 1121-1126 (1999).</li>
<li>Wilson, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+orthotopic+transplantation+of+lung+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for orthotopic transplantation of lung cancer in mice.</a> Methods Mol Biol. 2374, 231-242 (2022).</li>
<li>Poczobutt, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoid+profiling+in+an+orthotopic+model+of+lung+cancer+progression+by+mass+spectrometry+demonstrates+selective+production+of+leukotrienes+by+inflammatory+cells+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment.</a> PLoS One. 8 (11), e79633(2013).</li>
<li>Giannou, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+orthotopic+single-lung+transplantation+in+mice+as+a+tool+for+lung+metastasis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for orthotopic single-lung transplantation in mice as a tool for lung metastasis studies.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102701(2023).</li>
<li>Gan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+orthotopic+model+of+lung+cancer+by+transthoracic+lung+puncture+using+tumor+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an orthotopic model of lung cancer by transthoracic lung puncture using tumor fragments.</a> J Thorac Dis. 15 (4), 2012-2021 (2023).</li>
<li>Nakajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+lung+cancer+murine+model+by+nonoperative+transbronchial+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Orthotopic lung cancer murine model by nonoperative transbronchial approach.</a> Ann Thorac Surg. 97 (5), 1771-1775 (2014).</li>
<li>Moll, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+syngeneic+lung+adenocarcinoma+cells+to+study+PD-L1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression.</a> J Vis Exp. (143), e58101(2019).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orthotopic+transplantation+model+in+nude+mice+that+simulates+the+clinical+features+of+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer.</a> Cancer Sci. 97 (10), 996-1001 (2006).</li>
<li>Im, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+orthotopic+lung+cancer+mouse+model+via+thoracotomy+and+orotracheal+intubation+enabling+in+vivo+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies.</a> Lab Anim. 48 (2), 124-131 (2014).</li>
<li>McDonald, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+target%3A+an+intrapulmonary+transplantation+method+for+modelling+lung+tumor+development+in+its+native+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">On target: an intrapulmonary transplantation method for modelling lung tumor development in its native microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2691, 31-41 (2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+orthotopic+lung+cancer+model+in+nude+mice+and+its+evaluation+by+spiral+CT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an orthotopic lung cancer model in nude mice and its evaluation by spiral CT.</a> J Thorac Dis. 4 (2), 141-145 (2012).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+orthotopic+lung+cancer+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of orthotopic lung cancer models in mice.</a> Methods Mol Biol. 2279, 199-212 (2021).</li>
<li>Yamada-Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+progression+in+the+Lewis+lung+carcinoma+orthotopic+mouse+model%3A+a+comparison+between+the+tail+vein+injection+and+intranasal+instillation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor progression in the Lewis lung carcinoma orthotopic mouse model: a comparison between the tail vein injection and intranasal instillation methods.</a> Curr Protoc. 4 (12), e70071(2024).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+immune+mechanisms+and+therapeutic+targets+in+lung+adenosquamous+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the immune mechanisms and therapeutic targets in lung adenosquamous transformation.</a> Front Immunol. 16, 1542526(2025).</li>
<li>Ghasemi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiragolumab+and+TIGIT%3A+pioneering+the+next+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tiragolumab and TIGIT: pioneering the next era of cancer immunotherapy.</a> Front Pharmacol. 16, 1568664(2025).</li>
<li>Fortich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+management+of+oligometastatic+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+Basel%22%5BJournal%5D)">Surgical management of oligometastatic non-small cell lung cancer.</a> Cancers Basel. 17 (12), 2040(2025).</li>
<li>Al-Showbaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-programmed+cell+death-1+versus+anti-programmed+death-ligand+1+in+PD-L1-negative+advanced+non-small+cell+lung+cancer%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Anti-programmed cell death-1 versus anti-programmed death-ligand 1 in PD-L1-negative advanced non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis.</a> World J Oncol. 16 (3), 299-310 (2025).</li>
<li>Close, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+%28BLI%29%3A+noninvasive+visualization+and+interrogation+of+biological+processes+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Basel%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals.</a> Sensors Basel. 11 (1), 180-206 (2011).</li>
<li>Driehuys, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+imaging+with+magnetic+resonance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Small animal imaging with magnetic resonance microscopy.</a> ILAR J. 49 (1), 35-53 (2008).</li>
<li>Jelicks, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+small-animal+models+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Imaging of small-animal models of infectious diseases.</a> Am J Pathol. 182 (2), 296-304 (2013).</li>
<li>Klaunberg, B. A., Lizak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+setting+up+a+small-animal+imaging+facility%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Considerations for setting up a small-animal imaging facility.</a> Lab Anim. 33 (3), 28-34 (2004).</li>
<li>Puaux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int J Mol Imaging. 2011, 321538(2011).</li>
<li>Yitbarek, D., Dagnaw, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+advanced+imaging+modalities+in+veterinary+medicine%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Med+Auckl%22%5BJournal%5D)">Application of advanced imaging modalities in veterinary medicine: a review.</a> Vet Med Auckl. 13, 117-130 (2022).</li>
<li>Saito-Moriya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+select+firefly+luciferin+analogues+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">How to select firefly luciferin analogues for in vivo imaging.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 1848(2021).</li>
<li>Ramos-Gonzalez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+translational+luciferase-based+cancer+models+to+evaluate+antitumoral+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Establishment of translational luciferase-based cancer models to evaluate antitumoral therapies.</a> Int J Mol Sci. 25 (19), 10418(2024).</li>
<li>Young, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumor+promotion+and+progression+in+a+mouse+model+of+inflammation-induced+colon+cancer+with+magnetic+resonance+colonography%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumor promotion and progression in a mouse model of inflammation-induced colon cancer with magnetic resonance colonography.</a> Neoplasia. 11 (3), 237-246 (2009).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+transcriptional+function+of+the+rat+vascular+AT1a+angiotensin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and transcriptional function of the rat vascular AT1a angiotensin receptor gene.</a> Circ Res. 73 (4), 612-621 (1993).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+maintenance+of+authentic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the maintenance of authentic cancer cell lines.</a> Methods Mol Biol. 2508, 1-7 (2022).</li>
<li>Davenport, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+inflation+of+the+mouse+lung+for+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology.</a> J Vis Exp. (162), e2020(2020).</li>
<li>Helms, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+tracheal+instillation+of+solutes+into+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung.</a> J Vis Exp. (42), e2010(2010).</li>
<li>Kee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+immune+activity+by+chemokine+CX3CL1+in+an+orthotopic+implantation+of+lung+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor immune activity by chemokine CX3CL1 in an orthotopic implantation of lung cancer model.</a> Mol Clin Oncol. 1 (1), 35-40 (2013).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+regulates+sensitivity+of+murine+lung+tumors+to+PD-1%2FPD-L1+antibody+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment regulates sensitivity of murine lung tumors to PD-1/PD-L1 antibody blockade.</a> Cancer Immunol Res. 5 (9), 767-777 (2017).</li>
<li>Morgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+non-small+cell+lung+cancer+and+their+potential+utility+in+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of non-small cell lung cancer and their potential utility in personalized medicine.</a> Front Oncol. 7, 2(2017).</li>
<li>Oser, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically-engineered+mouse+models+of+small+cell+lung+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genetically-engineered mouse models of small cell lung cancer: the next generation.</a> Oncogene. 43 (7), 457-469 (2024).</li>
<li>Spiro, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+treatment+effects+in+lung+cancer-bearing+mice%3A+clinical+CT+and+clinical+MRI+compared+to+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring treatment effects in lung cancer-bearing mice: clinical CT and clinical MRI compared to micro-CT.</a> Eur Radiol Exp. 4 (1), 31(2020).</li>
<li>Weiss, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+hunt+for+therapeutic+targets%3A+mimicking+the+growth%2C+metastasis%2C+and+stromal+associations+of+early-stage+lung+cancer+using+a+novel+orthotopic+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Oncol%22%5BJournal%5D)">In the hunt for therapeutic targets: mimicking the growth, metastasis, and stromal associations of early-stage lung cancer using a novel orthotopic animal model.</a> J Thorac Oncol. 10 (1), 46-58 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+study+of+ribavirin+in+the+treatment+of+orthotopic+lung+cancer+based+on+UPLC-Q-TOF%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Metabolomics study of ribavirin in the treatment of orthotopic lung cancer based on UPLC-Q-TOF/MS.</a> Chem Biol Interact. 370, 110305(2023).</li>
</ol>

S.C.H. i C.S.C. są założycielami Geminii, Inc. Warunki tego porozumienia zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Biuro ds. Konfliktu Interesów w Badaniach Uniwersytetu Iowa. Wszyscy inni autorzy nie mają konfliktów interesów do zgłoszenia.

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną, minimalnie inwazyjną procedurę, która pozwala na szybkie rekonwalescencje i niemal natychmiastowe monitorowanie guza, co różni się od bardziej chirurgicznie intensywnych metod opisanychwcześniej 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45<sup class="xref...

Rak płuc pozostaje jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet i mężczyzn na całym świecie 1,2,3. Niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC) odpowiada za prawie 90% wszystkich przypadków raka płuc w Stanach Zjednoczonych, a choć krajobraz leczenia znacznie się poprawił w ostatnich latach, nadal istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem nowych terapii poprawiających wyniki4. Chociaż nastąpiło wiele postępów w opracowywaniu terapii celowanych dla specyficznych mutacji wywołujących oraz immunoterapii dla responsywnych podtypów NSCLC, ogólny pięcioletni wskaźnik przeżycia pozostaje niski, wynoszący około 20% dla wszystkich stadiów raka płuc 2,5,6,7. Ponadto, choć immunoterapia poczyniła ogromne postępy w poprawie przeżycia w zaawansowanych chorobach, te postępy tylko przesunęły ogólny wzrost z 5-letniego przeżycia 6,8% do 10,7% oraz wydłużyły czas przeżycia z 7 miesięcy do 8 miesięcy8. Wciąż istnieje ogromna potrzeba zrozumienia mechanizmów działania choroby oraz opracowania nowych terapii, które będą współdziałać z obecnymi terapiami standardowymi opieki. Zrozumienie mechanizmów naturalnego postępu NSCLC oraz odpowiedzi na nowe terapie wymaga modeli przedklinicznych, które są wiarygodnie powtarzalne, łatwe do wywołania i obejmują mikrośrodowisko guza, w którym rozwija się nowotwór.
W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano wiele różnych procedur oceniających ortotopowe modele raka płuc u gryzoni. Procedury mogą być bardzo inwazyjne, wymagające wysokiego poziomu wiedzy, takie jak implantacja śródpłucna czy przeszczepy otwierające jamę klatki piersiowej 9,10,11,12,13; umiarkowanie inwazyjne, takie jak procedury śródtchawicowe i tchawicowe 14,15,16,17; do minimalnie inwazyjnych zabiegów, takich jak zastrzyki przezskórne, żyła ogonowa czy indukcja donośna 18,19,20,21. Wszystkie procedury niesie ze sobą różne ryzyka i korzyści — bardziej inwazyjne techniki pozwalają na większą precyzję, ale potencjalnie wyższy wskaźnik zaniku, a mniej inwazyjne metody sprzyjają lepszemu przeżyciu, ale większej zmienności miejsc wszczepienia guza. Spośród tych różnych protokołów niektóre decydują się nie śledzić wzrostu guza in vivo i jedynie przeprowadzają oceny nowotworów ex vivo 9,11,12,16. Spośród protokołów monitorujących wzrost guza w czasie, wcześniejsze opierają się bardziej na systemach takich jak tomografia komputerowa (CT)14,19, tomografia emisyjna pozycyjna (PET)18 oraz obrazowanie rezonansowe magnetyczne (MRI)17, podczas gdy późniejsze protokoły, po upowszechnieniu systemów obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) i komórek genetycznie zmodyfikowanych, decydują się na śledzenie wzrostu guzu w czasie za pomocą BLI 20. 21.
Celem opracowania tego protokołu było wykorzystanie wniosków z innych procedur i stworzenie prostej, ale wiarygodnej metody indukcji pojedynczego guza płuca do badania postępu NSCLC od wczesnej choroby, gdzie guz jest ograniczony do płuc. Głównym celem niniejszej pracy jest opisanie metod stworzenia wiarygodnego i minimalnie inwazyjnego syngeneicznego ortotopowego modelu mysiego raka płuc na myszy, który można monitorować za pomocą obrazowania in vivo i umożliwić badaczom badanie raka płuc w narządzie, z którego choroba się wywodzi. Metoda ta jest skuteczna zarówno do generowania ortotopowych modeli myszy z ksenoprzeszczepem wykorzystującym linie komórkowe raka płuc, jak i syngeneicznych ortotopowych modeli myszy z liniami komórek raka płuc u myszy z nienaruszonym układem odpornościowym, co daje wszechstronność metodzie badania zarówno typów nowotworów ludzkich, jak i złożonej współpracy układu odpornościowego i NSCLC.
Skupiliśmy się na optymalizacji tego protokołu w modelu mysim NSCLC z kompetencją immunologiczną, Lewis Lung Carcinoma (LLC), ponieważ model ten pozwala naukowcom lepiej zrozumieć odpowiedź układu odpornościowego zarówno z obecnymi terapiami, jak i bez nich, takich jak chemioterapia, radioterapia, immunoterapia i inne terapie celowane 22,23,24,25. Protokół generuje model reprezentatywny dla wczesnego stadium choroby podczas inokulacji (guz w mięźmiowisku płucnym) oraz przerzutów pod koniec badań, ponieważ guz często przerasta parenchymę płuca i zasiaje inne tkanki.
Ważnym aspektem badania modeli ortotopowych jest możliwość wielokrotnego śledzenia wzrostu guza, przy minimalnym obciążeniu zwierzęcia, tak aby każde zwierzę w badaniu mogło być oceniane w jednym punkcie czasowym. Chociaż techniki obrazowania, takie jak MRI czy tomografia komputerowa, pozwalają na lepszą rozdzielczość guza, te metody obrazowania są kosztowne, czasochłonne i mają trudności ze śledzeniem wczesnego wzrostu guza w modelach zwierząt małych, takich jak myszy 26,27,28,29,30,31. Dlatego zdecydowaliśmy się monitorować wzrost guzów za pomocą bioluminescencji za pomocą komórek nowotworowych zmodyfikowanych lucyferazą. W tym protokole wstrzyknęliśmy 25 000-50 000 komórek LLC z inżynierią świetlików lucyferazą (LLC-luc) i wykryliśmy guzy już następnego dnia za pomocą BLI. Reakcja lucyferyna-lucyferaza jest użytecznym narzędziem do śledzenia wzrostu guza in vivo za pomocą aparatów spektralnych. Dzięki czułości tych systemów obrazowania do śledzenia fotonów światła, komórki nowotworowe wyrażające lucyferazę mogą być śledzone in vivo wcześnie, często zanim guzy zostaną wykryte na mysiim modelu za pomocą MRI lub tomografii, a częstotakże 26,32,33,34.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna formalina buforowana</td><td>VWR</td><td>16004-112</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkanek o wymiarach 100 mm x 20 mm</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>667621</td><td></td></tr><tr><td>190 proof czysty etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>3/10 mL strzykawka insulinowa z BD Ultra-Cienką igłą 31 g x 5/16 cala.</td><td>Beckton Dickinson</td><td>328438</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A5394</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny 10% antyseptyk z povidone-jodem</td><td>Arvio Health L.P.</td><td>67618-150-04</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL6/N</td><td>Laboratoria Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Scept 40um Nylon&nbsp;</td><td>Sokół</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa maszyna do znieczulenia</td><td>Vetamac Anesthesia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładka ciepła w dalekiej podczerwieni z kontrolerem</td><td>Kent Scientific Corporation&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konwencjonalna rękojeść ostrza chirurgicznego, rozmiar 3</td><td>Brad-Parker</td><td>371030</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze ogólnego przeznaczenia o średnim punkcie</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna (sól sodowa)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14682</td><td></td></tr><tr><td>Drapa, chirurgiczne 18" x 26" Bezokienkowe, sterylne</td><td>Rozdany</td><td>783410</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (1x)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosforanowa sól fizjologiczna z buforem (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>A5670402</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła do mikroskopu światłowodowego FL150</td><td>Meiji &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór siarczanu gentamycyny</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Research Products International</td><td>G22025</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Primal Pharma Limited</td><td>66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina S5</td><td>PerkinElmer &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do Żywego Obrazu</td><td>PerkinElmer &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LL/2 (LLC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1642</td><td>Użyj linii komórkowej nowotworowej, która najlepiej odpowiada potrzebom badania&nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Matryca bazalna membrana matrigelowa</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły Mayo-Hegar, 6", ząbkowane szczęki</td><td>Miltex</td><td>8-44TC</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>10018-12</td><td></td></tr><tr><td>Podtrzymywacz łap N5 z podwójnymi ostrzami</td><td>Oneisall&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gąbki gazowe niesterylne, 12-warstwowe</td><td>NDC</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare Eye Lube</td><td>Aventix</td><td>5914304</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand Silk Suture 6-0 1 x 18"</td><td>Ethicon&nbsp;</td><td>K802H</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy 85%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela rozmiar 10, stal nierdzewna, sterylne</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>110</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z zakrętką śrubową stożkowa 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek 4,5" Staight Premium</td><td>Onsung</td><td>SCT115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Taśma aluminiowa z taśmą aluminiową z wkładką</td><td>IPG</td><td>ALF150L</td><td></td></tr><tr><td>Drewniane aplikatory z bawełnianymi końcówkami</td><td>NDC</td><td>76200</td><td></td></tr></tbody></table>

minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

A Minimally Invasive Method for Generating a Syngeneic Orthotopic Mouse Model of Lung Cancer

Niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC) pozostaje główną przyczyną zgonów związanych z rakiem zarówno u kobiet, jak i mężczyzn na całym świecie. Należy zebrać więcej informacji, aby zrozumieć interakcje między komórkami nowotworowymi, układem odpornościowym, mikrośrodowiskiem każdego guza oraz tkanką gospodarza, aby opracować skuteczniejsze metody leczenia. Opisano tutaj prostą, powtarzalną metodę wywoływania raka w płucach myszy, umożliwiającą monitorowanie wzrostu guza od wczesnego do późnego stadium choroby. Zabieg chirurgiczny polega na niewielkim nacięciu powierzchownym na skórze oraz wstrzyknięciu komórek nowotworowych przez mięśnie międzyżebrowe do płuc. Systemy obrazowania in vivo (IVIS) w połączeniu z komórkami zaprojektowanymi do ekspresji lucyferazy stanowią wygodny sposób oceny wzrostu guza i postępu choroby w trakcie badania. Technika ta jest łatwo przenoszona na różne modele raka płuc i może być wykorzystywana do testowania wykonalności oraz skuteczności nowych terapii w przedklinicznym modelu raka płuc, który naśladuje naturalne mikrośrodowisko nowotworowe. To poszerza znaczenie zarówno badań skuteczności, jak i bezpieczeństwa i toksyczności z wykorzystaniem terapii standardowej opieki, w tym resekcji chirurgicznej, radioterapii i immunoterapii w połączeniu z terapiami eksperymentalnymi.

W tym badaniu myszy C57BL6/N zostały wstrzyknięte zgodnie z przedstawionym protokołem (Rysunek 1). Użyto komórek LLC genetycznie modyfikowanych do ekspresji lucyferazy (LLC-luc). Dodatkowo mysz fałszywa została wstrzyknięta Matrigelem bez komórek nowotworowych. BLI na IVIS można rozpocząć już 1 dzień po operacji. To badanie LLC-luc zostało zoptymalizowane pod kątem BLI w celu oceny wczesnego stadium raka płuc. System BLI używany w tym artykule ma minimalną wykrywalną promieniancję (MDR) wyno...

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Non-small cell lung cancer (NSCLC) continues to be the number one cause of cancer-related death for both women and men worldwide. More information needs ...

Nasze obecne badania koncentrują się na zrozumieniu chorób raka płuc oraz na opracowywaniu nowych metod leczenia zgodnych ze standardową terapią, w tym chemioterapii, radioterapii i immunoterapii. Nie udało nam się znaleźć ortotopowego modelu raka płuc, który ustanowiłby kryteria do konkretnego badania wczesnego stadium raka płuc. Pracujemy nad dostarczaniem jasnych i powtarzalnych wytycznych, które uzupełnią tę lukę w tym protokole.Protokół ten jest minimalnie inwazyjny i prosty w wykonaniu. Dodatkowo, zgodnie z przedstawionymi przez nas kryteriami, protokół ten umożliwia dokładne badanie implantacji guza oraz umożliwia wczesne wykrycie guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Protokół ten umożliwia badaczom badanie wczesnego stadium raka płuc w tkance gospodarza, co umożliwia przedkliniczny rozwój nowych terapii nowotworowych oraz badania mikrośrodowiska nowotworowego.Wykorzystamy tę technikę, aby ocenić mechanizmy i skuteczność ekscytujących nowych metod leczenia raka płuc przedklinicznie i mieć nadzieję, że doprowadzi ona do przyszłej opieki nad pacjentem. Na początek umieść znieczuloną mysz w stożku nosowym w pozycji leżącej na brzuchu na urządzeniu grzewczym i nałóż maść okulistą na oba oczy myszy. Gdy znieczulenie zostanie potwierdzone, użyj elektrycznych obcinaczek, aby usunąć sierść z prostokątnego obszaru o wymiarach dwa na trzy centymetry po lewej grzbietowej stronie myszy.Gol się od kręgosłupa od środka, stołu od boku, ostatniego żebra od dołu i górnej krawędzi łopatki w kierunku głowy, aż futro nie będzie widoczne. Umieść mysz w pustej klatce na urządzeniu grzewczym. Obserwuj wzorzec oddechu, aż mysz odzyska czujność, a następnie wróć ją do klatki do czasu operacji.W dniu pobierania komórek należy dodać świeże podłoże zawierające 50 miligramów gentamycyny na mililitr na płytkę hodowlową na trzy do czterech godzin przed pobraniem. Aspiruj podłoże z płytki hodowlowej i przemyj przymocowane komórki 1x PBS. Następnie inkubuj komórki roztworem trypsyny EDTA przez jedną do dwóch minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj świeże medium, aby zneutralizować trypsynę. Rozproszyj komórki, delikatnie stukając lub pipetując płytkę. Następnie zbieraj zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 50 milimetrów.Teraz wiruj stożkową rurkę w temperaturze 1 200 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po potwierdzeniu obecności zwartego pelletu na dnie zasysaj supernatant i przemyj go PBS. Ponownie zawiesij wymyty pellet komórkowy w PBS, aby uzyskać stężenie około 1 do 2 milionów komórek na mililitr do liczenia.Przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa o średnicy 40 mikrometrów przed dalszą pracą. Następnie połącz 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwowej z 10 mikrolitrami trypanowego niebieskiego. Załaduj zabarwioną próbkę do hemocytometru i policz komórki.Oblicz całkowitą liczbę komórek i żywotność komórek. Ponownie wiruj ogniwa w 1 200 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i aspiruj PBS opuszczając pellet. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr żelu metra w PBS.Dostosuj do pożądanej liczby komórek przy całkowitej objętości zastrzyku 50 mikrolitrów. Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie, aby zapobiec zastygnięciu matrigelu. Oczyść miejsce operacji u znieczulonego zwierzęcia trzy razy sterylną gazą, na przemian podawając betadynę i 70% etanolu.Na mysz umieszcza sterylizowaną, fenestrowaną zasłonę chirurgiczną z otworem o wymiarach trzy na cztery centymetry i rozkłada na niej autoklawowe narzędzia chirurgiczne. Za pomocą kleszczy zidentyfikuj krawędź czaszki łopatki oraz krawędź piersiowej klatki piersiowej. Trzymając skórę napiętą między kciukiem a palcem wskazującym chirurga, wykonaj powierzchowne nacięcie skóry o średnicy pięciu milimetrów bezpośrednio poniżej łopatki, używając ostrza skalpela rozmiaru 10.Następnie użyj prostych nożyczek 115 milimetrów, aby tępić tłuszcz podskórny z dala od żeber i mięśni międzyżebrowych, nie przecinając ich. Aby zatrzymać lekkie krwawienie spowodowane uszkodzeniem naczyń włosowatych, delikatnie przyciskaj sterylny aplikator z bawełnianym końcem na miejsce krwawienia. Trzymaj nacięcie otwarte za pomocą mikro ataków i kleszczy.Zaczynając od siódmego prawdziwego żebra, użyj zakrzywionych kleszczy w punktach środkowych, aby liczyć w górę i lokalizować czwarte i piąte żebro. Oznacz ten obszar jako miejsce wstrzyknięcia. Teraz delikatnie odwróć rurkę zawiesiny ogniwowej trzy do czterech razy, aby wymieszać.Tuż przed wstrzyknięciem nabierz 50 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej 300-mikrolitrowej strzykawki insulinowej 31 gauge 8 milimetrów, upewniając się, że nie ma żadnych bąbelków. Przyłóż do strzykawki taśmę o grubości czterech milimetrów wysterylizowanej taśmy metalowej, aby działać jako korek i kontrolować głębokość wstrzykiwania. Wstrzyknij zawiesinę ogniwa 50 mikrolitrów pod kątem 90 stopni w przestrzeń międzyżebrową między żebrami czwartym i piątym, bezpośrednio pod czwartym żebrem i utrzymuj igłę w pozycji przez dwie do trzech sekund.Powoli wyjmij igłę pod tym samym kątem, pod jakim została włożona, i wyrzuć ją do pojemnika na ostre przedmioty. Na koniec zamknij nacięcie skórne za pomocą dwóch do trzech kwadratowych szwów szlachowanych i nałóż na szwy klej chirurgiczny weterynarii, aby wzmocnić zamknięcie rany. Obrazowanie bioluminescencyjne wykryło sygnały związane z nowotworem u myszy eksperymentalnych już jeden dzień po podaniu iniekcji, a promieniowanie widocznie wzrastało z czasem zarówno dla grupy 25 000, jak i 50 000 komórek na mys, z większą intensywnością obserwowaną w grupie 50 000 komórek.Całkowity strumień nowotworów wzrósł wykładniczo zarówno w grupach 25 000, jak i 50 000 komórek, osiągając ponad 10 razy 10 do mocy ośmiu fotonów na sekundę do 21. dnia w grupie 50 000 komórek. Myszy fałszywe nie wykazywały luminescencji ani widocznego guza w rozciętych płucach, podczas gdy myszy eksperymentalne wykazywały wysoką luminescencję i czerwone masy guzów w tkance płucnej. 21 dni po podaniu iniekcji, włączone myszy wykazywały guzy ograniczone do lewego płata płuca, bez inwazji do okolicznych regionów.

a-minimally-invasive-method-for-generating-syngeneic-orthotopic-mouse

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Film demonstruje technikę ortotopowej inokulacji raka piersi na modelu mysim. Technika ta zapewnia wysoki wskaźnik nowotworzenia przy mniejszej zmienności wielkości i kształtu guza w porównaniu z wstrzyknięciem podskórnym lub niechirurgicznym.

Wstrzyknięcie ortotopowe: wszczepianie komórek rakowych specyficznych tkankowo dorosłej myszy

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów.  Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjny model syngenicznego przeszczepu ortotopowego komórek gruczolakoraka płuc myszy jako model redukujący czas i koszty do badania niedrobnokomórkowego raka płuc.

Ortotopowe przeszczepienie komórek syngenicznego gruczolakoraka płuc w celu zbadania ekspresji PD-L1

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Poznaj minimalnie inwazyjną metodę tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu raka płuc u myszy. Protokół umożliwia wczesne wykrywanie nowotworów dzięki obrazowaniu bioluminescencyjnemu i wspiera badania przedkliniczne nowych terapii onkologicznych.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Przeglądaj więcej filmów