Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy
30 grudnia 2025
Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.
Badamy transport komórek odpornościowych z węzła chłonnego nerek do nerki oraz antygenu nerkowego do węzła chłonnego drenażowego. Nasze podejście chirurgiczne daje unikalną zaletę, że możemy selektywnie zakłócać węzły chłonne nerk, pozostawiając wszystkie pozostałe węzły chłonne nienaruszone, w dobrze tolerowanym modelu długoterminowego przetrwania. Teraz, gdy ten model został opracowany, możemy zbadać wpływ węzłów chłonnych nerek i odpowiedzi immunologicznej oraz to, jak usunięcie tych węzłów przyczynia się do uszkodzenia nerek związanego z układem odpornościowym.
Na początek połóż znieczulone zwierzę na stole operacyjnym i nałóż maść. Użyj taśmy, aby zabezpieczyć lewą rękę zwierzęcia w wyższym kierunku, a ogon w kierunku dolnym, aby uzyskać zrelaksowaną, ale wydłużoną postawę. Ogol sierść i zdezynfekuj miejsce operacji trzy razy.
Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą szczypania palca, wykonaj jednocentymetrowe skośne nacięcie przez skórę tuż poniżej śledziony, około centymetra poniżej ostatniego żebra. Za pomocą tępego rozwarstwiania oddziel skórę od ściany brzucha i klatki piersiowej oraz zidentyfikuj śledzionę wewnątrz jamy brzusznej. Następnie wykonaj nacięcie o średnicy jednego centymetra przez mięśnie ściany brzucha, tuż poniżej śledziony, aby wejść do jamy otrzewnej.
Rozpoznaj lewą nerkę jako gładki narząd położony wzdłuż tylnej ściany brzucha, tuż pod śledzioną. Używając dwóch skośnych kleszczy, tępo rozciń za lewą nerką, aby uzyskać dostęp do otrzewnej i delikatnie odbić lewą nerkę w kierunku przedprzyśrodkowym. Umieść poduszkę tkanki tłuszczowej otaczającą lewy węzeł chłonny nerki, która leży za nerką i powyżej naczyń nerkowych.
Identyfikacja i unikanie nadnerczy położonych u góry, aorty z tyłu oraz cysterna chyli przednio-środkowej. Używając cienko zakończonych kleszczy, tępo rozciął wokół torebki węzła chłonnego, aby oddzielić ją od sąsiednich naczyń, jednocześnie zapewniając delikatne przeciwnapięcie za pomocą ukośnych kleszczy. Użyj cienko zakończonych prostych kleszczy, aby cofnąć węzeł chłonny do góry.
Następnie użyj nożyczek cienkich, aby ostro przeciąć przymocowania tylno-medialne. Zbadaj to miejsce, aby potwierdzić hemostazę. Następnie przywróć nerkę do jej normalnej pozycji anatomicznej.
Zamknij ścianę brzucha, a następnie skórę za pomocą szwu z monofilamentu polipropylenowego 6-0 w ściegu biegnącym. Nałóż sterylny klej chirurgiczny, aby zatkać ranę. Opcjonalnie, dla lepszej identyfikacji węzłów chłonnych nerek, należy przed wycięciem limfadenektomii nerek wstrzyknąć 10 do 20 mikrolitrów sterylnego, przefiltrowanego 5% barwnika błękitu Evansa w PBS do obu tylnych poduszek stóp.
W ciągu pięciu minut od wstrzyknięcia barwnik dociera do węzłów chłonnych nerek przez drenaż w przedziale biodrowym. Przesuń zwierzątko do lewej bocznej pozycji dekubitu, z lewą stroną skierowaną w dół. Użyj taśmy, aby zabezpieczyć prawą rękę zwierzęcia w wyższym kierunku, a ogon w kierunku dolnym, aby utrzymać rozluźnioną, ale wydłużoną postawę.
Teraz zrób nacięcie skóry o średnicy jednego centymetra skośnie tuż pod ostatnim żebrem, które będzie umieszczone nieco wyżej niż po lewej stronie. Stosując tępe rozwarstwienie, oddziel skórę od ściany brzucha i klatki piersiowej. Następnie wykonaj nacięcie o średnicy jednego centymetra przez mięśnie ściany brzucha, aby dostać się do jamy otrzewnej.
Zidentyfikuj prawą nerkę, która jest gładkim organem zlokalizowanym wzdłuż tylnej ściany brzucha, tuż pod wątrobą. Używając dwóch skośnych kleszczy, tępo rozcinaj za prawą nerką, aby uzyskać dostęp do przestrzeni zaotrzewnowej i odbić prawą nerkę w kierunku przedprzyśrodkowym. Zidentyfikuj poduszkę tkanki tłuszczowej otaczającą prawy węzeł chłonny nerki, który leży za nerką i powyżej naczyń nerkowych.
Zidentyfikuj i unikaj nadnerczy położonych powyżej węzła chłonnego. Teraz, używając cienkokońcowych kleszczy, tępo rozcinaj wokół torebki węzła chłonnego, aby oddzielić ją od pobliskich naczyń, jednocześnie stosując delikatne kontrtrakcje za pomocą ukośnych kleszczy. Następnie, za pomocą cienko zakończonych prostych kleszczy, pociągnij węzły chłonne górnie i ostro przetnij przystawy tylne przyśrodkowe nożyczkami cienkimi.
Sprawdź okolicę, aby upewnić się, że hemostaza jest w stanie wybuchu. Na koniec przywróć prawą nerkę do jej pozycji anatomicznej. Zamknij ścianę brzucha i skórę w dwóch warstwach za pomocą szwów z polipropylenu monofilamentowego 6-0 w wzorze biegającym i nałóż sterylny klej chirurgiczny na miejsce nacięcia.
Cytometria przepływowa potwierdziła skuteczną ekstrakcję węzłów chłonnych we wszystkich pięciu próbkach limfadenektomii lewej i prawej nerk, z których każda wykazała ponad 50% komórek żywych z dodatkiem CD45, w porównaniu do mniej niż 2% u osób z tkanką tłuszczową trzewną. Ilościowa analiza komórek z CD45 wykazała bardzo istotną różnicę między próbkami limfadenektomii lewolewej i prawej nerki w porównaniu do tkanki tłuszczowej trzewnej, bez istotnej różnicy między lewą a prawą stroną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przeprowadzania obustronnej limfadenektomii nerkowej u myszy, umożliwiający selektywne usunięcie węzłów chłonnych nerek przy jednoczesnym zachowaniu innych tkanek limfatycznych. Metoda ta została opracowana, aby ułatwić badania nad rolą węzłów chłonnych nerek w migracji komórek odpornościowych oraz odpowiedziach immunologicznych związanych z nerkami, szczególnie w kontekście systemowych chorób autoimmunologicznych, takich jak toczeń rumieniowaty układowy. Procedura jest dobrze tolerowana, pozwala na długoterminie przeżycie zwierząt i umożliwia pozyskanie nienaruszonych węzłów chłonnych odpowiednich do dalszych analiz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Nefrologia
- Techniki chirurgiczne w modelach zwierzęcych
Wstęp
- Choroby autoimmunologiczne polegają na niewłaściwym celowaniu układu odpornościowego w tkanki własne, co prowadzi do uszkodzenia narządów.
- Wtórne narządy limfatyczne, w tym węzły chłonne, są kluczowe dla aktywacji komórek B i T oraz tolerancji immunologicznej.
- Rola drenujących węzłów chłonnych w autoimmunizacji narządowej i systemowej nie jest w pełni poznana, szczególnie w odniesieniu do nerek.
- Toczeń układowy często wiąże się z uszkodzeniem nerek, przy czym nerkowe węzły chłonne stanowią główne miejsca drenażu antygenów i ruchu komórek odpornościowych.
Cel badania
- Opracowanie i opis chirurgicznej procedury przeżywalności w celu selektywnej obustronnej limfadenektomii nerkowej u myszy.
- Umożliwienie badania lokalnego wpływu węzłów chłonnych nerek na odpowiedzi immunologiczne oraz uszkodzenia nerek.
- Zapewnienie powtarzalnej metody izolacji nienaruszonych węzłów chłonnych nerek do dalszych analiz.
Zastosowane metody
- Znieczulenie myszy i przygotowanie chirurgiczne, w tym golenie i dezynfekcja.
- Ukośne nacięcia skóry i ściany brzusznej w celu uzyskania dostępu do lewej i prawej nerki.
- Disekcja tępa i ostra w celu wyizolowania i usunięcia węzłów chłonnych nerek, unikając uszkodzenia sąsiednich struktur (nadnerczy, aorty, cysterny mlecznej).
- Opcjonalna iniekcja barwnika błękitu Evansa w celu lepszej wizualizacji węzłów chłonnych.
- Zamknięcie nacięć za pomocą szwów i kleju chirurgicznego.
- Cytometria przepłyewowa w celu potwierdzenia pomyślnego wyekstrakowania węzłów chłonnych i oceny populacji komórek.
Główne wyniki
- Procedura bilateralnej limfadenektomii nerkowej jest bezpieczna, dobrze tolerowana i sprzyja długoterminowemu przeżyciu (co najmniej 4 miesiące po operacji).
- Wycięte węzły chłonne nerek pozostają nienaruszone i są natychmiast dostępne do dalszej obróbki.
- Cytometria przepływowa potwierdziła pomyślną ekstrakcję, wykazując ponad 50% żywych komórek CD45-dodatnich w próbkach węzłów chłonnych w porównaniu do mniej niż 2% w kontrolnych próbkach tłuszczu trzewnego.
- Nie stwierdzono istotnych różnic w uzysku komórkowym między lewym a prawym węzłem chłonnym nerki.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia selektywne usunięcie węzłów chłonnych nerkowych u myszy w celu ukierunkowanych badań odpowiedzi immunologicznych nerek.
- Opisana metoda stanowi cenne narzędzie do analizy roli węzłów chłonnych nerkowych w ogólnoustrojowej i organospecyficznej autoimmunizacji.
- Szczegółowe instrukcje oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów wspierają powtarzalność i sukces procedury.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Selektywna obustronna limfadenektomia nerkowa u myszy umożliwia precyzyjną analizę węzłów chłonnych odprowadzających chłonkę z nerek, co wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka w badaniach nad immunologią nerkową i chorobami autoimmunologicznymi. Model ten stanowi unikalną platformę do analizy lokalnej aktywacji i migracji układu odpornościowego, bezpośrednio dostarczając danych do walidacji celów terapeutycznych oraz strategii biomarkerów translacyjnych w układowych procesach autoimmunizacyjnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na etapie przejścia od odkryć do badań przedklinicznych w przypadku terapii celowanych w nerki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę roli węzłów chłonnych nerek w aktywacji i migracji komórek odpornościowych.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez izolację lokalnych i systemowych efektów immunologicznych w patologii nerek.
- Ułatwia walidację celów dla interwencji modulujących oddziaływania limfatyczno-immunologiczne w chorobach nerek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia nienaruszone węzły chłonne do późniejszej analizy ilościowej, w tym cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych.
- Standaryzuje pobieranie tkanek w celu uzyskania powtarzalnego profilowania immunologicznego w grupach eksperymentalnych.
- Przygotowuje zwalidowane próbki biologiczne do przesiewowego badania związków immunomodulujących w systemach odpowiadających konkretnym jednostkom chorobowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych, umożliwiając bezpośrednie badanie tkanki limfatycznej drenującej nerki.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej w toczniu układowym i modelach pokrewnych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju immunoterapii celowanych w nerki w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model chirurgiczny integruje etap wczesnych odkryć z badaniami przedklinicznymi, łącząc studia nad mechanizmami z translacyjnym profilowaniem immunologicznym w modelach chorób nerek.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących roli lokalnych naczyń limfatycznych w odpowiedziach immunologicznych nerek.
- Przesiewy: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych, ilościowych odczytów komórek odpornościowych z wyciętych węzłów chłonnych.
- Analityka: Umożliwia porównywanie populacji immunologicznych między grupami eksperymentalnymi za pomocą cytometrii przepływowej.
- Badania translacyjne: Zapewnia platformę do dopasowania biomarkerów i analizy immunologicznej w kontekście konkretnych jednostek chorobowych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalny model in vivo do różnorodnych badań nad immunologią nerek oraz autoimmunologią.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad immunologią nerek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację węzłów chłonnych oraz późniejszą analizę immunologiczną w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu (go/no-go) interwencji immunologicznych ukierunkowanych na nerki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów z zakresu immunologii nerek oraz programów translacyjnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia chirurgicznego w modelach mysich oraz precyzyjnej sekcji anatomicznej.
- Wymaga dostępu do cytometrii przepływowej i infrastruktury analizy komórek odpornościowych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie pobierania tkanek i interpretacji danych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych modelach chorób autoimmunologicznych i nerkowych przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
- Konieczne jest długoterminowe monitorowanie zwierząt w celu zapewnienia tolerancji procedury oraz integralności danych.
