Name: Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj technikę dwustronnej limfadenektomii nerek u myszy, umożliwiającą selektywne usunięcie węzłów chłonnych przy zachowaniu innych tkanek. Metoda wspiera długoterminowe przetrwanie zwierząt i analizę odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy J. Aldermanowi, B. Caduganowi, E. Hughes-Picardowi i J. Horrocksowi za pomoc administracyjną oraz C. Hughesowi za zarządzanie kolonią myszy. H.N.B. jest stypendystą Yale Surgeon Scientist Training Program, który częściowo finansował i wspierał ten projekt. Prace te były również finansowane przez Howard Hughes Medical Institute (dla R.A.F.) oraz American College of Surgeons Resident Research Award (dla H.N.B.).

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Yale Institutional Animal Care and Use Committee. Do opracowania tej procedury wykorzystano szczep Balb/c w wieku 8-12 tygodni, myszy skłonne do tocznia (MRL/MpJ-Faslpr/J /J) oraz dopasowane wiekowo/płciowo/genotypowe grupy pozorowane15. Ponadto testowano także dzikie myszy typu C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni, a węzły zostały bezpiecznie usunięte. Uwzględniono zarówno samce, jak i samice myszy. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie instrumentów, zwierząt i sali operacyjnej
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Upewnij się, że powierzchnia operacyjna i stożek znieczulający są oczyszczone 70% etanolem.</li>
	<li>Ustaw mikroskop operacyjny, zapewniając chirurgowi operacyjnemu komfort ergonomii.</li>
	<li>Ustaw maszynę do waporyzatora z inhalacją z nosem i ssaniem, aby nadmiar usuwać środki znieczulenia. Zorganizuj powierzchnię operacyjną z cyrkulacją ciepłej wody, aby utrzymać temperaturę ciała i zapasy zwierzęcia w dogodnym, sterylnym miejscu.</li>
	<li>Indukowanie znieczulenia poprzez podanie 2%-3% wdechowego izofluranu z przepływem tlenu 2 L/min przez stożek nosowy z inhalowanego waporyzatora (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).<ol>
		<li>Zapewnij odpowiednią powierzchnię znieczulenia, potwierdzając częstość oddechu na poziomie około 30-40 oddechów na minutę oraz brak reakcji na szczypanie tylnej stopy. Okresowo sprawdzaj odpowiednią płaszczyznę znieczulenia i odpowiednio dostosowuj przepływ izofluranu. UWAGA: Alternatywnie, odpowiedni jest również środek znieczulejący w zastrzykach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przestrzegaj wytycznych instytutu dotyczących odpowiedniego leczenia przeciwbólowego i znieczulenia miejscowego. Na przykład można podskórnie podać długodziałający środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfina XR w dawce 3,25 mg/kg, oraz podskórnie podawać do 0,04 mL/5 g roztworu lidokainy o masie ciała 1mg/mL w planowanych miejscach nacięcia.</li>
	<li>Przygotuj zwierzę do zabiegu, nakładając lubrykant do oczu, wyrywając lub przycinając futro z tyłu po obu stronach, sterylizując grzbiet roztworem povodiny/jodu, następnie 70% etanolu i ustawiając prawy boczny dekubit (prawą stroną do dołu).<ol>
		<li>Użyj taśmy, aby zabezpieczyć lewą rękę zwierzęcia w górę i ogon w dół, aby uzyskać rozluźnioną, ale wydłużoną postawę (Rysunek 1A). To przesuwa nerkę bardziej w dół, co przekłada się na lepszą wizualizację i ekspozycję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Noś sterylne rękawiczki i załóż sterylne zasłony na zwierzę z oknem na pole operacyjne. Zachowaj sterylność przez cały zabieg.<ol>
		<li>OPCJONALNIE: Wstrzyknięcie 10-20 μL sterylnego, przefiltrowanego 5% Evans Blue w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w obustronnych poduszkach tylnych stóp przed ustawieniem zwierząt w celu lepszej identyfikacji węzłów chłonnych nerek przez drenaż przewodubiodrowego 16 (Rysunek 1D-G). UWAGA: Należy uważać, że ten barwnik może zakłócać analizę cytometryczną barwienia i przepływu. Dodatkowo, z czasem Evans Blue również przeniknie do cisterna chyli, zobacz "rozwiązywanie problemów" dla wskazówek (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68695/68695fig1v3.jpg" /> 
Rysunek 1: Anatomiczne ustawienie myszy i narządów oraz opcjonalne podanie zastrzyku Evans Blue. (A) Ustawienie i zabezpieczenie zwierząt przed ekspozycją lewej nerki. (B) Orientacja anatomiczna w ramach okien operacyjnych. Łańcuch węzłów chłonnych lewej nerki znajduje się obok naczyń nadnerczowych i aorty, powyżej naczyń nerkowych. Prawy węzeł chłonny nerek znajduje się tuż nad naczyniami nerkowymi. (C) Ustawienie zwierząt i ich zabezpieczenie dla odpowiedniej ekspozycji nerek. (D-G) Zastosowanie 20 μL 5% zastrzyku Evans Blue. (D) Lewa tylna stopa i łańcuch węzłów chłonnych lewej nerki (biała strzałka) przed farbowaniem. Zwróć uwagę na ogólne położenie cysterna chyli (przerywanego pudełka), które często jest przezroczyste i/lub trudne do zidentyfikowania, chyba że jest pulchne i ma limfę. (E) Lewa tylna stopa i łańcuch węzłów chłonnych lewej nerki (biała strzałka) 5 minut po wstrzyknięciu barwnika. Zwróć uwagę na naczynia limfatyczne aferentne (strzałka). (F) Prawa tylna stopa i prawy węzeł chłonny nerek (biała strzałka) przed farbowaniem. G) Prawa tylna stopa i prawy węzeł chłonny nerek (biała strzałka) 5 minut po zastrzyku barwnikiem. Zwróć uwagę na naczynia limfatyczne aferentne (czarne strzałki). Paski skalowe: A,C = 1,0 cm; D-G (widoki tylnej stopy) = 0,5 cm; D-G (widoki wewnętrzne) = 0,1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68695/68695fig1v3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
2. Limfadenektomia lewej nerki
<ol>
	<li>Wykonaj 1 cm skośne nacięcie przez skórę, tuż poniżej śledziony (około 1 cm poniżej ostatecznego żebra). Tępo rozciąć skórę z dala od ściany brzucha/klatki piersiowej i zidentyfikować śledzionę w obrębie jamy brzusznej.<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie o średnicy 1 cm przez mięśnie ściany brzucha tuż poniżej śledziony, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej (rysunek 2A,B). UWAGA: U myszy o skórze bez pigmentacji śledziona jest łatwo widoczna przez przygotowaną skórę jako ciemny, ruchomy organ bocznie położony w odwłoku, tuż poniżej ostatecznego żebra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikowaj lewą nerkę jako gładki narząd wzdłuż tylnej ściany brzucha, tuż poniżej śledziony. Nerki i związane z nimi węzły chłonne nerek znajdują się w okolicach otrzewnych. Używając dwóch skośnych kleszczy, tępo rozciąć tył lewej nerki, aby uzyskać dostęp do otrzewnej zaotrzewnej (Rysunek 2C). UWAGA: Prawidłowa i bezpieczna technika tępego rozwarstwiania polega na wywieraniu niewielkiego nacisku za pomocą zamkniętych kleszczy na pożądanej płaszczyźnie tkanki i delikatnym otwarciu instrumentu, rozciągając płaszczyzny tkanek.</li>
	<li>Odbijają lewą nerkę przednie-przyśrodkowo.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu rozcinającego zidentyfikuj poduszkę tłuszczową otaczającą lewy węzeł chłonny nerki, który będzie znajdował się za lewą nerką i nad lewymi naczyniami nerkowymi. Identyfikacja i unikanie nadnerczy od góry, aorty od tyłu oraz cysternalnych chyli przedniośrodkowo (rysunek 1B,D).</li>
	<li>Używając cienko zakończonych szczypiec, tępo rozciń wokół torebki węzła chłonnego (oddzielając ją od otaczających naczyń), jednocześnie delikatnie stosując napięcie przeciwnapięcia za pomocą ukośnych kleszczy (rysunek 2E). Można także użyć nożyczek cienkich, aby tępo rozłożyć ten płaszcz.</li>
	<li>Używając cienkokońcówkowych, prostych kleszczy, cofnij cefaladę lewego węzła chłonnego nerki, a nożyczki cienkie ostro naciąć przyłączenia tylno-przyśrodkowe węzła chłonnego. Uważaj, aby nie uszkodzić pobliskich naczyń krwionośnych oraz cysterna chyli/przewódu piersiowego (Rysunek 2F).</li>
	<li>Obserwuj obszar pod kątem hemostazy (Rysunek 2G).</li>
	<li>Przywróć nerkę do jej pozycji anatomicznej i zamknij brzuch w dwóch warstwach (ściana brzucha i skóra) za pomocą szwów z monofilamentu polipropylenowego 6-0 w trybie biegającym. Nałóż sterylny klej chirurgiczny na ranę.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68695/68695fig2v3.jpg" /> 
Rysunek 2: Lewa limfadenektomia nerkowa. (A) Lewe skośne nacięcie tuż poniżej i z tyłu cienia śledziony. (B) Identyfikacja śledziony od góry (biała linia), lewego nadnercza od tyłu (strzałka) i lewego nerki od dołu (linia). (C) Płaszczyzna do otrzewnowej zaokrzesnowej powstaje przez tępe rozcięcie bezpośrednio za nerką (strzałka). (D) Lewy węzeł chłonny nerek (białe strzałki) jest natychmiast widoczny w osłonie tłuszczowej. (E) Między pobliskimi naczyniami a węzłem (białe strzałki) powstaje płaszczyzna. (F) Węzeł jest delikatnie cofany i ostro wycięty wzdłuż utworzonej płaszczyzny. (G) Potwierdzono hemostazę, a pusta przestrzeń (wyblakłe strzałki od (D)), gdzie wcześniej znajdował się węzeł chłonny (biała strzałka), jest odnotowana jako wolna od pozostałych węzłów chłonnych. (H) Lewy węzeł chłonny to często łańcuch wielu węzłów (białe strzałki). Inset to łańcuch węzłów chłonnych ex vivo (1 mm x 3,5 mm). Pręty łuski: 0,2 cm. Znacznik = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68695/68695fig2v3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.</a>
3. Prawe naczynie limfadenektomiczne
<ol>
	<li>Przesuń zwierzę do lewego bocznego piostanku (lewy bok w dół). Ponownie użyj taśmy, aby przymocować prawą rękę zwierzęcia w górę i ogon w dół, aby uzyskać zrelaksowaną, ale wydłużoną postawę. Jest to szczególnie ważne po prawej stronie, gdzie wątroba może zakłócać ekspozycję (rysunek 1C).</li>
	<li>Zrób 1 cm skośne nacięcie przez skórę tuż poniżej ostatecznego żebra (nieco bardziej powyżej lewej strony). Tępo odciąć skórę od ściany brzucha/klatki piersiowej i wykonać nacięcie o średnicy 1 cm przez mięśnie ściany brzucha, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej (Rysunek 3A).</li>
	<li>Zidentyfikowaj prawą nerkę jako gładki narząd wzdłuż tylnej ściany brzucha, tuż poniżej wątroby. Może być konieczne użycie wymazu z bawełnianym końcówką, aby cofnąć cefalad wątroby. Używając dwóch skośnych kleszczy, tępo rozcina się z tyłu prawej nerki, aby uzyskać dostęp do otrzewnej zakrzesnowej (Rysunek 3B,C).</li>
	<li>Prawy obraz odbija się przednie-przyśrodkowo.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu rozcinającego zidentyfikuj poduszkę tłuszczową otaczającą prawy węzeł chłonny nerki, która będzie znajdować się za prawą nerką i powyżej prawych naczyń nerkowych. Identyfikacja i unikanie nadnerczy od góry (Rysunek 1B,D).</li>
	<li>Używając cienkokońcowych kleszczy lub nożyczek cienkokoletowych, tępo rozciń wokół torebki węzła chłonnego (oddzielając ją od otaczających naczyń), jednocześnie stosując delikatne przeciwdziałanie za pomocą skośnych kleszczy (Rysunek 3E).</li>
	<li>Używając cienkokońcowych prostych kleszczy, cofnij prawą głowę węzła chłonnego nerki, jednocześnie ostro naciąć przyłączenia tylne przyśrodkowe węzła chłonnego (Rysunek 3F). Uważaj, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych nerek, które biegną tuż poniżej węzła chłonnego.</li>
	<li>Obserwuj obszar pod kątem hemostazy (rysunek 3G). UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, w prawym węźle chłonnym nerek znajduje się większy, tylnie drenażujący naczynie krwionośne, które jest bardziej podatne na krwawienie po udanym usunięciu węzła chłonnego. Krwawienie z tego naczynia można kontrolować delikatnym naciskiem za pomocą wymazu z bawełnianym końcówką, aż do osiągnięcia hemostazy.</li>
	<li>Przywróć nerkę do jej pozycji anatomicznej i zamknij brzuch w dwóch warstwach (ściana brzucha i skóra) za pomocą szwów z monofilamentu polipropylenowego 6-0 w trybie biegającym. Nałóż sterylny klej chirurgiczny na ranę.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68695/68695fig3v3.jpg" /> 
Rysunek 3: Prawy limfadenetektomia nerki. (A) Nacięcie skośne prawego brzucha, tuż poniżej i z tyłu od ostatecznego żebra. (b) Krawędź wątroby jest oznaczona od góry (biała linia), a lewa nerka od dołu (linia). Prawa nadnercza jest ukryta przez krawędź wątroby. (C) Płaszczyzna do otrzewnowej zaokrzesnowej powstaje przez tępe rozcięcie bezpośrednio za nerką (strzałka). (D) Prawy węzeł chłonny nerek (białe strzałki) jest natychmiast widoczny w osłonce tłuszczowej. (E) Następnie wokół węzła (biała strzałka) tworzona jest płaszczyzna. (F) Węzeł jest delikatnie cofany i ostro wycięty wzdłuż utworzonej płaszczyzny. (G) Potwierdzono hemostazę, a pusta przestrzeń (wyblakłe strzałki od (D)), gdzie wcześniej znajdował się węzeł chłonny (biała strzałka), jest odnotowana jako wolna od pozostałych węzłów chłonnych. (H) Prawy węzeł chłonny to pojedynczy, kulisty węzeł (biała strzałka). Włożony węzeł chłonny ex vivo (2 mm x 1,5 mm). Pręty łuski: 0,2 cm. Znacznik = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68695/68695fig3v3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.</a>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Przenieście zwierzę do czystej klatki, która jest częściowo na ciepłej wodzie z cyrkulacją i dostępem do jedzenia i wody ad libitum.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu (~10-15 min) i uważnie obserwuj oznaki niepokoju. Jeśli zwierzęta nie wychodzą szybko do siebie po znieczuleniu przy odpowiednich zachowaniach (np. zwiększone oddechy, samonaprawianie, chodzenie, pielęgnacja), należy je uśpić humanitarnie (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).</li>
	<li>Gdy wszystkie zwierzęta wyzdrowieją z znieczulenia, należy zwrócić klatki do placówki opieki z dostępem do wody, jedzenia, ściółki i materiałów wzbogacających ad libitum.</li>
	<li>Obserwuj myszy co 12 godzin przez 3 dni co 12 godzin pod kątem objawów bólu lub niepokoju (np. pochylona postawa, zmniejszona aktywność, zmniejszone zaangażowanie, zła pielęgnacja). Humanitarnie uśpiać myszy wykazujące oznaki stresu.</li>
	<li>Jeśli używasz trwałego szwu (np. polipropylena monofilamentowego 6-0), obejrzyj nacięcia w 10. dniu po operacji i usuń wszelkie pozostałe materiały do szwów.</li>
</ol>
5. Obsługa węzłów chłonnych
UWAGA: Wycięty węzeł chłonny jest natychmiast gotowy do wejścia do rurociągów do dalszych zastosowań.
<ol>
	<li>Na początku poznawania tej procedury i anatomii potwierdz wycięcie węzłów chłonnych za pomocą histologii lub cytometrii przepływowej, używając wybranych barwników przeciwciał.</li>
	<li>Umieść tkankę w pożywce hodowli komórkowej (np. DMEM, RPMI) lub soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) na lodzie dla technik z żywymi komórkami lub w fiksatorze (np. 10% neutralnej buforowanej formaliny, 4% paraformaldehydu) w planowanej histologii. UWAGA: Szybkim, ale mniej dokładnym sposobem potwierdzenia obecności węzłów chłonnych jest umieszczenie usuniętej próbki w PBS. Zazwyczaj próbka głównie węzłów chłonnych zapada się, podczas gdy próbka tkanki tłuszczowej unosi się na powierzchni; Jednak przy pierwszej optymalizacji procedury zaleca się dalsze testy potwierdzające.</li>
</ol>

<ol><li>Amador-Patarroyo, M. J., Peñaranda, A. C., Bernal, M. T. Autoimmunity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmador-Patarroyo%2C+MJ+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>Echeverri, A. F., Tobón, G. J. Systemic autoimmune diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEcheverri%2C+AF+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>García-Carrasco, M., et al. Autoimmune disorders and pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarc%C3%ADa-Carrasco%2C+M+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>Sarmiento-Monroy, J. C., Mantilla, R. D., Rojas-Villarraga, A., Anaya, J. -M., et al. Lupus and immunological profiling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarmiento-Monroy%2C+JC+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. In: Anaya, J.-M. (2013).</li>
<li>Solari, N. F., Cherñavsky, A. C., et al. Rheumatologic autoimmune syndromes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolari%2C+NF+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>Kamradt, T., Mitchison, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tolerance and autoimmunity.</a> N Engl J Med. 344 (9), 655-664 (2001).</li>
<li>Rouiz-Argüelles, A., et al. Hematologic autoimmune conditions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRouiz-Arg%C3%BCelles%2C+A+%22Autoimmunity%3A+From+bench+to+bedside%22">Autoimmunity: From bench to bedside</a>. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).</li>
<li>Venanzi, E. S., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+riddance%3A+Thymocyte+clonal+deletion+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Good riddance: Thymocyte clonal deletion prevents autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 16 (2), 197-202 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+mechanisms+of+tolerance%3A+Central%2C+peripheral+and+the+role+of+T+and+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pac+Allergy%22%5BJournal%5D)">Immunological mechanisms of tolerance: Central, peripheral and the role of T and B cells.</a> Asia Pac Allergy. 13 (4), 175-186 (2023).</li>
<li>Swartz, M. A., Hubbell, J. A., Reddy, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+function+and+its+immunological+implications%3A+From+dendritic+cell+homing+to+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage function and its immunological implications: From dendritic cell homing to vaccine design.</a> Semin Immunol. 20 (2), 147-156 (2008).</li>
<li>O'Byrne, A. M., Van Baarsen, L. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+nodes+as+gatekeepers+of+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Lymph nodes as gatekeepers of autoimmune diseases.</a> RMD Open. 10 (4), e004097(2024).</li>
<li>Hampton, H. R., Chtanova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+migration+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic migration of immune cells.</a> Front Immunol. 10, 1168(2019).</li>
<li>Fortuna, G., Brennan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus%3A+Epidemiology%2C+pathophysiology%2C+manifestations%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Dent+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus: Epidemiology, pathophysiology, manifestations, and management.</a> Dent Clin North Am. 57 (4), 631-655 (2013).</li>
<li>Hanly, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+and+outcome+of+lupus+nephritis%3A+Results+from+an+international+inception+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The frequency and outcome of lupus nephritis: Results from an international inception cohort study.</a> Rheumatology. 55 (2), 252-262 (2016).</li>
<li>Andrews, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+murine+lupus-like+syndromes%3A+Clinical+and+immunopathological%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous murine lupus-like syndromes: Clinical and immunopathological.</a> J Exp Med. 148, 1198-1215 (1978).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Morse, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+induced+by+the+mutant+gene%2C+lpr.+Patterns+of+disease+and+expression+of+murine+leukemia+viruses+in+SJL%2FJ+mice+homozygous+and+heterozygous+for+lpr%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Abnormalities induced by the mutant gene, lpr. Patterns of disease and expression of murine leukemia viruses in SJL/J mice homozygous and heterozygous for lpr.</a> J Exp Med. 161 (3), 602-616 (1985).</li>
<li>Ayalon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+semorinemab+reduces+tau+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+and+engages+tau+in+patients+with+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Antibody semorinemab reduces tau pathology in a transgenic mouse model and engages tau in patients with Alzheimer's disease.</a> Sci Transl Med. 13 (593), eabb2639(2021).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+renal+lymph+nodes+is+linked+to+systemic+and+local+injury+to+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in renal lymph nodes is linked to systemic and local injury to the kidney.</a> Kidney Int. 68 (3), 1096-1108 (2005).</li>
<li>Lan, H. Y., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+inflammatory+macrophages+from+the+kidney+lymph+nodes+during+experimental+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trafficking of inflammatory macrophages from the kidney lymph nodes during experimental glomerulonephritis.</a> Clin Exp Immunol. 92, 336-341 (1993).</li>
<li>Karmali, R. J., Suami, H., Wood, C. G., Karam, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+in+renal+cell+carcinoma%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage in renal cell carcinoma: Back to the basics.</a> BJU Int. 114 (6), 806-817 (2014).</li>
</ol>

R.A.F. jest doradcą dla Glaxo Smith Kline, Plythera Inc. oraz Ventus Therapeutics. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Opisano tutaj procedurę przeżywalnościową zapewniającą bezpieczną i dobrze tolerowaną obustronną lymfadenektomię nerek u myszy. Głównym ograniczeniem tego zabiegu jest stosunkowo mały rozmiar węzłów chłonnych nerek, co wymaga zastosowania mikroskopu operacyjnego. Bez mikroskopu operacyjnego pewność resekcji może być trudna do przeprowadzenia. Niektóre genetyczne modele myszy mają powiększone węzły chłonne, co ułatwia identyfikację i naukę techniki17. U zdrowych, dzikich myszy węzły chłonne mogą by...

Choroby autoimmunologiczne obejmują każdy narząd w ludzkim ciele, od stosunkowo ograniczonych narządów, takich jak autoimmunologiczne zapalenie wątroby, zapalenie błony naczyniowej i cukrzyca typu 1, po powszechne choroby, takie jak stwardnienie układowe czy sjögrena 1,2,3,4,5. Tolerancja immunologiczna jest kluczowym etapem rozwoju komórek B i T, aby zapobiegać samoreaktywności6. Chociaż centralna tolerancja przez klonalną delekcję w grasicy jest konieczna i skuteczna, sama ta metoda pozostawia luki w obronie przed autoimmunologią 7,8. Tolerancja obwodowa to wtórna bariera dla samoreaktywności poprzez anegię, delecję lub wyczerpanie limfocytów B i T, która zachodzi w wtórnych narządach limfatycznych, w tym w regionalnych węzłach chłonnych odprowadzających tkanki po drenażu antygenowym 9,10. Jednak coraz bardziej jasne staje się, że komórki autoreaktywne mogą przebywać w tych węzłach chłonnych i migrować z nich u osób podatnych genetycznie i/lub środowiskowo po niewłaściwej aktywacji11,12.
Toczeń rumieniowaty układowy to jedna z takich chorób autoimmunologicznych, z wyraźnym zaangażowaniem komórek B i T w wielu układach narządowych13. Szczególnie częstym i chorobliwym objawem jest zapalenie nerek tocznia i postęp do końcowego stadium choroby nerek14. Zdolność do zrozumienia bezpośredniego wpływu lokalnie występujących komórek B i T w chorobach nerek wywołanych chorobami autoimmunologicznych, w przeciwieństwie do krążącej ogólnoustrojowej patofizjologii, jest obecnie ograniczona przez brak możliwości selektywnego zaburzenia tych węzłów. Mając na uwadze tę lukę, opracowano procedurę przeżywalności dla mysiej obustronnej limfadenektomii nerkowej, która została opisana tutaj.
Ogólnym celem tego protokołu jest bezpieczne i niezawodne wycięcie obustronnych węzłów chłonnych nerek u myszy o wysokiej przeżywalności i tolerancji pooperacyjnej. Zabieg ten najlepiej sprawdziłby się w badaniach lokalnego wpływu węzłów chłonnych nerek na stymulację, aktywację i tolerancję komórek odpornościowych związanych z chorobą nerek. Zabieg ten jest idealny w połączeniu z modelami autoimmunologicznymi lub onkologicznymi wpływającymi na nerki.

<table><tbody><tr><td>Obwód anestezjologiczny</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Albo znieczulenie do zastrzyków</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD LSRII (lub odpowiednik)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Wyposażony w oprogramowanie FACS Diva</td></tr><tr><td>Buprenorfina XR</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Dla przeciwbólu</td></tr><tr><td>Medium do hodowli komórkowych &nbsp;</td><td>Dowolny</td><td></td><td>(dla technik z żywymi komórkami; np. DMEM lub RPMI)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegenda</td><td>422801</td><td>Stężenie robocze: 15 ug/mL</td></tr><tr><td>Lampy LED mikroskopu z podwójną lub podwójną gęsią szyjką</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70% w wodzie)</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Do czyszczenia</td></tr><tr><td>FITC-sprzężony antymyszy CD45.2 (104)</td><td>Biolegenda</td><td>109806</td><td>Stężenie robocze: 5 ug/mL</td></tr><tr><td>Kleszcze: Ukośne kleszcze z cienkim końcówkami (x2)</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td>Materiał: Dumoxel; Wzór #5, kąt 45 stopni; Rozmiar grotu 0,1 x 0,06 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze: Kleszcze z drobnymi końcówkami</td><td>Roboz</td><td>RS-4960</td><td>Materiał: Dumostar; Wzór #1; Rozmiar grotu: 0,20 x 0,12 mm</td></tr><tr><td>Kleszcze: Kleszcze z drobnymi końcówkami</td><td>Roboz</td><td>RS-4966</td><td>Materiał: Dumostar, wskazówka biologiczna; Wzór #3; Rozmiar grotu: 0,08 x 0,04 mm</td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Dla przeciwbólu</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Jax</td><td></td><td>Dla szczepu C57BL/6, dzikich myszy: The Jackson Laboratories #000664</td></tr><tr><td>Przewozki igły</td><td>Roboz</td><td>RS-6410</td><td>uchwyt na igły Castroviejo; Prosta</td></tr><tr><td>Mikroskop operacyjny</td><td>Leica</td><td>MZ9.5</td><td>Stereo mikroskop operacyjny Leica Mz9.5</td></tr><tr><td>OPCJONALNIE: Barwnik Evans Blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>Do śledzenia limfy.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór povidonu i jodu</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Do przygotowania/sterylizacji skóry</td></tr><tr><td>Nożyczki: Nożyczki z dodatkowymi cienkimi końcówkami</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>McPherson-Vannas; Krawędź tnąca 3 mm; zakrzywiony</td></tr><tr><td>Nożyczki: Nożyczki średnie</td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td>Noyes; Krawędź tnąca 13 mm; proste</td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny</td><td>Dowolny</td><td></td><td>np. klej tkankowy 3M Vetbond</td></tr><tr><td>Szew: polipropylen 6-0 niebieski monofilament</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz tkankowy</td><td>Dowolny</td><td></td><td>(dla planowanej histologii; tj. 10% neutralnej formaliny buforowanej lub 4% paraformaldehydu)</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza z cyrkulacją w ciepłej wodzie</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy &nbsp;</td><td>&nbsp; Laboratoria Jacksona</td><td></td><td>W przypadku szczepu Balb/c, myszy podatne na toczeń (MRL/MpJ-Fas-lpr/J): #000485</td></tr></tbody></table>

grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Murine Bilateral Renal Lymphadenectomy

Choroby autoimmunologiczne są wynikiem nieprawidłowego celowania komórek odpornościowych w tkanki własne, co prowadzi do patologii i uszkodzenia narządów życiowych. Wtórne narządy limfoidalne służą jako miejsce aktywacji komórek B i T oraz obwodowej tolerancji immunologicznej, co jest konsekwencją drenacji antygenowej i transportu komórek prezentujących antygeny (APC) przez lokalne limfatyczne. Rola miejscowych węzłów chłonnych jako początkowego miejsca aktywacji limfocytów została opisana w przypadku guzów, infekcji i chorób autoimmunologicznych specyficznych dla narządów, ale nie w autoimmunologii ogólnoustrojowej. Toczeń rumieniowaty układowy, jedna z takich chorób, to powszechna choroba autoimmunologiczna, której częste zaangażowanie nerek prowadzi do uszkodzenia nerek, a w końcu do niewydolności. Dalsze zrozumienie roli węzłów chłonnych nerk, które są głównym miejscem drenażu antygenów i transportu APC z nerek, jest ograniczone przez brak możliwości selektywnego zaburzenia tej tkanki. Opisano tutaj procedurę przeżywalnościową zapewniającą bezpieczną i dobrze tolerowaną obustronną lymfadenektomię nerek u myszy. Zawiera szczegółowe instrukcje, pomoce wizualne, pomocne wskazówki na poprawę sukcesu oraz rozwiązywanie pułapek proceduralnych. Długoterminowe przeżycie jest doskonałe i obserwowano go co najmniej 4 miesiące po operacji. Przecięte węzły chłonne nerek są nienaruszone i natychmiast gotowe do dalszego przetwarzania. Zabieg ten najlepiej sprawdza się w badaniach lokalnego wpływu na węzły chłonne nerk.

Procedurę tę można wykonać w 15-20 minut na każdą mysz. Aby potwierdzić dokładność tego zabiegu, wykonano obustronne limfadenektomie nerek u pięciu dzieci w wieku 8-12 tygodni, o wieku wieku, płci i genotypie dopasowanym według miotu. Wszystkie myszy dobrze tolerowały zabieg i miały 100% przeżycia okołooperacyjnego. Usunięte próbki umieszczono w PBS na lodzie. Wszystkie próbki natychmiast zatonęły, potwierdzając niską zawartość tłuszczu. Usunięte próbki (oraz cztery oddzielne grupy tkankowe tłuszczowe) były następnie mia...

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Autoimmune diseases are the result of immune cells inappropriately targeting self-tissue, leading to pathology and damage to vital organs. Secondary ...

Badamy transport komórek odpornościowych z węzła chłonnego nerek do nerki oraz antygenu nerkowego do węzła chłonnego drenażowego. Nasze podejście chirurgiczne daje unikalną zaletę, że możemy selektywnie zakłócać węzły chłonne nerk, pozostawiając wszystkie pozostałe węzły chłonne nienaruszone, w dobrze tolerowanym modelu długoterminowego przetrwania. Teraz, gdy ten model został opracowany, możemy zbadać wpływ węzłów chłonnych nerek i odpowiedzi immunologicznej oraz to, jak usunięcie tych węzłów przyczynia się do uszkodzenia nerek związanego z układem odpornościowym.Na początek połóż znieczulone zwierzę na stole operacyjnym i nałóż maść. Użyj taśmy, aby zabezpieczyć lewą rękę zwierzęcia w wyższym kierunku, a ogon w kierunku dolnym, aby uzyskać zrelaksowaną, ale wydłużoną postawę. Ogol sierść i zdezynfekuj miejsce operacji trzy razy.Po potwierdzeniu głębokości znieczulenia za pomocą szczypania palca, wykonaj jednocentymetrowe skośne nacięcie przez skórę tuż poniżej śledziony, około centymetra poniżej ostatniego żebra. Za pomocą tępego rozwarstwiania oddziel skórę od ściany brzucha i klatki piersiowej oraz zidentyfikuj śledzionę wewnątrz jamy brzusznej. Następnie wykonaj nacięcie o śre

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Pobieranie węzła chłonnego drenującego pachwiny z modelu mysiego

Ten film demonstruje technikę kanniulacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów. Metoda ta umożliwia bezpośredni dostęp do całej objętości składników obecnych w płynie limfatycznym.

Kaniulacja krezki limfatycznej w modelu szczura w celu pobrania płynu limfatycznego

Modele spontanicznej progresji choroby raka nerkowokomórkowego z przerzutami (RCC) mogą być używane do oceny leczenia w klinicznie istotnych warunkach. Protokół ten demonstruje różne procedury ortotopowej implantacji komórek nowotworowych nerki, prawidłowej nefrektomii, a na koniec przedstawia przewodnik po sekcji zwłok do wizualnej i bioluminescencyjnej oceny obciążenia i lokalizacji przerzutów.

Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii

Tutaj opisujemy technikę kannuacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów, która umożliwia ilościowe określenie transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny po porodzie jelitowym. Technika ta może być dostosowana do oceny stężenia limfy krezkowej i/lub transportu płynu, komórek odpornościowych, peptydów, białek i cząsteczek lipofilowych.

Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

Celem tego manuskryptu jest opisanie kroków wymaganych do przeprowadzenia przeszczepu nerki u myszy, zwracając szczególną uwagę na szczegóły zespolenia tętniczego.

Technika przeszczepu nerki u myszy

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Ten manuskrypt wprowadza ustandaryzowany protokół dla nefrektomii 5/6 poprzez ostrą bipolektomię poprzez laparotomię w linii środkowej na modelu szczurzym, mający na celu wywołanie stanu niewydolności nerek poprzez redukcję miąższu nerki z dużą precyzją metodyczną i niskim ryzykiem błędu technicznego.

5/6 Nefrektomia przy użyciu ostrej bipolektomii przez laparotomię w linii środkowej u szczurów

Ten protokół opisuje metodę wywoływania jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO) u myszy w celu zbadania postępu zwłóknienia tkanek w nefropatii obturacyjnej. Obejmuje zabiegi chirurgiczne, opiekę pooperacyjną i metody oceny zwłóknienia.

Model jednostronnej niedrożności moczowodu do badania zwłóknienia śródmiąższowego nerek

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje, które umożliwią badaczom wykonanie odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu u myszy przy użyciu ustandaryzowanego modelu, który umożliwia analizę długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużonej niedrożności moczowodu.

Mysi model do oceny długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużającej się jednostronnej niedrożności moczowodu

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Poznaj technikę dwustronnej limfadenektomii nerek u myszy, umożliwiającą selektywne usunięcie węzłów chłonnych przy zachowaniu innych tkanek. Metoda wspiera długoterminowe przetrwanie zwierząt i analizę odpowiedzi immunologicznej.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Przeglądaj więcej filmów