Wykorzystanie mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu do podłużnego pobierania płynu śródmiąższowego w zwierzęcym modelu glejaka

Charakteryzujemy rozpuszczalne składniki sygnalizacyjne w płynie śródmiąższowym guza mózgu, które przyczyniają się do postępu choroby i odpowiedzi na leczenie. Ocena absolutnych stężeń substancji rozpuszczonych w śródmiąższowym guzie mózgu pozostaje wyzwaniem badawczym wymagającym zastosowania zaawansowanych metod eksperymentalnych. Na początek, używając sterylnego skalpela, wykonaj strzałkowe nacięcie środkowe wzdłuż powierzchni czaszki, zaczynając między oczami i rozciągając się kaudalnie na 8 do 10 milimetrów.

Następnie użyj sterylnych kleszczy, aby bocznie cofnąć skórę od nacięcia środkowego. Upewnij się, że zarówno bregma, jak i lambda są widoczne, i w razie potrzeby przedłuż nacięcie. Następnie sterylnym skalpelem naciń okost i cofnij tkankę bocznie za pomocą kleszczy.

Nałóż od 1% do 3% nadtlenku wodoru sterylnym aplikatorem z bawełnianym końcówką, aby oczyścić powierzchnię czaszki. Teraz użyj strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 do 1,0 mililitra, aby równomiernie nałożyć 20 do 40 mikrolitrów samotrawiającego kleju dentystycznego na powierzchnię czaszki. Następnie wystaw ją na światło do utwardzania zębów, aby wytrawić klej.

Po utwardzeniu usuń nadmiar kleju sterylnymi aplikatorami z bawełnianymi końcówkami i solą fizjologiczną. Przesuń wiertło do współrzędnej prowadnicy cOFM. Ustaw wiertarkę na 15 000 obrotów na minutę i wywierć otwór na zadzior, używając mikromanipulatora DV.

Często monitoruj grubość czaszki podczas wiercenia i przepłukuj solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia i zmniejszyć temperaturę. Powtórz procedurę wiercenia przy każdej współrzędnej śruby kotwicznej. Teraz zamontuj śruby kotwiące za pomocą sterylnych kleszczy i sterylnego śrubokręta, aż włożysz je na głębokość jednego lub dwóch gwintów.

Następnie zamontuj prowadnicę cOFM i zespół atrapowy w uchwytie prowadnicy i przymocuj uchwyt do ramy stereotaktycznej. Umieść końcówkę prowadzącą nad otworem na zadziornie i powoli opuszczaj ją do ustalonej głębokości z prędkością 1 milimetra na minutę. Nakładaj środek cementujący na czaszkę cienkimi, jednolitymi warstwami, pokrywając obszary pod i wokół prowadnicy cOFM oraz śrub.

Użyj światła do utwardzania zębów, aby utwardzić każdą warstwę przed nałożeniem kolejnej. Upewnij się, że cement pokrywa cały obszar między komponentami, unikając klina blokującego. Odłącz uchwyt prowadnicy od prowadnicy cOFM i powoli ją podnieś za pomocą pokrętła DV mikromanipulatora.

Używając kleszczy, usuń klin blokujący z prowadnicy cOFM i zespołu atrapy. Delikatnie wyjmij manekina z prowadnicy. Użyj pokręteł mikromanipulatora ML i AP, aby wyrównać zespół wkładki do infuzji strzykawki na prowadnicy cOFM.

Opuść wkład infuzyjną za pomocą pokrętła DV i zabezpieczyć go mocno, ponownie wkładając klin blokujący za pomocą kleszczy. Teraz wstrzyknij 3 mikrolitry zawiesiny komórkowej ze strzykawki o stężeniu 1 mikrolitra na minutę. Monitoruj okolice przewodnika cOFM, aby upewnić się, że żadna zawiesina komórkowa nie wydostaje się z zespołu.

Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy i zespołu wkładki infuzyjnej. Następnie ostrożnie wyjmij wkład infuzacyjny z przewódki, używając pokrętła DV. Napełnij przewody rurek push and pull sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym za pomocą gazoszczelnych szklanych strzykawek.

Zamontuj perystaltyczną część rury w głowicy pompy mikroperfuzyjnej. Podłącz woreczek perfuzacyjny do rurki pchającej za pomocą złącza Luer lock. Następnie podłącz wkładkę próbkową do rurki za pomocą złączek z kołnierzem.

Przyczep dłuższy wał wlotowy do końca wyjściowego rury pchającej, a krótszy wał wylotowy do końca wejścia rury ciągniącej. Umieść podłączoną wkładkę do pobrania próbki do sterylnej rurki mikrowirówki zawierającej 750 mikrolitrów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego. Podłącz iglicę kolektora frakcji do linii wyjściowej rury ciągniętej za pomocą złącza rury z kołnierzem.

Następnie wykonaj przepłukanie rurki przez 20 minut przy 10 mikrolitrach na minutę, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. Następnie wstępnie napełnij rurkę wyciągającą sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym za pomocą gazoszczelnych strzykawek. Ponownie zamontuj rurkę perystaltyczną w głowicy pompy mikroperfuzyjnej.

Podłącz wkładkę do próbki ponownie, używając złączek rur z kołnierzem. Podłącz wlot do końca wyjściowego rurki ciągnącej, a wylot do końca wejścia rurki ciągnącej. Włóż wkładkę do sterylnej mikrowirówki z 750 mikrolitrami sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.

Wykonaj kolejne 20-minutowe przepłukanie rur przy 10 mikrolitrach na minutę, aby usunąć wszelkie pozostałości pęcherzyków powietrza. Umieść znieczulone zwierzę w odpowiednio dopasowanej kurtce. Przeciągnij przednie kończyny całkowicie przez otwory na ramiona i mocno przypnij kurtkę na grzbiet zwierzęcia.

Użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy i atrapy. Następnie ostrożnie wyjmij wkładkę atrapową z prowadnicy. Delikatnie zamontuj wkładkę próbkową w prowadnicy i ponownie włóż klin blokujący.

Wyjmij zwierzę z narkozy i umieść je w obracającym się systemie klatki. Przymocuj linę klatki do kurtki zwierzęcej i aktywuj system obrotowej klatki. Po pobraniu próbek cOFM dezaktywuj system obrotowej klatki i odłącz linę klatki od kurtki zwierzęcia.

Teraz użyj kleszczy, aby usunąć klin blokujący z prowadnicy i zestawu wkładki próbkowej. Ostrożnie wyjmij wkładkę próbkową z prowadnicy, następnie delikatnie włóż wkładkę atrapową z powrotem do prowadnicy i ponownie włóż klin blokujący. Odpiąć zapięcia z tyłu kurtki zwierzęcej i delikatnie zdejmij kurtkę z ciała.

Obrazowanie bioluminescencyjne potwierdziło obecność guzów u zwierząt z przeszczepem komórek nowotworowych za pomocą przewodnika cOFM. Analiza głównych składników proteomicznych płynu śródmiąższowego pobranego z próbki cOFM wykazała wyraźne rozdzielenie między grupami zwierzęcymi poddawanymi temozolomidem a grupami poddawanymi dimetylosulfoxid. Globalne rozkłady sygnałów metabolomowych pokrywały się niemal idealnie między próbkami temozolomidu i dimetylosulfotlenku.

Pomimo nakładania się sygnałów, analiza wulkanów metabolomicznych wykazała wyraźne przesunięcie wywołane przez temozolomid. Ilościowe porównania wartości metabolomicznych u tych samych zwierząt wykazały, że konfiguracje recyrkulacyjne poprawiały stężenia analitów, zachowując względne proporcje metabolitów. Względna dostępność składników odżywczych w mikrośrodowisku guza mózgu pozostaje słabo poznana.

Ten protokół jest wykorzystywany do wypełniania tej luki. Scharakteryzowanie dostępności składników odżywczych i sygnalizacji w mikrośrodowisku guza może wyjaśnić mechanizmy postępu glejaka oraz adaptacyjnej oporności na leczenie.