Name: Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Naucz się przygotowywać rozprzestrzenianie chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji. Ta metoda umożliwia badaczom analizę struktur chromosomalnych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego projektu zapewniono z nagrody K99 od Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development (HD112986 do TH).

Wszystkie procedury i obsługa zwierząt zostały wykonane po zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella (IACUC) zgodnie z protokołem 2004-0063.
1. Przygotowanie preparatu rozprzestrzeniającego się na chromosomie profazy I oocytu
<ol>
	<li>Późnym popołudniem zorganizuj synchronizowane gody samic myszy C57BL/6J (2–6 miesięcy) z samcami (2–12 miesięcy). Od następnego dnia codziennie rano (przed 9:00) sprawdzaj samice pod kątem zatyczki kopulacyjnej. Południe w dniu włączenia jest definiowane jako 0,5 dpc.</li>
	<li>Przygotuj następujące informacje przed poświęceniem ciężarnych myszy.<ol>
		<li>Zorganizuj komorę nawilżoną z temperaturą pokojową H2O.</li>
		<li>Przygotuj 10 mL buforu ekstrakcji hipotonicznej (HEB; patrz Tabela 1) składającego się z 30 mM Tris-HCl, 50 mM sacharozy, 17 mM cytrynianu sodu, 5 mM EDTA, 2,5 mM DTT oraz 0,5 mM PMSF w wodzie Milli-Q. Przed dodaniem DTT i PMSF należy dostosować pH do 8,2 - 8,4 za pomocą 50 mM kwasu borowego. Zrób HEB świeżo i użyj w ciągu 2 godzin od dodania DTT.</li>
		<li>Przygotuj 100 mM sacharozy, dodając 342 mg sacharozy do 10 ml ultraczystego H2O. Przechowuj w 4 °C, gdy nie jest używana.</li>
		<li>Podgrzej ultraczyste H2O w standardowej mikrofalówce przez 1 minutę (do 90–95 °C). Pod okap do spalin dodaj podgrzane ultraczyste H2O do 0,5 g paradehydu (PFA). Dodaj dwie krople 1 N NaOH, wymieszaj i pozwól ostygnąć do temperatury pokojowej. Reguluj pH do 9,2 - 9,3 za pomocą 50 mM kwasu borowego i dodaj Triton X-100 do 0,15% (v/v). Dodaj ultraczyste H2Odo końcowej objętości 50 mL (1% roztwór utrwalacza PFA) i wlej utrwalacz do szklanego słoika Coplin o pojemności 50 mL UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu wody niemal wrzącej do przygotowania PFA; jednak podgrzewanie PFA w roztworze powyżej 65 °C może powodować degradację i uwalnianie toksycznych oparów. Alternatywnie, podgrzej ultraczyste H2O do 60 °C w kąpieli wodnej.</li>
		<li>Czyste szkiełka mikroskopowe z 70% etanolu. Użyj hydrofobowego barierowego długopisu PAP, aby narysować do trzech kwadratów (około 20 x 20 mm; patrz rysunek 1E). Pojedyncza para jajników zapewni wystarczającą ilość materiału na sześć kwadratów (lub dwa preparaty po 3 kwadraty każdy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ofiarowanie ciężarnych myszy 14,5 - 18,5 dpc przez uduszenieCO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi IACUC.<ol>
		<li>Punkty czasowe wzbogacenia określonych etapów profazy I u myszy C57BL/6J przedstawiono na Rysunku 1A. Dla podanych punktów czasowych rozwoju przybliżony procent oocytów w każdym stadium profazy I został podany na podstawie danych z Evans i in. (1982)31. Dla jajów zygotenowych pobierać na 16,5 dpc; wczesny pachyten na 17,5 DPC; oraz średni pachyten - diploten w stężeniu 18,5 DPC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj nożyczek do sekcji, aby otworzyć jamę brzuszną i usunąć rogi macicy.</li>
	<li>Rozdzielić myszy płodowe od rogu macicy, tkanki dziesięcialnej i worka żółtkowego. Umieść myszy płodowe w szalce Petriego o średnicy 100 mm z 1x fosforanową solą fizjologiczną (PBS).</li>
	<li>Rozcinaj jajniki jednego płodu żeńskiego na raz, zachowując pozostałe w 1x PBS. Ofiara myszy płodowych przez dekapitację zgodnie z wytycznymi IACUC. Za pomocą stalowych szpilek do próbek przymocuj brzuszną powierzchnię tułowia do krzemowej podkładki w misce do sekcji.</li>
	<li>Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby zrobić nacięcie tuż poniżej pępka, uważając, by nie przeciąć tętnic. Użyj cienkich kleszczy, aby przesunąć jelito, aż rogi macicy płodu będą widoczne.</li>
	<li>Aby zlokalizować jajniki, podążaj za każdym rogiem macicy na zewnątrz od pęcherza w kierunku nerek. Jajnik i jajowód pojawiają się jako małe kule na końcach rogów macicy, położone tuż poniżej nerki i blisko tylnej części jamy otrzewnej (Rysunek 1B).</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby ściskać jajniki i zbierać je w małym szkle zegarkowym wypełnionym 750 μL 1x PBS.</li>
	<li>Rozdziel jajnik od otaczających tkanek i umieść oba jajniki w szklance zegarkowej zawierającej 750 μL HEB, dbając o całkowite zanurzenie jajników (patrz Rysunki 1C i 1D). Inkubuj jajniki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pipeta 35 μL 100 mM sacharozy na wklęsłą szkiełkę. Użyj cienkich kleszczy, aby przenieść oba jajniki z HEB do sacharozy.</li>
	<li>Użyj igły 25G, aby przymocować jajnik do szkiełka, a drugą igłą, fazowaną w dół, wycisnąć jajniki z jajnika.<ol>
		<li>Gdy jajnik stanie się przezroczysty i galaretowaty, usuń jajnik z HEB i powtórz ten proces z drugim jajnikiem. Delikatnie podaj roztwór pipetą, aby rozproszyć komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz szkiełko w słoiku Coplin z PFA i krótko osusz krawędź szkiełka o ręcznik papierowy. Po zebraniu PFA w małe krople wzdłuż hydrofobowej granicy każdego kwadratu (Rysunek 1E), pipetuj 5 μL roztworu oocytu i sacharozy do każdej kropli PFA.</li>
	<li>Rozłóż oocyty na kwadratowych częściach, delikatnie przechylając szkiełka tam i z powrotem. Uważaj, aby rozwiązanie z jednego pola nie rozlało się na sąsiednie kwadraty.</li>
	<li>Umieść szkiełko w wilgotnej komorze i kontynuuj tworzenie preparatów, aż roztwór jajkowo-sacharozowy się wyczerpie.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1,6 - 1,15, aż wszystkie płody żeńskie zostaną użyte. Inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji otwórz wilgotną komorę. Ponieważ większość (jeśli nie wszystkie) cieczy/utrwalacza powinna nadal znajdować się na powierzchni szkiełka (około 10 μL w każdym sekcji kwadratowej), delikatnie przełóż szkiełka na ręcznik papierowy i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym (proces ten zwykle trwa 30–60 minut, w zależności od lokalnej wilgotności). UWAGA: Preparaty można również suszyć na powietrzu pod okapem wyparowym, aby ograniczyć potencjalne narażenie na pozostałości oparów PFA. To skróci też czas schnięcia do około 20-30 minut.</li>
	<li>Wash wsuwa 0,4% środek zwilżający w ultraczystym H2Oprzez 2 minuty. Pozwól zjeżdżalniom całkowicie wyschnąć. UWAGA: W tym momencie preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C; jednak niektóre epitopy są niestabilne (np. z naszego doświadczenia wynika, że MLH1 słabo barwi, a barwienie SYCP3 ma znaczące artefakty po zamrożeniu). Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe immunobarwienie preparatów.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne rozprzestrzeniania się chromosomu profazy I
<ol>
	<li>Przygotuj 10x bufor rozcieńczający przeciwciała (ADB; patrz Tabela 2) zawierający 10% (v/v) prawidłowego surowicy koziej, 3% (w/v) albuminy surowicy bydłej (BSA) oraz 0,05% Triton X-100 w 1x PBS. Filtruj filtr za pomocą filtra 0,45 μm i przechowywaj w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	<li>Wash w słoiku Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w 1x PBS przez 10 minut. Wash slide w słoiku Coplin o stężeniu 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut. Blokowe preparaty w słoiku Coplin z 1x ADB przez 10 minut.</li>
	<li>Rozcieńcz wybrane przeciwciała pierwotne w 10x ADB (zobacz Tabelę Materiałów dla listy przeciwciał i ich rozcieńczeń).<ol>
		<li>Przygotuj cztery kombinacje przeciwciał do immunobarwienia multiplexowego: (1) SYCP332, 33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP3 32, 333, MSH432, MLH332; oraz (4) SYCP334, MLH132, 33, 34, CREST35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń szkiełki z ADB, usuń nadmiar płynu i umieść szkiełki w nawilżonej komorze z wodą o temperaturze pokojowej. Należy nałożyć 30 μL rozcieńczonych przeciwciał na przekrój kwadratowy każdego preparatu, uważając, aby przeciwciała z jednego kwadratu nie przelały się do sąsiednich kwadratów.</li>
	<li>Zamknij komorę nawilżoną i pozwól szkiełkom inkubować się przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnego ranka otwórz wilgotną komorę i usuń rozcieńczone przeciwciała ze szkiełek. Powtórz krok 2.2.</li>
	<li>Rozcieńcz wybrane przeciwciała wtórne w 10x ADB (patrz Tabela materiałów). UWAGA: Od tego momentu preparaty i przeciwciała są fotoczułe. Wykonaj wszystkie kolejne inkubacje w ciemności.</li>
	<li>Usuń preparaty z ADB, wysusz nadmiar płynu i umieść je w nawilżonej komorze z wodą w temperaturze pokojowej. Nakładaj 30 μL wybranych rozcieńczonych przeciwciał na przekrój kwadratowy każdego preparatu, uważając, aby przeciwciała z jednego kwadratu nie przelały się do sąsiednich kwadratów.</li>
	<li>Zamknij komorę nawilżoną i pozwól szkiełkom inkubować się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz szkiełki 3 razy po 5 minut w słoikach Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w 1x PBS. Płucz szkiełki przez 5 minut w słoiku Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w ultraczystej H2O.</li>
	<li>Nałóż niewielką kroplę (około 10 μL) nośnika antyfade z barwnikiem 4', 6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) lub równoważnym kwasem nukleinowym. Na każdym szkiecie załóż szklaną pokrywkę o wymiarach 60 mm x 24 mm nr 1,5 i ostrożnie wytłucz nadmiar płynu. UWAGA: Slajdy mogą być uszczelniane przezroczystym lakierem do paznokci lub gumowym klejem. Jeśli używasz montantu do utwardzania, uszczelnianie szkieł nie jest konieczne. Slajdy powinny być przechowywane w pudełku lub teczce na slajdy w temperaturze 4 °C. Chociaż najlepszą praktyką jest fotografowanie preparatów krótko po barwieniu, z naszego doświadczenia wynika, że preparaty przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C mogą zachowywać intensywność sygnału przez kilka miesięcy do roku. Do dłuższego przechowywania preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka lat bez znaczącej utraty jakości sygnału.</li>
	<li>Komórki obrazujące 63x za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (patrz Tabela materiałów). Użyj oprogramowania do analizy obrazów (np. Zen of ImageJ, patrz Tabela materiałów) do pomiaru długości SC i intensywności fluorescencji wszystkich kanałów wzdłuż osi. Przerysuj długość każdej osi chromosomu (SYCP3), zaczynając od centromeru (obszar gęstości CREST lub DAPI).<ol>
		<li>Do analizy HORMAD1 i SYCP1 zapisz długości szczytów sygnału fluorescencyjnego. Oblicz całkowite długości szczytów HORMAD1 lub SYCP1 i podziel je przez długość osi chromosomu.</li>
		<li>Do analizy MSH4 określ liczbę pików sygnału fluorescencyjnego dla każdego pomiaru SYCP3. Zarejestruj zarówno łączną liczbę szczytów MSH4 na jądro, jak i liczbę szczytów MSH4 nakładających się na szczyty MLH3. Potwierdź liczbę MSH4, porównując piki z odpowiadającą im liczbą ognisk.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowania diakinezy/prometafazy do obserwacji chiasmatów
<ol>
	<li>Aby zmaksymalizować wydajność mejotycznie kompetentnych oocytów, użyj młodych samic myszy (25–28 dni). UWAGA: Stymulacja przez podanie dootrównowej 5 IU gonadotropiny gonadotropiny (PMSG) w surowicy gonadotropiny (PMSG) u samic myszy w celu zwiększenia wydajności może być przeprowadzona przez podanie dotrwowej u samic myszy w ciąży. Jednak na potrzeby analiz chiasmatów można pobrać wystarczającą ilość oocytów pęcherzyków zarodkowych (GV) od samic niestymulowanych.</li>
	<li>Przed poświęceniem myszy przygotuj następujące odczynniki i roztwory.<ol>
		<li>Pozwól, by M2 (3 mL na mysz) i KSOM (1 mL na mysz) wyrównały się w inkubatorze hodowli komórkowych (37 °C, 5%CO2) przez co najmniej godzinę. UWAGA: Probówki z mrożonymi ośrodkami można umieścić w inkubatorze z rozluźnionymi pokrywkami wieczorem przed pobraniem oocytów, co pozwala na około 14 godzin równowagi.</li>
		<li>Przygotuj ośrodek M2 z 2,5 μM milinonu (inhibitor izoenzymu fosfodiesterazy zapobiegający wznowieniu mejotycznego)36. Pipetą włóż pięć kropli po 20 μL M2 + milrynon do 35 mm szalki Petriego i nałóż lekki olej mineralny (Rysunek 2C).</li>
		<li>Pipetuj pięciokrotną 20 μL KSOM do szalki Petriego o średnicy 35 mm i nałóż lekki olej mineralny (rysunek 2C). UWAGA: Kontrola temperatury i pH jest kluczowa dla dojrzewania oocytów in vitro. Pobieranie oocytów powinno odbywać się na podgrzewanym (37 °C) blacie stołowym. Wszystkie media powinny być przechowywane w inkubatorze do czasu użycia, a misy z mediami powinny być usuwane pojedynczo, aby ograniczyć zakłócenia spowodowane ekspozycją na powietrze otoczenia.</li>
		<li>Czyść szkiełka mikroskopowe z 70% etanolem i pozwól wyschnąć na powietrzu. Na odwrocie szkiełek mikroskopowych lekko narysuj (piórem z diamentowym końcówką) lub narysuj (wodoodpornym tuszem) siatkę 5 x 5 o wymiarach ~ 4 mm x 4 mm kwadratów (przykład pokazano na Rysunku 2B i można go wykorzystać do odrysowania siatki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj oocyty od jednej myszy na raz. Ofiara u samicy myszy przez uduszenieCO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi IACUC.</li>
	<li>Użyj nożyczek do sekcji, aby otworzyć jamę brzuszną. Użyj cienkich kleszczy, aby przesunąć jelita.</li>
	<li>Podążaj za każdym rogiem macicy od pęcherza w kierunku nerek. Jajniki i jajowody są połączone z małym poduszkiem tłuszczowym w pobliżu nerek.</li>
	<li>Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby usunąć jajniki i umieść je w gazowym medium M2 z milinonem.</li>
	<li>Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby usunąć cały tłuszcz i inne tkanki (w tym kaletkę) z jajników. Użyj igieł 25G, aby przerwać pęcherzyki antralne.</li>
	<li>Użyj pipety transferowej, aby rozprowadzić oocyty w M2 + milrynon w cienkiej warstwie w szalce Petriego o średnicy 100 mm, uważając, by ośrodek nie dotykał boków naczynia (Rysunek 2C).</li>
	<li>Użyj mikroskopu rozcinanego (powiększenie 25x - 50x), aby zobrazować oocyty GV (Rysunek 2F). Oocyty GV mogą być powiązane z komórkami kumulusowymi w kompleksie kumulato-oocytowym (COC). Usuwam komórki kroszyste poprzez powtarzające pipetowanie.</li>
	<li>Pobieranie oocytów GV za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami (średnica 100–150 μm; Rysunek 2A). Przenieś oocyty GV do kropli 20 μL M2 + milironu pokrytej lekkim olejem mineralnym (Rysunek 2C). Nie wkładaj więcej niż 30 oocytów do jednej kropli.</li>
	<li>Gdy wszystkie oocyty GV zostaną zebrane, należy je przepuścić przez dwie lub trzy krople po 20 μL M2+ milrynonu pokryte lekkim olejem mineralnym, aby usunąć komórki somatyczne.</li>
	<li>Przenieś oocyty GV (z jak najmniejszą ilością ośrodka) do kropli KSOM o pojemności 30 μL. Płucz milrynon, przechodząc oocyty przez pięć kropel KSOM (rysunek 2C).</li>
	<li>Przełóż wszystkie oocyty GV do kropli 20 μL KSOM nakładanych na lekki olej mineralny, maksymalnie 30 oocytów na kroplę KSOM (rysunek 2C). Umieść oocyty w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5%CO2).</li>
	<li>Inkubuj oocyty przez około 5 godzin. UWAGA: Przebicie GV (oznaczające zniknięcie otoczki jądrowej i wznowienie meiotyczne; Rysunek 2G) Zazwyczaj występuje po 2 godzinach w hodowli, ale tempo dojrzewania oocytów może się różnić w zależności od szczepu myszy lub stymulacji hormonalnej. Z naszego doświadczenia wynika, że łącznie 5 godzin w hodowli najlepiej optymalizuje rozprzestrzenianie się chiasmat w większości szczepów myszy. Jeśli pozostawiono zbyt długo dojrzewania, może nastąpić pierwszy podział mejotyczny i wytłoczenie ciała biegunowego (Rysunek 2H).</li>
	<li>Przelej 5 - 10 oocytów (z jak najmniejszą liczbą KSOM) do kropli 30 μL roztworu hipotonicznego (0,9 % cytryninu sodu w ultraczystym H2O). Inkubuj jajki w roztworze hipotonicznym przez 5–10 minut.</li>
	<li>Pipetą nałóż małą kroplę (~ 1 μL) zakwaszonej wody (8 kropel kwasu octowego lodowcowego w 50 mL ultraczystego H2O) na jeden z kwadratów przygotowanych preparatów (rysunek 2B).</li>
	<li>Użyj szklanej pipety o średnicy 100–150 μm, obsługiwanej ustnie, aby szybko przenieść jeden oocyt z ootu do zakwaszonej krople wody. Przenieś jak najmniej roztworu hipotonicznego z oocytem. Użyj tej samej pipety, aby usunąć część płynu, aż oocytum przyklei się do szkiełka. UWAGA: Objętość cieczy wokół oocytu jest krytyczna. Powinno być wystarczająco dużo płynu, aby oocyt nie wyschł przed utrwaleniem, ale nie na tyle, by oocyt nie mógł przykleić się do szkiełka.</li>
	<li>Szybko przełącz na szklaną pipetę o średnicy 150 μm. Dodaj jedną kroplę świeżego utrwalacza Carnoya (trzy części metanolu bezwzględnego na jedną część kwasu octowego lodowca) do oocytu. Pozwól utrwalacowi rozproszyć się po szkiełku. Oocyt powinien wydawać się mniej wyraźny i topnieć, gdy kwas z utrwalacza rozpuszcza zona pellucida i komórki pękają.</li>
	<li>Gdy przód utrwalacza zacznie się kurczyć, szybko dodaj 2-3 krople utrwalającego. Delikatnie dmuchnij w suwak, żeby przyspieszyć schnięcie.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.16 - 3.19 z dodatkowymi oocytami z roztworu hipotonicznym.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.15 - 3.20, aż wszystkie oocyty zostaną utrwalone. Sprawdź rozprzestrzenianie się chromosomów za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Gdy preparat całkowicie wyschnie na powietrzu, umieść go w słoiku do barwienia Coplin z 50 mL 4% Giemsa (v/v) w ddH2O. Preparat w Giemsa stosuje się przez 6 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz 3 razy przez 3 minuty w ddH2Ow temperaturze pokojowej. Pozwól zjeżdżalniom całkowicie wyschnąć.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę (~60 μL) Permount na szklaną pokrywę o wymiarach 60 mm x 24 mm No. 1.5. Zamontuj szkiełka, odwracając je na pokrywkach i starannie zacierając nadmiar płynów. Pozwól slajdom wyschnąć przez noc przed zdjęciem w 63x na brightfield.</li>
</ol>

Autor nie ma żadnych konfliktów do ujawnienia.

Oocyty ssaków są szczególnie podatne na błędy w porównaniu do plemników. Chociaż mniej wydajny punkt kontrolny zespołu wrzeciona (SAC) oocytu przyczynia się do tej podatności 14,52,53, Hassold i Hunt sugerują, że wielokrotne trafienia prowadzą do aneuploidii, przy czym defektowa rekombinacja jest głównym czynnikiem 54. Badania na ludziach łączą aneuploidię z niewystarczającą pewnością przejścia i nieoptym...

Mejoza to wyspecjalizowany podział komórkowy niezbędny do produkcji haploidalnych gamet. Podczas profazy I chromosomy homologiczne (każdy składający się z siostrzanych chromatyd połączonych przez kohezynę) muszą wykonywać trzy kluczowe zadania: 1) rozpoznać i sparować się nawzajem, 2) łączyć się poprzez utworzenie kompleksu synaptonemalnego (SC) między ich osiami bocznymi oraz 3) wymieniać DNA poprzez homologiczną rekombinację, co skutkuje krzyżowaniem (CO) między niesiostrzanymi chromatydami 1,2. Fizyczne połączenie wynikające z powstania crossovera, utrzymywane przez kohezynę, zapewnia prawidłową orientację i segregację chromosomów podczas metafazy I 3,4,5.
Profaza meiotyczna I składa się z pięciu etapów, z których każdy definiuje status synapsy6. W leptonemacie (greckie słowo na cienką nici) chromosomy kondensują się, gdy element osiowy (oznaczony SYCP3) formuje się wzdłuż osi chromosomów. Podczas zygonemy (połączonych nici) homologi zaczynają synaptyczne, gdy element poprzeczny SC (SYCP1) tworzy się między osiami7. W pachynemacie (grubej nici) chromosomy są synapsowane na całej swojej długości. SC następnie rozpada się podczas diplonemy (dwa wątki), pozostawiając homologi połączone tylko w miejscach przejścia (chiasmata). Chiasmaty są produktem homolognej rekombinacji, procesu zapoczątkowanego przez zaprogramowaną indukcję podwójnych przerw DNA (DSB). Spośród setek DSB tylko ~10% zostaje CO (CO). U myszy większość (90%-95%) tworzy się przez szlak CO klasy I ułatwiony przez MutLγ (MLH1-MLH3), a pozostałe CO powstają przez MUS81-EME1 przez szlak CO klasy II 8,9,10,11.
Parowanie, synapsa i rekombinacja to procesy ściśle regulowane i współzależne. Błędy zazwyczaj uruchamiają mechanizmy punktów kontrolnych, prowadząc do śmierci komórki. U kobiet utrata komórek rozrodczych spowodowana wczesnymi błędami profazy I może powodować przedwczesną niewydolność jajnika12,13, natomiast późne błędy (np. homologi nie tworzące CO, nieprawidłowe umiejscowienie COs lub przedwczesna utrata kohezyny) mogą prowadzić do błędnej segregacji chromosomów i aneuploidii. U ludzi błędy mejotyczne są główną przyczyną utraty ciąży i niepłodności. Samica mejoza jest szczególnie podatna na błędy. Około 20%-80% ludzkich komórek jajowych (w porównaniu do 2,5%-7% plemników) ma nieprawidłowe liczby chromosomów, z których większość wynika z błędów w pierwszym podziale meiotycznym 14,15,16,17. Chociaż wiek został uznany za największą przyczynę aneuploidii u matki, powód, dla którego oocyty są tak podatne na błędy, pozostaje niejasny.
Pomimo znaczenia zrozumienia czynników leżących u podstaw wysokich błędów w oocytach, większość naszej wiedzy na temat regulacji zdarzeń profazy I pochodzi z badań nad męską mejozą. Ponieważ niewielki fragment dorosłego materiału jądrowego dostarcza wystarczającej ilości materiału do oceny wszystkich stadiów komórek rozrodczych mejotów i postmejotycznych, mejoza męska od dawna jest łatwiej dostępna dla badaczy. Natomiast mejoza żeńska występuje w sposób nieciągły. U myszy profaza I postępuje półsynchronicznie w jajniku płodu, zaczynając około 14 dni po stosunku (DPC; Rysunek 1A), krótko po określeniu płci gonadalnej18, 19, 20. Około czasu narodzin oocyty wchodzą w zatrzymanie dyktyatu aż do owulacji po miesiącach (u myszy) lub dekadach (u ludzi)21, 22, 23 roku. W związku z tym specyficzne stadia profazy I są dostępne tylko w ograniczonych oknach rozwojowych (rysunek 1A), przy czym zdarzenia po profazie I występują tylko w kilku oocytach jednocześnie u młodocianych i dorosłych. Chociaż postęp techniczny poprawił badania nad mejozą jajek ssaków, metody te pozostają wymagające i czasochłonne w porównaniu z porównywalnymi metodami stosowanymi w badaniach mężczyzn.
Analiza mejotyczna żeńska jest dodatkowo skomplikowana przez ograniczenia w podetapowaniu oocytów pachytenowych – co jest kluczowe dla badania oznaczania i dojrzewania crossoverów. Badania u mężczyzn korzystają z dobrze scharakteryzowanej dynamiki parowania chromosomów płciowych oraz obecności wariantu histonowego, H1t, który służy jako markery dla wczesnej, średniej i późnej pachynema, 24,25,26. Jednak nie sformalizowano wiarygodnej metody subsetapowania oocytów pachytenowych w stadium.
Przedstawione protokoły ułatwiają kompleksową analizę synapsy i rekombinacji w jajkach myszy od wczesnej profazy I do metafazy I. Praca ta opiera się na klasycznych technikach rozprzestrzeniania chromosomów opracowanych przez Petersa i in.27 i Tarkowskiego28 oraz wcześniejszych udoskonaleniach tych metod przez Hunta29 oraz Suna i Cohena30. Protokół ten został opracowany, aby podkreślić: 1) wzbogacenie i identyfikację konkretnych podetapów profazy I, 2) maksymalizację liczby zastosowań na parę jajników płodu oraz 3) dokładne, dostępne metryki oceny defektów synaptycznych i rekombinacji od ognisk do skrzyżów.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Filtr Strzykawkowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHAR33SB</td><td>do produkcji pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Corning</td><td>46-034-CI&nbsp;</td><td>dla HEB</td></tr><tr><td>1 mL sterylna strzykawka z igłą 25 gauge 16 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-125&nbsp;</td><td>Za pęknięcie jajników</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-302&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteur z jednorazowego szkła borosilikatowego o rozmiarze 14,6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B&nbsp;</td><td>do produkcji pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>35 x 10 mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>40 mm x 0,45 mm #3 stalowe kołki do entomologii</td><td>Amazon</td><td>B0CSSPW5S7</td><td>do przypinania myszy płodowych do sekcji</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowiec</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>dla fiksatora Carnoya</td></tr><tr><td>Zespoły rurek aspiratorowych do skalibrowanych mikrokapilarnych pipet</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td>do produkcji pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>B.P.I. Watch Glass</td><td>NDS Technologies&nbsp;</td><td>1580-00</td><td>Alternatywnie można użyć talerza zarodka o wymiarach 30 mm x głębokości 12 mm (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-1</td><td>do regulacji pH HEB, PFA</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>dla ADB</td></tr><tr><td>Zbiornik CO2</td><td></td><td></td><td>dla inkubatora</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Corninga</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS294875X25</td><td>Długość x Szerokość 75 mm x 25 mm, matowa strona</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopu Corning, z jedną stroną matową, z drugiej strony</td><td>VWR</td><td>294875X25</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa szkło prostokątne. 60 x 24 mm, #1,5</td><td>VWR</td><td>48393-251</td><td></td></tr><tr><td>Misa do rozcinania</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>70540</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcjonujący</td><td></td><td></td><td>Każdy model standardowy</td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji, ostry końcówka, 4,5"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo drobne, ostre szczypce</td><td>VWR</td><td>76548-836</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Millipore Sigma</td><td>GS500-500</td><td>do barwienia rozprzestrzenień chiasmata</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy Barierowy Długopis PAP</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>Każdy standardowy model z technologią CO2 i wodnym szalem</td></tr><tr><td>Stacja robocza IVF</td><td>K-Systems</td><td></td><td>Każdy model z podgrzewanym blatem stołowym</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Kodak Photo-Flo 200</td><td>Zdjęcie BH & Wideo</td><td>1464510</td><td>dla washów ślizgowych</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>dla fiksatora Carnoya</td></tr><tr><td>Słoik do barwienia Coplin MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN17006201</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowiczki kozy</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>dla ADB</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, EM Grade, oczyszczony Prill</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>19200</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>for&nbsp; Do montażu slajdów do rozkładów chiasmata</td></tr><tr><td>ProLong szklany uchwyt antyfade z bejcą NucBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36985</td><td>do montażu preparatów immunobarwnych</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, średnica wewnętrzna: 0,125", średnica zewnętrzna: 0,25"</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td>do produkcji pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwęglanu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td>dla HEB, roztwór hipotoniczny</td></tr><tr><td>System barwienia na wysuwakach StainTray</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>71396-B</td><td>Do użytku jako komora nawilżająca. Trzeba używać czarnej pokrywki do barwienia immunofluorescencyjnego. Alternatywnie można wyłożyć dno nieprzezroczystego pudełka na slajdy lub naczynia z wilgociami papierowymi do użytku jako nawilżona komora&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki do striptizerów - 100</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-100</td><td>dla pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>Końcówki do striptizerów - 150</td><td>Cooper Surgical</td><td>MXL3-150</td><td>dla pipety sterowanej ustami</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Millipore Sigma</td><td>S-8501</td><td>dla HEB, hipotoniczny roztwór sacharozy</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>dla HEB</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100&nbsp;</td><td>dla PFA, ADB i Triton-PBS</td></tr><tr><td>Słoik do barwienia Coplin United Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17495A</td><td>Nieprzezroczysty biały plastik do mycia i blokowania szkiełek po dodaniu światłoczułych przeciwciał wtórnych</td></tr><tr><td>Szkiełka wklęsłe United Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>S139533</td><td>1,3 mm grubości, 2 odwierty</td></tr><tr><td>Vannas Microdissection Scissors 5mm proste</td><td>VWR</td><td>76457-358</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-2624-307</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zen Blue 3.11</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-myszy IgG, specyficzny dla fragmentów Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-546-071</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antykróliczy IgG, specyficzny dla fragmentów Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-546-046</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antyludzki IgG, Fc&gamma; specyficzne dla fragmentów</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>109-606-170</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea Pig IgG, fragment Fc Specific</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>106-605-008</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Świnka morska anty-MLH3 pAb</td><td></td><td></td><td>Wykonany na zamówienie z użyciem Thermo-Fishera, stosowany rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Świnka morska anty-SYCP1 pAb</td><td></td><td></td><td>od Christer H&ouml; &ouml; g (Kouznetsova i in. 2005), zastosowano rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Ludzki antycentromerowy protein pAb</td><td>Antibodies Inc.</td><td>15-234</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Mysz anty-MLH1 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Mysz anty-SYCP3 mAb</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Królik anty-HORMAD1 pAb</td><td>Proteintech</td><td>13917-1-AP</td><td>Zastosowano rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anty-MSH4 pAb</td><td>Abclonal</td><td>A8556</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anty-RAD51 pAb</td><td>Millipore</td><td>PC130</td><td>Zastosowano rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anty-SYCP3 pAb</td><td>Abcam</td><td>ab15093</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-myszy IgG, specyficzny dla fragmentów Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-296-071</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr><tr><td>Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antykróliczy IgG, specyficzny dla fragmentów Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-296-046</td><td>zastosowano rozcieńczenie 1:1 000</td></tr></tbody></table>

przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapsis and Recombination

Trzy kluczowe i współzależne procesy definiują profazę mejotyczną I: chromosomy homologiczne muszą się ze sobą sparować, białkowa struktura zwana kompleksem synaptonemalnym tworzy się, aby łączyć homologi (synapsis), a homologi przechodzą rekombinację, wzajemnie wymieniając materiał genetyczny w celu powstania krzyżowań (CO). Błędy w tych procesach mogą prowadzić do przedwczesnej niewydolności jajnika, aneuploidii, a ostatecznie do utraty ciąży i niepłodności. Rekombinacja meiotyczna jest szczególnie podatna na błędy w oocytach, gdzie ponad 7% ludzkich oocytów zawiera co najmniej jedną parę chromosomów bez krzyżowania, a od 20%-80% komórek jajowych do 2,5%-7% plemników to aneuploidy. Jednak nadal nie jest jasne, dlaczego błędy chromosomalne wykazują tak uderzające różnice płciowe. Niniejszy protokół opisuje metody przygotowania i analizy rozprzestrzeniania się chromosomów oocytu profazy I i metafazy I odpowiednio u myszy płodowych i młodocianych. Aby śledzić krytyczną dynamikę chromosomów w całej profazie meiotycznej I, protokół ten wykorzystuje barwienie immunofluorescencyjne typowych markerów dla rekombinacji mejotycznej (RAD51 dla przerw podwójnych nici, MSH4 dla pośrednich CO oraz MLH1/MLH3 do identyfikacji większości CO) i synapsy (SYCP3 dla osi chromosomów, SYCP1 dla obszarów synapsycznych oraz HORMAD1 dla obszarów asynaptycznych). Ponadto protokół ten wykorzystuje dojrzewanie in vitro pobranych oocytów do oceny liczby parowanych chromosomów (biwalentów) oraz całkowitej liczby krzyżowań (chiasmata) w metafazie I. Razem te techniki stanowią kompleksowe i ilościowe ramy do badania mechanizmów regulujących wczesną dynamikę chromosomów u mejozy żeńskiej.

Ocena defektów synaptycznych w komórkach podobnych do pachytenu Eksperyment ten ocenia defekty synaptyczne w oocytach pachytenowych oraz monitoruje postęp profazy I (Rysunek 3A). Immunobarwienie dla SYCP3 (osiowo/boczne elementy SC), SYCP1 (centralny element SC) oraz HORMAD1 (osie chromosomów niesynaptycznych/odsynapsowanych) umożliwiają zaawansowanie i ocenę synapsis. HORMAD1 współlokalizuje się z SYCP3 podczas zygonemy i diplonemy (prz...

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69803/69803fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69803/69803fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Three critical and interdependent processes define meiotic prophase I: homologous chromosomes must pair together, a proteinaceous structure called the ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odległość do płaszczyzny</td>
			<td>Prąd wiązki jonowej</td>
			<td>Regulacja przechylenia sceny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>> 3 μm</td>
			<td>30 kV / 0,5 nA</td>
			<td>+1° (powyżej) / −1° (poniżej)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2–3 μm</td>
			<td>30 kV / 0,3 nA</td>
			<td>+1° / −1°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1–2 μm</td>
			<td>30 kV / 0,1 nA</td>
			<td>±0.5°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5-1,0 μm</td>
			<td>30 kV / 50 pA</td>
			<td>±0.3°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td><0,5 μm</td>
			<td>30 kV / 50 pA</td>
			<td>±0.2°</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-oocytes-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.

Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

Naucz się przygotowywać rozprzestrzenianie chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji. Ta metoda umożliwia badaczom analizę struktur chromosomalnych in vivo.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Przeglądaj więcej filmów