Name: In vitro Intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Poznaj zaawansowaną metodę intraluminalnej infuzji żelowej do zachowania struktury i integralności molekularnej ludzkich tętnic oporowych. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę histologiczną i badanie ekspresji markerów naczyniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te zostały sfinansowane przez Wydział Badań Wewnętrznych w Narodowym Instytucie Alergii i Chorób Zakaźnych, projekt numer AI001150 dla HCA. Dziękujemy naszemu byłemu członkowi laboratorium, dr. Stevenowi Brooksowi, a także obecnym członkom laboratorium, Mohamedowi Ibrahimowi, Mary Jackson i Jianowi Wu z Sekcji Genomiki Funkcjonalnej Malarii, za pomoc w rejestrowaniu obrazów podczas procesu.

Przed przeprowadzeniem następujących eksperymentów upewnij się, że użycie ludzkich tkanek oraz następujące procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB). Pobranie tkanki mięśniowej od pacjentów poddawanych klinicznie wskazanym operacjom brzusznej w National Institutes of Health (NIH) Clinical Center przeprowadzono za zgodą Instytucjonalnej Rady Przeglądowej NIH (NCT01915225). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.
1. Materiały i wyposażenie
<ol>
	<li>Informacje o wszystkich odczynnikach i materiałach wymaganych dla tego protokołu można znaleźć w Tabeli Materiałów . Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach i stronach internetowych powiązanych z danymi dostawcami w razie potrzeby.</li>
</ol>
2. Zbieranie ludzkich tkanek umysłowych
<ol>
	<li>Zbieraj ludzkie tkanki umysłowe od zespołu chirurgicznego.</li>
	<li>Natychmiast umieścić tkanki w schłodzonym pojemniku na próbki zawierającym zimny bufor Krebs Henseleit (KH) (skład: 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 2,0 mM CaCl2 i 11,1 mM glukozy) na lodzie.</li>
	<li>Upewnij się, że chusteczki są całkowicie zanurzone w buforze, a następnie szczelnie zamknij pokrywkę.</li>
	<li>Przetransportuj tkanki w zamkniętym pojemniku na lodzie do laboratorium w ciągu 30 minut od pobrania, aby zapewnić ich żywotność. UWAGA: Pamiętaj, aby ustawić pH do 7,4 za pomocą NaOH podczas przygotowania buforu.</li>
</ol>
3. Mikroprzecięcie ludzkich tętnic o małym oporze
<ol>
	<li>Po przybyciu do laboratorium płucz tkanki omentalne zimnym buforem KH, aby usunąć nadmiar krwi.</li>
	<li>Wybierz fragment bardziej unaczynionego obszaru tkanki do rozwarstwienia w zimnym buforze w szalce Petriego na lodzie.</li>
	<li>Pod mikroskopem rozwarstwieniem zidentyfikować tętnice o małym oporze (100-300 μm średnicy) na podstawie ich położenia i wzoru rozgałęzienia.</li>
	<li>Ostrożnie izoluj zidentyfikowane tętnice od otaczających tkanek tłuszczowych i łącznych. Używając cienkich kleszczy i mikronożyczek, tnij i usuwaj otaczające tkanki bez uszkadzania tętnicy.</li>
	<li>Utrzymuj izolowane tętnice w zimnym buforze przez cały proces sekcji, aby utrzymać żywotność i zapobiec degradacji enzymatycznej. UWAGA: Przed sekcją upewnij się, że miejsce jest czyste. Sprawdź, czy skala obiektywu mikroskopu i/lub oprogramowanie kamery są prawidłowo skalibrowane, aby dokładnie mierzyć średnicę przy różnych powiększeniach. Zazwyczaj żyły są wyraźnie widoczne, a tętnice znajdują się tuż obok lub wokół żył. Ściany tętnic są grubsze niż ściany żył. Po odizolowaniu od otaczających tkanek tętnice zachowują swoją strukturę jako nienaruszone rury naczyniowe. Natomiast żyły mają cieńsze ściany, często wydają się jaśniejsze dzięki krwi w ich świetle i są bardziej delikatne po oddzieleniu od tkanki.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komory miografu hodowlanego
<ol>
	<li>Przygotuj komorę miografu hodowlowego z dwoma szklanymi kaniulami do kaniulowania i sprężania rozciętych tętnic.</li>
	<li>Przygotuj strzykawkę 5 mL z czystą rurką kapilarną i napełnij świeżym buforem KH. Podłącz rurkę do jednego końca kaniuli i napełnij KH, nie zostawiając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Napełnij komorę zimnym buforem i umieść na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę. UWAGA: Można użyć specjalnie wykonanej małej miseczki z dwoma kanylami, zaprojektowanej tak, by naśladować komorę myografu.</li>
</ol>
5. Kanulacja i ciśnienie tętnic
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś rozciętą tętnicę do komory myograficznej za pomocą drobnych kleszczy lub pipety transferowej o średnicy większej niż tętnica.</li>
	<li>Przygotuj cztery otwarte węzły za pomocą szwu nylonowego (11/0 szew, 7 warstw) i załóż po dwa na każdą kaniulę przed kaniulowaniem tętnicy.</li>
	<li>Kanyluj bliższy koniec tętnicy poprzez nałożenie go na szklaną kaniulę za pomocą cienkich kleszczy i zabezpieczenie dwoma nylonowymi szwami.</li>
	<li>Użyj bufora KH w strzykawce, aby delikatnie przepłukać tętnicę kanilowaną i usunąć resztki krwi.</li>
	<li>Kanyluj dalszy koniec tętnicy i zabezpiecz go w podobny sposób.</li>
	<li>Umieść komorę na jednostce miografu, która jest połączona z regulatorem ciśnienia i temperatury.</li>
	<li>Ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
	<li>Ustaw początkowe ciśnienie wewnątrzświetlne na 10 mmHg.</li>
	<li>Zwiększ ciśnienie wewnątrzświatłowe o 10 mmHg co 10 minut, aż osiągnie 60 mmHg. Upewnij się, że ciśnienie jest konsekwentnie utrzymywane za pomocą regulatora ciśnienia podłączonego do systemu miografu hodowlanego.</li>
	<li>Użyj mikropozycjonera, aby podłużnie wyprostować tętnicę pod ciśnieniem w razie potrzeby, aby długość przybliżyła do poziomu fizjologicznego.</li>
	<li>Uruchom MyoVIEW lub inne odpowiednie oprogramowanie na monitorze komputera, aby śledzić wewnętrzne i zewnętrzne średnice tętnic za pomocą zacisków cyfrowych.</li>
	<li>Pozwól tętnicy wyrównać się przez 45 minut, aby uzyskać stabilną średnicę, zapewniając zachowanie wymiarów fizjologicznych i tonu.</li>
	<li>Sprawdź żywotność tętnicy za pomocą środka skurczającego naczynia (np. 60 mM KCl lub fenylefryny) lub rozszerzającego naczynia (np. acetylocholina) i rejestruj zmiany średnicy tętnicy. UWAGA: Nadmierne naciskanie strzykawką może uszkodzić tętnicę, dlatego należy zachować ostrożność podczas płukania. Użyj minimalnego bufora i postępuj delikatnie. Alternatywnie, krew tętnicza może być wypłukana, używając bufora perfuzyjnego podczas uciśniania tętnicy. Tętnice mogą być sprężone przy 80 mmHg, a czas równowagi może wynosić do 1 godziny.</li>
</ol>
6. Fiksacja tętnic
<ol>
	<li>Po wyrównaniu równowagi utrwal tętnice luminalnie i abluminalnie przez noc za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny. Utrzymuj stałe ciśnienie 60 mmHg, aby proces utrwalania zachował integralność strukturalną ściany tętnicy i elementów komórkowych.</li>
	<li>Po utrwaleniu płucz tętnice luminalnie i abluminalnie PBS, aby usunąć resztki utrwalacza z tętnicy i komory. UWAGA: W zależności od celu badania i obszaru zainteresowania analizą, zamontowane naczynie może być fiksowane w obecności środków farmakologicznych, takich jak wazodylatator lub wasokonduktor. Na tym etapie tętnica może być przechowywana w PBS w temperaturze 4 °C do 48 godzin. Do naprawy tętnic można również użyć paradehydu 4%.</li>
</ol>
7. Przygotowanie żelu stabilizującego tkanki
<ol>
	<li>Upłynnij żel stabilizujący tkanki w tubce, podgrzewając go do 60 ± 5 °C przed użyciem.</li>
	<li>Umieść tubkę w temperaturze pokojowej (RT) na 3-5 minut, aby płynny żel obniżył temperaturę, a następnie umieść ją na bloku grzewczym w 40 °C, aby utrzymać płynny żel przez 10-15 minut.</li>
	<li>Użyj 3 mL sterylnej strzykawki podłączonej do rurki kapilarnej o długości 10-15 cali, aby pobrać płynny żel. Natychmiast przejdź do poniższych kroków infuzji. UWAGA: Żel można upłyniać różnymi metodami. Należy przestrzegać instrukcji producenta.</li>
</ol>
8. Wlew żelowy i osadzanie wewnątrzświatła
<ol>
	<li>Utrzymuj stałe tętnice w komorze z PBS w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Połącz dalszy koniec rurki kapilarnej wypełnionej płynnym żelem z bliższą kaniulą.</li>
	<li>Aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza przez lumen podczas infuzji żelu, odłącz bliższy koniec tętnicy od pierwszej kaniuli, aby wypuścić pęcherzyki powietrza i żel wypełnił kaniulę.</li>
	<li>Przymocuj tętnicę z powrotem na kaniulę i delikatnie wstrzyknij żel do lumen tętnicy aż wyjdzie z dalszej kaniuli.</li>
	<li>Natychmiast zamień PBS w komorze na równą objętość płynnego żelu, aby napełnić komorę do najwyższego poziomu.</li>
	<li>Pozwól komorze z tętnicami odpocząć w RT, odłączając jednostkę od regulatora temperatury na około 10 minut, aby żel mógł stwardnieć zarówno wewnątrz światła, jak i poza nim. Zapewnia to, że tętnica jest całkowicie osadzona w żelu, zachowując jej trójwymiarową strukturę.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy poluzuj nylonowe szwy i delikatnie wyciągnij kanniule z komory.</li>
	<li>Przełóż cały stwardniały żel zawierający tętnicę z komory do pojemnika wypełnionego 70% etanolem. Etanol służy jako roztwór utrzymujący, aby zachować próbkę do dalszego przetwarzania. UWAGA: Zawór trójdrożny ułatwia usuwanie pęcherzyków powietrza przed infuzją żelu. Utrwalenie żelu można potwierdzić, delikatnie dotykając żelu w komorze czystą końcówką pipety.</li>
</ol>
9. Histopatologia
<ol>
	<li>Przetnij tętnicę poprzecznie, będąc jeszcze w żelu, i umieść te próbki w maszynie do przetwarzania tkanek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Następnie osadz tkankę, tworząc blok parafinowy. Upewnij się, że próbki są osadzone "na końcu", tak aby przekroje poprzeczne były skierowane do dołu na bloku.</li>
	<li>Wycina się przekroje osiowe o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Przełóż wycięte fragmenty na samoprzylepne szkiełki.</li>
	<li>Piecz kawałki w temperaturze 60 °C przez godzinę, następnie odwoskuj ksylenem, a następnie nawodnij wodą z przelewem alkoholowym.</li>
	<li>Barwienie sekcji hematoksyliną i eozyną (HE) do rutynowej histopatologii oraz różnicowanie w 1% alkoholu kwasowego. Badanie fragmentów pod mikroskopem świetlnym za pomocą odpowiedniego mikroskopu i wykonywanie zdjęć kompatybilnym aparatem.</li>
</ol>
10. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Uzyskaj barwienie za pomocą zautomatyzowanego systemu z systemem detekcji rafinacji polimerów zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Rozwoskuj fragmenty tkanek w temperaturze 72 °C przez 30 sekund za pomocą roztworu dewaksowania, a następnie nawilżaj je za pomocą przemywaczy alkoholem stopniowanym i roztworem do mycia.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie epitopów indukowane ciepłom, podgrzewając fragmenty do 100 °C przez 20 minut w roztworze do pobierania epitopów nr 1 i nakładając blok nadtlenku przez 5 minut, aby schłodzić aktywność endogennej nadoksydazy.</li>
	<li>Stosuj pierwotne przeciwciała (np. anty-CD31 lub aktynę przeciwmięśniową dla mięśni gładkich) w odpowiednich stężeniach rozcieńczonych w rozcieńczalniku redukującym tło. Inkubuj fragmenty polimerem peroksydazy chrzanu przez 8 minut, a następnie koloruj je roztworem chromogenowym przez 10 minut. Przez 5 minut kontrbarwię hematoksyliną na szkiełkach.</li>
</ol>
11. Chromogeniczna hybrydyzacja in situ w RNASkopie
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie za pomocą zautomatyzowanego systemu z odpowiednim zestawem oraz zestawem do wykrywania polimerów refine red zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Piecz fragmenty przez 30 minut w temperaturze 60 °C, a następnie odwoskuj je przez 30 sekund w roztworze dewaxu podgrzanym do 72 °C.</li>
	<li>Nawilż tkanki za pomocą washów i roztworu do płukania etanolem.</li>
	<li>Traktuj przekroje roztworem do pobierania epitopów nr 2 przez 15 minut w temperaturze 95 °C, a następnie inkubuj je roztworem enzymatycznym przez 15 minut w 40 °C.</li>
	<li>Hybrydyduj próbki z odpowiednimi sondami RNASkopy dla genów docelowych.</li>
	<li>Użyj sondy genowej o średniej ekspresji (np. izomeraza petydyloprolina B), aby potwierdzić odpowiednią ilość i integralność RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+Roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: Roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3 Pt 2), 581-587 (2001).</li>
<li>Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+artery+remodelling+in+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Small artery remodelling in hypertension.</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 110 (1), 49-55 (2012).</li>
<li>Petrie, J. R., Guzik, T. J., Touyz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes%2C+hypertension%2C+and+cardiovascular+disease%3A+Clinical+insights+and+vascular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Diabetes, hypertension, and cardiovascular disease: Clinical insights and vascular mechanisms.</a> Can J Cardiol. 34 (5), 575-584 (2018).</li>
<li>Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+Mechanisms+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: Mechanisms and treatment.</a> Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).</li>
<li>Zieman, S. J., Melenovsky, V., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+pathophysiology%2C+and+therapy+of+arterial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, pathophysiology, and therapy of arterial stiffness.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (5), 932-943 (2005).</li>
<li>Bell, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructure+and+mechanics+of+human+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microstructure and mechanics of human resistance arteries.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 311 (6), H1560-H1568 (2016).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanical+properties+of+resistance+arteries+in+hypertension%3A+Role+of+adhesion+molecules+and+extracellular+matrix+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension: Role of adhesion molecules and extracellular matrix determinants.</a> Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).</li>
<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+and+its+abnormalities+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier and its abnormalities in cardiovascular disease.</a> Front Physiol. 6, 365(2015).</li>
<li>Gurina, T. S., Simms, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurina%2C+TS+%22Histology%2C+Staining%22">Histology, Staining</a>. , Statpearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).</li>
<li>Hillman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+clinical+and+biological+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Limitations of clinical and biological histology.</a> Med Hypotheses. 54 (4), 553-564 (2000).</li>
<li>Taylor, A. M., Bordoni, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+AM+%22Histology%2C+Blood+Vascular+System%22">Histology, Blood Vascular System</a>. , Statpearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).</li>
<li>Nolte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+correlation+of+2D+hard-tissue+histology+with+3D+microCT+scans+through+3C+printed+phantoms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatial correlation of 2D hard-tissue histology with 3D microCT scans through 3C printed phantoms.</a> Sci Rep. 13 (1), 18479(2023).</li>
<li>Taqi, S. A., Sami, S. A., Sami, L. B., Zaki, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+artifacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">A review of artifacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 22 (2), 279(2018).</li>
<li>Torii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+characterization+of+peripheral+arteries+in+subjects+with+abundant+risk+factors%3A+Correlating+imaging+with+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Histopathologic characterization of peripheral arteries in subjects with abundant risk factors: Correlating imaging with pathology.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 12 (8 Pt 1), 1501-1513 (2019).</li>
<li>Brooks, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+trait+and+alpha+thalassemia+increase+nos-dependent+vasodilation+of+human+arteries+through+disruption+of+endothelial+hemoglobin-enos+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sickle trait and alpha thalassemia increase nos-dependent vasodilation of human arteries through disruption of endothelial hemoglobin-enos interactions.</a> Circulation. 151 (1), 8-30 (2025).</li>
<li>Chatzizisis, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+shear+stress+in+the+natural+history+of+coronary+atherosclerosis+and+vascular+remodeling%3A+Molecular%2C+cellular%2C+and+vascular+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial shear stress in the natural history of coronary atherosclerosis and vascular remodeling: Molecular, cellular, and vascular behavior.</a> J Am Coll Cardiol. 49 (25), 2379-2393 (2007).</li>
<li>Li, S., Liu, S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+3D+printing+in+vascularized+organ+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioprint%22%5BJournal%5D)">Advances of 3D printing in vascularized organ construction.</a> Int J Bioprint. 8 (3), 588(2022).</li>
<li>Rengier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+based+on+imaging+data%3A+Review+of+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Comput+Assist+Radiol+Surg%22%5BJournal%5D)">3D printing based on imaging data: Review of medical applications.</a> Int J Comput Assist Radiol Surg. 5 (4), 335-341 (2010).</li>
<li>Solanki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+three+dimensional+coronary+artery+reconstruction+accuracy+when+computing+virtual+fractional+flow+reserve+from+invasive+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The importance of three dimensional coronary artery reconstruction accuracy when computing virtual fractional flow reserve from invasive angiography.</a> Sci Rep. 11 (1), 19694(2021).</li>
<li>Tucker, W. D., Arora, Y., Mahajan, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTucker%2C+WD+%22Anatomy%2C+Blood+Vessels%22">Anatomy, Blood Vessels</a>. , Statpearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).</li>
<li>Choi, J., Lee, E. J., Jang, W. B., Kwon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biocompatible+3D-printed+artificial+blood+vessels+through+multidimensional+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Development of biocompatible 3D-printed artificial blood vessels through multidimensional approaches.</a> J Funct Biomater. 14 (10), 497(2023).</li>
<li>De Graaf, M. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+fluidic+circuit+board+for+controlled+perfusion+of+3D+blood+vessels-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Multiplexed fluidic circuit board for controlled perfusion of 3D blood vessels-on-a-chip.</a> Lab Chip. 23 (1), 168-181 (2022).</li>
<li>Lapierre-Landry, M., Liu, Y., Bayat, M., Wilson, D. L., Jenkins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+labeling+for+3D+histology%3A+Segmenting+blood+vessels+without+a+vascular+contrast+agent+using+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Digital labeling for 3D histology: Segmenting blood vessels without a vascular contrast agent using deep learning.</a> Biomed Opt Express. 14 (6), 2416-2431 (2023).</li>
<li>Abdul Sisak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+near-infrared+organic+fluorescent+probe+for+broad+applications+for+blood+vessel+imaging+by+high-throughput+screening+via+3D-blood+vessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">A near-infrared organic fluorescent probe for broad applications for blood vessel imaging by high-throughput screening via 3D-blood vessel models.</a> Small Methods. 5 (8), e2100338(2021).</li>
<li>Yu, T., Yang, Q., Peng, B., Gu, Z., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid-on-a-chip%3A+Design%2C+imaging%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid-on-a-chip: Design, imaging, and analysis.</a> Angiogenesis. 27 (2), 147-172 (2024).</li>
</ol>

NIAID GenAI został użyty do stworzenia wstępnego konspektu i szkicu rękopisu, który został dokładnie napisany, przejrzany i zredagowany przez ludzkich autorów, aby zapewnić dokładność i spójność.

Postępy w obrazowaniu medycznym, technikach chirurgicznych i metodologiach badawczych poprawiły naszą wiedzę o architekturze naczyń 3D, rewolucjonizując diagnostykę, planowanie chirurgiczne i badania 17,18,19,20. Pomimo tych innowacji, zachowanie trójwymiarowej struktury izolowanych tętnic oporowych człowieka pozostaje wyzwaniem ze względu na ich delikatny i złożony charakter, co utrudnia izola...

Tętnice oporowe regulują przepływ krwi i ciśnienie oraz ulegają znaczącym zmianom w schorzeniach, takich jak nadciśnienie, cukrzyca i miażdżyca 1,2,3,4,5. Badanie tętnic oporowych u człowieka jest niezbędne do zrozumienia patologii układu sercowo-naczyniowego i opracowania terapii celowanych 6,7,8,9,10. Tradycyjne metody badania naczyń krwionośnych często prowadziły do powstawania artefaktów i utraty trójwymiarowej integralności 10,11,12,13,14,15. Aby złagodzić te ograniczenia, przedstawiamy innowacyjną metodę przygotowania izolowanych tętnic oporowych u człowieka poprzez wprowadzenie żelu do lumenu, zachowując tym samym ich przybliżoną strukturę ex vivo i/lub in vivo.
Ta technika infuzji żelowej wewnątrzświatła zachowuje naturalną architekturę tętnic, umożliwiając dokładniejsze odwzorowanie ich stanu fizjologicznego. Poprzez stabilizację struktury naczynia, metoda ta umożliwia szczegółowe badanie przebudowy tętnic, struktury komórkowej, mikrodomen, złączeń heterokomórkowych oraz ekspresji genów/białek w różnych warstwach komórkowych. Technika ta jest szczególnie korzystna przy badaniu specyficznych dla typu komórek składników zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym.
Technika ta została z powodzeniem zastosowana w naszym niedawnym badaniu16, co wykazało jej skuteczność w zachowaniu integralności strukturalnej i molekularnej tętnic oporowych u człowieka, ułatwiając zaawansowane obrazowanie i kompleksową analizę. Sukces tej aplikacji zainspirował nas do udokumentowania tego szczegółowego protokołu dla innych.
W tym artykule metodycznym opisujemy protokół przygotowania izolowanych tętnic oporowych u człowieka i infuzji ich biokompatybilnym żelem stabilizującym tkanki (Tissue Guard Gel). Tutaj opisujemy metodę eksperymentalną i ilustrujemy jej zastosowania w ocenie struktury tętnic oraz badaniu wzorców ekspresji genów i białek w różnych warstwach komórkowych. Dostarczając kompleksową i powtarzalną technikę przygotowania tętnic oporowych u człowieka, dążymy do rozwoju badań nad biologią sercowo-naczyniową, poprawy powtarzalności wyników oraz przyczynienia się do nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych.

<table><tbody><tr><td>1% Focus Acid Alcohol</td><td>StatLab</td><td>&nbsp; SL89-1</td><td></td></tr><tr><td>10% NBS</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800598</td><td></td></tr><tr><td>Kamera HDMI do mikroskopii 4K</td><td>Hitech Instruments, Inc.</td><td>HT-XP4K8MA</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał – redukcja tła</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany procesor tkanek&nbsp;</td><td>Leica Biosystems</td><td>HistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Dewax Bond</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odzyskiwania epitopów wiązanych 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9961</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie odzyskiwania epitopu wiązanego 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>Detekcja rafinacji polimeru wiązanego</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9800</td><td></td></tr><tr><td>Wykrywanie Czerwieni przez rafinację polimeru wiązanego</td><td>Leica Biosystems</td><td>DS9390</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Bond Wash (10x)</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kaniuli (szklany), 80 i pomiędzy nami; 100 &mu; m</td><td>DMT</td><td>Kod produktu: 300407</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Anteny do sekcji, duże (szkło pyrex), 93 mm</td><td>Instrumentacja systemów żywych</td><td>SKU: DD-90</td><td></td></tr><tr><td>Małe talerze do sekcji</td><td>Instrumentacja systemów żywych</td><td>SKU: DD-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcjonujący</td><td>Hitech Instruments, Inc.</td><td>ZEISS SteREO Discovery.V8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>Pozycja nr 11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5SF</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>Pozycja nr 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>EcoMount</td><td>BioCare Medical</td><td>EM897L</td><td></td></tr><tr><td>Eozyną</td><td>IHC World</td><td>IW-3100B</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksyliną</td><td>BioCare Medical</td><td>Cathe-MM</td><td></td></tr><tr><td>Kamera lądowania</td><td>Olyumpus</td><td>DP28</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop obrazujący</td><td>Olyumpus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Krebs Henseleit (z 2 mM chlorku wapnia)</td><td>Boston BioProducts, Inc.</td><td>SKU: C-10625N-200mL</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Krebs-Henseleit (bez wapnia)</td><td>Boston BioProducts, Inc.</td><td>SKU: C-9906W-200mL</td><td></td></tr><tr><td>Materiały montażowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Komora i jednostka myografowa</td><td>DMT</td><td>202/204CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PPIB</td><td>&nbsp; ACDBio</td><td>313908</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 LS Reagent Kit-RED</td><td>ACDBio</td><td>322150</td><td></td></tr><tr><td>Stainer</td><td>Leica</td><td>Zautomatyzowany system Leica Bond RX</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe kołki do rozcinania</td><td>Instrumentacja systemów żywych</td><td>SKU: PIN-0,1MM | PIN-0,2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast chirurgiczny</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Żel ochronny przed tkanką</td><td>StatLab</td><td>&nbsp; TissueGuard/SKU: TG12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2 mm</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>Pozycja nr 15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2,5 mm</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>Pozycja nr 15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 3 mm</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>Pozycja nr 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-SMA</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka

In Vitro Intraluminal Gel Infusion: An Advanced Approach for Microscopic Analysis of Human Resistance Arteries

Tętnice oporowe, w tym małe tętnice i tętnice, odgrywają kluczową rolę w regulacji ciśnienia krwi i przelewu tkanek. Dysfunkcja tych tętnic może prowadzić do różnych schorzeń sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie, miażdżyca i niewydolność serca, a także do schorzeń nerwowo-naczyniowych. Badanie tętnic oporowych u ludzi jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych oraz opracowania ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Niniejsze badanie przedstawia innowacyjną metodę przygotowania izolowanych tętnic oporowych człowieka poprzez wprowadzenie żelu stabilizującego tkanki do lumenu, zachowując ich naturalną architekturę i integralność komórkową. Pobrano ludzkie tkanki mentalne od pacjentów poddawanych operacjom jamy brzusznej, a małe tętnice oporowe (średnica 100-300 μm) zostały wyizolowane przez staranną mikro-sekcję. Tętnice były następnie kanylowane, sprężane w komorze miografu hodowlanego i fiksowane 10% neutralną formaliną buforowaną. Do światła tętnicy kanilowanej wprowadzono żel stabilizujący tkankę, który pozwolił się stwardnieć, aby zachować trójwymiarową strukturę. Przeprowadzono analizy histologiczne, immunohistochemiczne oraz ekspresję genów, aby ocenić zachowanie tętnic. Cięcia histologiczne ujawniły dobrze zachowaną integralność strukturalną i naturalną architekturę tętnic, zachowując wyraźnie zarysowane warstwy śródbłonka i mięśni gładkich. Barwienia immunohistochemiczne wykazały wyraźną lokalizację markerów takich jak CD31 i aktyna mięśni gładkich α. Hybrydyzacja in situ ujawniła specyficzne wzorce ekspresji genów, dostarczając wglądu w mechanizmy molekularne. Ta zaawansowana metoda infuzji żelowej wewnątrzświetlnej oferuje znaczące zalety, umożliwiając zaawansowane obrazowanie i kompleksową analizę struktury tętnic, remodelacji oraz interakcji komórkowych zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Ta metoda ma potencjał do poprawy diagnostyki klinicznej i strategii terapeutycznych chorób naczyń, stanowiąc tym samym cenne narzędzie do rozwoju badań nad biologią naczyniową.

Ludzkie tkanki mentalne zostały pobrane od pacjentów poddawanych klinicznie wskazanym operacjom jamy brzusznej. Małe tętnice oporowe (100-300 μm średnicy) zostały starannie odizolowane od otaczającej tkanki tłuszczowej i łącznej pod mikroskopem rozwarstwionym (rysunek 1A-C). Izolowane tętnice zostały oczyszczone, skutecznie kaniulowane i zamontowane na szklanych kaniulach w komorze miograficznej hodowli do ciśnienia (rysunek 1D-F</strong...

Przedstawiamy tutaj protokół zachowania architektury tętnic ludzkich poprzez wprowadzenie żelu stabilizującego tkanki do lumenu naczynia przed przecięciem w celu analizy molekularnej lub histologicznej.

In vitro Intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka

Resistance arteries, which include small arteries and arterioles, play essential roles in regulating blood pressure and tissue perfusion. Dysfunction in ...

Badania te udoskonalają metodę zachowania i analizy tętnic oporowych u człowieka, poprawiając wizualizację i molekularne wglądy. Ma potencjał do rozwoju diagnostyki i terapii w medycynie sercowo-naczyniowej. Niedawno odkryliśmy, że hemoglobina tetramerowa, składająca się zarówno z podjednostek alfa, jak i beta, reguluje uwalnianie tlenku azotu rozszerzającego naczynia z komórek śródbłonka naczyń ludzkich.Technika ta była kluczowa dla lokalizacji transkryptów alfa i beta globiny w warstwie komórek śródbłonka naczyniowego. Protokół ten skutecznie rozwiązuje wyzwanie zachowania strukturalnej i molekularnej architektury tętnic oporowych człowieka, ułatwiając lepszą analizę i zrozumienie schorzeń sercowo-naczyniowych. Na początek należy umieścić ludzkie tkanki umysłowe na lodzie podczas zabiegu.Odetnij kawałek widocznie unaczynionego obszaru tkanki i przenieś go do szalki Petriego z buforem Krebsa Henseleita na lodzie. Za pomocą mikroskopu sekcyjnego dokładnie odizoluj małe tętnice oporowe o średnicy od 100 do 300 mikrometrów. Oczyść tętnice z otaczającej tkanki tłuszczowej i usunąć krew z lumenu, nie uszkadzając tętnic.Przygotuj komorę miografową hodowli z dwoma szklanymi kaniulami do

in-vitro-intraluminal-gel-infusion-an-advanced-approach-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano preparację ex vivo do izolacji największych tętniczek oporowych mięśnia smukłego w celu badania zarówno reakcji naczyniowych na bodźce naczyniokurczące, jak i oceny podstawowych właściwości strukturalnych za pomocą pasywnej mechaniki ścian.

ex vivo Preparacja izolowanych szkieletowych mikronaczyń do badania reaktywności naczyniowej

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Opisujemy równoczesne testy mechaniczne i obrazowanie 3D ściany tętniczej izolowanych, żywych tętnic oporowych człowieka, a także analizy obrazów Fiji i Ilastik w celu ilościowego określenia organizacji przestrzennej elastyny i kolagenu oraz gęstości objętościowej. Omówiono wykorzystanie tych danych w modelach matematycznych mechaniki ścian tętnic.

Ocena mikroarchitektury zależnej od ciśnienia kolagenu i elastyny w żywych, ludzkich tętnicach oporowych za pomocą bezznacznikowej mikroskopii fluorescencyjnej

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Obrazy ultrasonograficzne in vivo cine pokazują ruch przekroju poprzecznego naczyń wieńcowych odpowiadający różnym warunkom obciążenia ciśnieniem. Opierając się na modelu elementów skończonych, zastosowano schemat iteracyjny w celu określenia specyficznych dla pacjenta właściwości mechanicznych tętnic wieńcowych in vivo, dopasowując ruch naczyń wieńcowych na podstawie modelu obliczeniowego i obrazów medycznych.

Wewnątrznaczyniowe podejście do modelowania elementów skończonych oparte na obrazach ultrasonograficznych do ilościowego określania in vivo właściwości mechanicznych ludzkiej tętnicy wieńcowej

Poznaj zaawansowaną metodę intraluminalnej infuzji żelowej do zachowania struktury i integralności molekularnej ludzkich tętnic oporowych. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę histologiczną i badanie ekspresji markerów naczyniowych.

In vitro Intraluminalna infuzja żelowa: zaawansowane podejście do mikroskopowej analizy tętnic oporowych człowieka

Przeglądaj więcej filmów