Name: Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj model myszy PDX nawrotu B-ALL do badania oporności leukocytów na chemioterapię. Ta metoda pozwala śledzić dynamiczną ewolucję oporności poza MRD i testować nowe terapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Centro Infantil Boldrini oraz wszystkim pacjentom, którzy przekazali swoje próbki do badania. Manuella M. Hoff otrzymała stypendium Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) od São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2024/03383-2). José A. Yunes otrzymał stypendium produktywności od National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Prace te były wspierane przez badania z brazylijskiego Ministerstwa Zdrowia w ramach programu PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

<ol><li>Hunger, S. P., Mullighan, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Lymphoblastic Leukemia in Children.</a> N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).</li>
<li>Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+treatments+for+pediatric+relapsed+or+refractory+acute+B-cell+lineage+lymphoblastic+leukemia%3A+Precision+medicine+era%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era.</a> Front Pediatr. 10, 923419(2022).</li>
<li>Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+relapse+in+paediatric+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia.</a> Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).</li>
<li>Inaba, H., Mullighan, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).</li>
<li>Mullighan, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+clonal+origins+of+relapsed+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia.</a> Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).</li>
<li>Turati, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+induces+canalization+of+cell+state+in+childhood+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).</li>
<li>Uckun, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+B-lineage+leukemic+cell+growth+in+SCID+mice%3A+a+Children%27s+Cancer+Group+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study.</a> Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+all+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mice+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+andrelapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Samuels, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-clinical+model+of+resistance+to+induction+therapy+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).</li>
<li>Alruwetei, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+treatment+responses+of+diagnostic+marrow+in+murine+xenografts+to+predict+relapse+in+children+with+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia.</a> Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).</li>
<li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+chemotherapy+modeling+with+RAG-based+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice.</a> PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).</li>
<li>Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCadena-Herrera%2C+D+%22Biotechnol+Rep%22">Biotechnol Rep</a>. 7, 9-16 (2015).</li>
<li>Liem, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+xenograft+models+for+the+preclinical+evaluation+of+new+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies.</a> Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).</li>
<li>Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview">https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview</a> (2017).</li>
<li>Randall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activity+of+the+second-generation+proteasome+inhibitor+ixazomib+against+pediatric+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts.</a> Exp Hematol. 132, 104176(2024).</li>
<li>Carbone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cervical+dislocation+as+a+humane+euthanasia+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). 
 <a target="_blank" href="https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes">https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes</a> (2008).</li>
<li>AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+cryopreservation+of+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Standardized cryopreservation of human primary cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+in+cancer+therapy%3A+Technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sig+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications.</a> Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).</li>
<li>Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+prospects+of+patient-derived+xenografts+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research.</a> Cancers. 15 (17), 4352(2023).</li>
<li>Duy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+induces+senescence-like+resilient+cells+capable+of+initiating+AML+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence.</a> Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zrozumienie biologicznych mechanizmów leżących u podstaw chorób nowotworowych jest kluczowe dla opracowania skuteczniejszych terapii i poprawy wyników leczenia pacjentów. W schorzeniach takich jak ostra białaczka limfoblastyczna u dzieci, te podejścia badawcze są nie tylko istotne dla zwiększenia wskaźników wyleczenia, ale także mają szczególną wartość dla pacjentów, u których standardowe leczenie osiągnęło granice intensywności i tolerancji terapeutycznej. W przypadku nawrotów i oporności na leczenie, problem ten nie mo...

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest najczęściej występującym nowotworem u dzieci. Pomimo wysokich wskaźników wyleczenia osiągniętych w ostatnich dekadach, przy 5-letnim przeżyciu sięgającym 90% w krajach o wysokich dochodach1 oraz dużych wysiłków na rzecz poszukiwania nowych strategii terapeutycznych, w krajach rozwiniętych 15%-20% pacjentów nawraca chorobę, a wskaźnik przeżycia waha się między 30%-60% w zależności od tego, czy pierwszy nawrót nastąpi wcześnie (poniżej 18 miesięcy) czy później (36 miesięcy) po diagnozie2, 3. W związku z tym refraktorny i nawrót WSZYSTKICH pozostają wyzwaniami do pokonania. Pod względem diagnozy refrakcyjne ALL różni się od nawrotu słabą wrażliwością na chemioterapię, natomiast nawrót ALL charakteryzuje się nawrotem choroby po okresie remisji. Podobnie jak w przypadku innych nowotworów, ALL charakteryzuje się nieprawidłowościami genetycznymi, w tym aneuploidiami, przekształceniami chromosomów oraz różnymi mutacjami genów powiązanymi z różnymi odpowiedziami terapeutycznymi i ryzykiem nawrotu4. Ponieważ WSZYSTKIE nawroty występują częściej u pacjentów wysokiego ryzyka – którzy już przeszli chemioterapię o maksymalnym intensywnym – dalsze korekty dawek lub kombinacji leków raczej nie będą wystarczające. Zamiast tego wysiłki muszą być skierowane na identyfikację mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki i nawrotów.
W związku z tym naukowcy próbowali zrozumieć, jak presja selekcyjna wywierana przez chemioterapię przyczynia się do powstawania komórek opornych. Większość istniejącej literatury przypisuje nawrót propagacji opornego złośliwego podklona, który był obecny już w momencie diagnozy5. Jednak niedawne badanie sugeruje istnienie alternatywnych mechanizmów, takich jak modyfikacje epigenetyczne regulujące programy transkrypcji, które również mogą przyczyniać się do nawrotu6.
Znaczne wysiłki zostały poświęcone stworzeniu dokładnych modeli in vivo do badania WSZYSTKICH nawrotów. Myszy z niedoborem odporności zostały skutecznie wykorzystane do WSZYSTKICH przeszczepów, zachowując oryginalne cechy choroby 7,8, co doprowadziło do opracowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Model ten umożliwia wszczepianie i proliferację oryginalnych komórek nowotworowych/białaczkowych w kompatybilnym mikrośrodowisku. Jedną z głównych zalet jest możliwość oceny odpowiedzi WSZYSTKICH przeszczepionych komórek na chemioterapię9.
Modele PDX były również wykorzystywane do naśladowania i badania WSZYSTKICH nawrotów. Na przykład protokół opracowany przez Samuelsa i in.10 wykorzystywał myszy nieotyłych diabetyków i ciężko niedoborowych (NOD/SCID) przeszczepionych z komórkami białaczki pacjenta do badania mechanizmów oporności na schemat chemioterapii podobnej do indukcji. Autorzy opisali leczenie winkrystyną, deksametazonem, L-asparaginazą i daunorubicyną (VXLD) oraz podali przykłady liczby cykli leczenia i czasu nawrotu. Model koncentrował się jednak na analizie komórek bezpośrednio po leczeniu – tych, które przetrwały początkową terapię – prawdopodobnie reprezentujących minimalną chorobę resztkową (MRD), a nie nawrót.
Nowsze badanie oceniało, czy krótkoterminowe leczenie CAŁKOWICIE przeszczepionym NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, czyli NSG) myszy niedoborne odpornościowe mogą przewidzieć nawrót u odpowiadających pacjentów.11. Wszystkie próbki o średnim ryzyku – zarówno od pacjentów nawracających, jak i nienawracających – zostały przeszczepione myszom i leczone schematem indukcyjnym składającym się z winkrystyny, deksametazonu i L-asparaginazy (VXL). Mierzono i porównywano czas do wszczepienia oraz nawroty po leczeniu. Wyniki sugerowały, że ten model PDX może służyć jako narzędzie prognostyczne do przewidywania wyników leczenia pacjentów. To odkrycie potwierdza przydatność modeli myszy PDX w badaniu biologii WSZYSTKICH nawrotów. Na przykład komórki nawracające mogły być badane w różnych momentach, aby odkryć mechanizmy leżące u podstaw nawrotu.
W tym manuskrypcie przedstawiamy ulepszenia modelu myszy PDX do badania nawrotu B-ALL. Naszym celem jest badanie nawrotów choroby oraz cech komórek nawrotu po ich ukształtowaniu przez chemioterapię indukcyjną. Standaryzowano czterolekowy program podobny do indukcji – winkrystynę, deksametazon, L-asparaginaza i daunorubycyna – z wykorzystaniem szczepu myszy NSG. Szczep ten ma ograniczenia w przetrwaniu powtarzających się cykli chemioterapii ze względu na mutację Prkdcscid oraz zwiększoną wrażliwość na stres genotoksyczny12. Dlatego masa ciała zwierzęcia była monitorowana jako wskaźnik toksyczności leczenia. Model nawrotu B-ALL można podzielić na trzy główne etapy: (1) przeszczepienie WSZYSTKICH komórek do myszy, z celem osiągnięcia progu wszczepienia na poziomie 0,2-1% ludzkich komórek CD45⁺ we krwi obwodowej; (2) 4 tygodnie leczenia chemioterapią, po którym następuje okres odpoczynku aż do pierwszego nawrotu (R1); oraz (3) po wykryciu R1, powtarzano tygodniowe cykle leczenia typu indukcji. Kolejne nawroty (R2, R3... RN) może wystąpić, a odstęp między leczeniem a nawrotem (Δt) jest rejestrowany. Stopniowe skracanie Δt interpretuje się jako oznakę nabytej oporności na leki. W ramach bardziej dogłębnych badań nad mechanizmami nawrotu, komórki B-ALL mogą być pobierane przed i po różnych etapach protokołu. Ważne jest, aby podkreślić, że w zależności od czasu między wystąpieniem nawrotu a powrotem do zdrowia komórek, mechanizmy tego zjawiska mogą nie być zachowane. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby komórki nawrotu były zbierane szybko po potwierdzeniu nawrotu. Zebrane komórki mogą być wykorzystywane do przyszłych analiz fenotypowych i genetycznych, w tym do oceny dynamiki cyklu komórkowego, migracji komórek, częstotliwości komórek inicjującej białaczkę, zmian chromosomowych oraz modyfikacji epigenetycznych, między innymi.
Na potrzeby tego artykułu skupimy się na opisie modelu nawrotu myszy. Szczegółowe informacje zostaną przedstawione dla trzech faz eksperymentalnych – transplantacji, leczenia do pierwszego nawrotu (R1) oraz cyklicznego leczenia do wielokrotnych nawrotów (R2, R3...). Mamy nadzieję, że ten model pozwoli naukowcom generować odporne na chemioterapię komórki B-ALL z różnych podtypów, umożliwiając głębsze badania zmian komórkowych i molekularnych związanych z nawrotem. Ostatecznie może to przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów oporności i ułatwić rozwój bardziej skutecznych i spersonalizowanych terapii.

<table><tbody><tr><td>1 mL&nbsp; strzykawka</td><td>BD&nbsp;</td><td>#309628</td><td>Pobieranie organów</td></tr><tr><td>10 mL sterylnej wody do wstrzykiwania</td><td>Halex Istar Ind&uacute; stria Farmaceutica LTDA</td><td>https://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/</td><td>Odbudowa leku</td></tr><tr><td>10X Roztwór Lizy RBC</td><td>BioLegend</td><td>#420302</td><td>Przetwarzanie próbek krwi myszy</td></tr><tr><td>Analizator komórek 5 kanałów</td><td>BD Biosciences</td><td>658226R1</td><td>Przepływowy cytometr &nbsp;</td></tr><tr><td>Sitnik komórek 70 uM</td><td>Falcom</td><td>#352350</td><td>Pobieranie organów</td></tr><tr><td>Acepromazyna maleat Inj&nbsp;</td><td>Vetnil LTDA</td><td>https://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1</td><td>Znieczulenie myszy</td></tr><tr><td>APC anty-human CD45 - izotyp myszy IgG1 - klon HI30</td><td>BioLegend</td><td>#304037</td><td>Zabarwienie limfocytów</td></tr><tr><td>Asparaginaza 10000 U</td><td>Aginaza/medac</td><td>#88660100</td><td>Leczenie myszy</td></tr><tr><td>Brilliant-Violet 605 anty-mysz CD45 - mysz izotypu IgG2 - klon 30-F11</td><td>BioLegend</td><td>#103139</td><td>Zabarwienie limfocytów</td></tr><tr><td>Daunorubycyna</td><td>Farmarin</td><td>#116880025</td><td>Leczenie myszy</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Ach&eacute;</td><td>#00000066</td><td>Leczenie myszy</td></tr><tr><td>Dimetylsulfoksyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#589569</td><td>Kriokonserwacja limfocytów</td></tr><tr><td>Igła jednorazowa - 0,60 x 25 mm (23G x 1' &rsquo;)</td><td>BD</td><td>#300388</td><td>Pobieranie organów</td></tr><tr><td>Esterylowy jednorazowy lancet &nbsp;</td><td>Yancheng Huida Medical Instruments&nbsp;</td><td>https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/</td><td>Zbieranie krwi myszy</td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminetetracetowy</td><td>Technologie życia</td><td>#15576-O28</td><td>Roztwór EDTA</td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Cultilab</td><td>#F083</td><td>Kriokonserwacja limfocytów</td></tr><tr><td>Analiza oprogramowania do cytometrii przepływowej - wersja 10.10.0</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy grafów i wykresów - wersja 9.5.1</td><td>Dotmatyka</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td>Wykresy i analiza</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z dołączoną igłą 1mL FX 12,7 mm x 0,33 mm</td><td>Descarpack</td><td>e0342101</td><td>Przeszczep myszy i podawanie leków</td></tr><tr><td>Ketamine Inj</td><td>Sespo Ind&uacute; stria e Com&eacute; rcio LTDA</td><td>https://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/</td><td>Znieczulenie myszy</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjna platforma chirurgiczna dla gryzoni</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>https://www.kentscientific.com/products/surgisuite/</td><td>Zabiegi chirurgiczne z myszy</td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD19 - mysz izotypowa IgG1 - klon HIB19</td><td>BioLegend</td><td>#302208</td><td>Zabarwienie limfocytów</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td>Rozwiązanie PBS</td></tr><tr><td>Dwubaziz fosforanu potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662-1KG</td><td>Rozwiązanie PBS</td></tr><tr><td>Odczynnik do izolacji limfocytów</td><td>Cytiva</td><td>#17-1440-02, paczka 6 & razy; 100&nbsp; Ml</td><td>Izolacja limfocytów od pobranych organów</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1kg</td><td>Rozwiązanie PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dibazowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td>Rozwiązanie PBS</td></tr><tr><td>Sterylne pęsety do anatomicznych sekcji - 12 cm ABC 0170</td><td>Lab L&iacute; Der</td><td>120</td><td>Procedury chirurgiczne na myszach</td></tr><tr><td>Nożyczki sterylne 12 cm - ABC 0321</td><td>Lab L&iacute; Der</td><td>136</td><td>Procedury chirurgiczne na myszach</td></tr><tr><td>Winkrystyna</td><td>Libbs</td><td>#7896094208483</td><td>Leczenie myszy</td></tr><tr><td>Xylazine Inj</td><td>Sespo Ind&uacute; stria e Com&eacute; rcio LTDA</td><td>https://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/</td><td>Znieczulenie myszy</td></tr></tbody></table>

model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Murine Model of Leukemia Relapse to Induction Chemotherapy for Acute Lymphoblastic Leukemia

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) to nowotwor niedojrzałych komórek prekursorowych limfoidalnych i jeden z najczęstszych nowotworów dziecięcych. Chociaż wskaźniki wyleczenia w pediatryce ALL zbliżają się do 90%, nawroty i oporność na leki pozostają wyzwaniami. W tym kontekście badanie biologii nowotworów in vivo jest niezbędne, a ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) z modelami myszy są szeroko stosowane do tego celu. Jednak PDX z próbek nawrotowych – lub porównywane z diagnostycznymi – nie oceniają w pełni mechanizmów inicjacji i postępu nawrotu. Protokół ten opiera się na generowaniu nawrotów pdx B-ALL u myszy, co pozwala na zbieranie komórek białaczkowych podczas procesu nabycia oporności na leki. Zwierzęta przeszczepione komórkami B-ALL PDX są leczone kombinacją czterech leków powszechnie stosowanych w terapii ALL, reprezentujących odrębne mechanizmy działania: deksametazon, winkrystyna, L-asparaginaza i daunorubicyna. Po czterotygodniowej fazie indukcji remisji zwierzęta są monitorowane pod kątem nawrotów podczas okresu odpoczynku. Cykl leczenia i nawrotu powtarza się, aż czas nawrotu się skraca, pełniąc rolę zastępczej dla zwiększonej oporności na leki in vivo. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw nawrotów i oporności, komórki białaczki są zbierane przed i po każdym cyklu leczenia w celu analizy fenotypowej i genetycznej. Aby zweryfikować model, przebadane były różne próbki ALL z dzieci, w tym zarówno osoby, które dobrze jak i słabo reagowały, oceniane na podstawie obecności blastocytów we krwi obwodowej po 7 dniach terapii kortykosteroidami oraz minimalnej choroby resztkowej (MRD) w dniach 15, 33 i 78/96. Wyniki obserwowane na myszach były zgodne z danymi pacjentów, potwierdzając dokładność modelu w naśladowaniu klinicznej odpowiedzi na chemioterapię. Takie podejście umożliwia dynamiczne badanie nawrotów i oporności na leki w B-ALL, wspierając badania mechanistyczne oraz rozwój nowych strategii terapeutycznych.

W kontekście naszych badań, próbki prekursorowych komórek B ALL zostały wybrane z dwóch grup pacjentów: jednej z nich wykazując pozytywną odpowiedź, co wynika z braku komórek białaczkowych w krwi obwodowej dnia 8 oraz braku pozostałych komórek białaczki w szpiku kostnym w dniach 15, 33 i 78/96. Druga grupa została utworzona przez ALL odpowiadające molekularnym podgrupom poprzednich, uzyskanych od pacjentów z słabą odpowiedzią kliniczną ocenianą przez Minimalną Resztkową Chorobę (MRD), jak...

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a neoplasm of immature lymphoid precursor cells and one of the most common childhood malignancies. Although cure ...

Nasze badania ustanawiają model nawrotu pdx B-ALL u myszy, aby zbadać, jak komórki białaczkowe nabywają oporność na leki. Mamy nadzieję odkryć mechanizmy prowadzące do nawrotów, które mogą kierować przyszłymi strategiami terapeutycznymi. Naszym głównym wyzwaniem jest brak układu odpornościowego u myszy NOD/SCID, co ogranicza interakcje białaczka-immunologia.Potencjalnym rozwiązaniem jest dostosowanie protokołu do usunięcia białaczki u immunokompetentnych gospodarzy. Nasze badanie zajmuje się lukami, nazywając badania komórek opornych na chemioterapię podczas leczenia in vivo, rejestrując dynamiczną ewolucję oporności wykraczającą poza MRD. Nasz protokół generuje ludzkie komórki oporne na AML u dzieci in vivo za pomocą modeli PDX, aby naśladować pełne cykle nawrotów klinicznych, umożliwiając dostęp do biologii nawrotów często nieosiągalnej przez systemy in vitro.Nasz model toruje drogę do badania genetycznych i epigenetycznych czynników nawrotów, wpływów mikrośrodowiskowych na oporność, specyficznej dla pacjenta żywotności oraz testowania nowych terapii, w tym immunoterapii, w leczeniu nawrotów B-ALL. Aby rozpocząć rozmrażanie kriokonserwowanych ostrych komórek białaczki limfoblastycznej, które zostały pobrane z szpiku kostnego pacjenta, aspirują do zachłaniania. Przełóż rozmrożoną próbkę do probówki wirówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj 14 mililitrów jałowego PBS, aby zmyć komórki z roztworu kriokonserwacji.Włóż probówkę do wirówki i obracaj w 300g przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki. Ponownie zawiesz osad komórkowy w sterylnym PBS, aby uzyskać około 5 do 10 milionów żywotnych komórek w 100 mikrolitrach dla każdego zwierzęcia.Przechowywać przygotowany roztwór przesadzeniowy na lodzie aż do przeszczepu. Do przeszczepu należy wybrać dwumiesięczne samce lub samice myszy NSG do przeszczepu białaczki. Umieść jedną mysz na raz w bezpiecznym i zatwierdzonym zabezpieczeniu, aby ogon pozostał na zewnątrz i łatwo dostępny do przeszczepienia.Teraz ustaw uwięzioną mysz 30 centymetrów od źródła światła podczerwonego, aby zapewnić prawidłowe rozszerzanie żył. Dostosuj czas naświetlania w zależności od mocy lampy, utrzymując ogon wystawiony na światło średniej mocy przez pięć minut. Następnie, używając strzykawki insulinowej z dołączoną igłą o wymiarach 12,7 na 0,33 milimetra, wstrzyknij 100 mikrolitrów roztworu przeszczepowego do żyły ogonowej.Po wstrzyknięciu umieść przeszczepioną mysz w określonym ośrodku wolnym od patogenów i pozwól jej odpocząć przez 15 dni. Zbierz zwierzę do pobrania krwi i mocno je unieruchom, trzymając za głowę. Prawą ręką nakłuj żyłę twarzową splotu podżuchwowego sterylnym, ostrym, jednorazowym lancetem.Pobrać 50 mikrolitrów krwi obwodowej od każdej myszy w probówce wirówki o pojemności 1,5 mililitra, zawierającej osiem mikrolitrów 50-milimolowego EDTA dwa tygodnie po szczepieniu. Po wymieszaniu pipetą podaj 50 mikrolitrów próbki do probówki cytometrii przepływowej. Przygotuj mieszankę przeciwciał składającą się z przeciwciał CD45 przeciw myszym, przeciwciała CD45, przeciwludzkich przeciwciał CD19 oraz bezpłodnego PBS jako rozcieńczalnika.Dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał do każdej próbki krwi i delikatnie stuknij rurkę palcem wskazującym, aby ujednolicić próbkę. Inkubuj próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Po umyciu komórek białaczki PBS, ponownie zawies je 200 mikrolitrami bezpłodnego PBS, delikatnie stukając palcem wskazującym w rurkę cytometryczną.Zastosowanie standardowych metod cytometrii przepływowej do określenia procentu ludzkich komórek CD45 pozytywnych we krwi obwodowej w porównaniu do myszy komórek CD45 dodatnich. Rozpocznij leczenie, gdy odsetek komórek z wynikiem CD45 w krwi obwodowej osiągnie medianę od 0,2% do 1%. Waż zwierzęta przeznaczone do leczenia i obliczaj arytmetyczną średnią wag, aby określić odpowiednią dawkę każdego leku dla danej grupy. Teraz ręcznie unieruchom zwierzątko lewą ręką, trzymając brzuszną część skierowaną do góry.Zlokalizuj dolny prawy kwadrant odwłoka. Za pomocą sterylnej, ostrej, jednorazowej igły do wstrzyknięcia wstrzyknij 100 mikrolitrów roztworu leku do prawego dolnego kwadrantu wewnątrzotrzewno-otrzewnej. Aby odzyskać komórki białaczkowe, użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety, aby wykonać małe nacięcie w skórze brzucha zwierzęcia i usunąć go.Wykonaj niewielkie nacięcie w otrzewnej i przedłuż nacięcie do pełnego dostępu do narządów brzusznych. Umieść śledzionę pod żołądkiem i ostrożnie ją usuń pęsetą. Umieść wyekstrahowaną śledzionę w pojemniku ze sterylnym PBS do dalszego przetwarzania.Przy pobieraniu kości udowej otwórz jamę otrzewną, aby uzyskać dostęp do tylnych nóg zwierzęcia i zlokalizować kość udową. Nożyczkami przetnij stawy łączące kość udową z miednicą oraz piszczelową i strzałkową, aby ją usunąć. Umieść pobrane ogniwa w rurze wirówki o pojemności 15 mililitrów i obróć się z ciśnieniem 420g przez 30 minut, używając wirnika typu swing-bucket bez przyspieszenia i hamulców, aby zachować separację faz.Używając sterylnej jednorazowej pipety Pasteura, ostrożnie usuń i wyrzuć górną fazę wodną. Za pomocą nowej, sterylnej, jednorazowej pipety Pasteura zbierz warstwę komórek białaczkowych, która uformowała się w nową rurkę wirówki o pojemności 15 milimetrów. Na koniec kriokonserwować izolowane komórki białaczkowe zgodnie ze standardowymi wytycznymi dotyczącymi kriokonserwacji hodowli komórkowych.W modelu mysim przeszczepionym komórkami białaczkowymi od pacjentów z dobrą reakcją, leczenie VXLD wywołało remisję. Jednak przy powtarzających się cyklach odstęp między remisją a nawrotem stopniowo się skracał, co wskazuje na oporność na leki. W modelu mysim przeszczepionym komórkami białaczkowymi od pacjentów słabo reagujących, leczenie VXLD nie wywołało remisji i spowolniło postęp choroby jedynie przez trzy tygodnie, zanim obciążenie białaczki przekroczyło dopuszczalne granice, wykazując refrakcję.W innej słabo reagującej białaczce leczenie VXLD tymczasowo wywołało remisję, ale nawrót nastąpił szybko po jednym tygodniu przerwy bez leczenia, co wskazuje na krótkotrwałą remisji leku.

murine-model-leukemia-relapse-to-induction-chemotherapy-for-acute

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Receptorowe kinazy tyrozynowe są ektopowo wyrażane w wielu nowotworach i zostały zidentyfikowane jako cele terapeutyczne w ostrej białaczce. W artykule opisano skuteczną strategię oceny przedklinicznej inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Ten protokół pokazuje wstrzyknięcie do żyły skroniowej w celu dostarczenia dożylnego komórek raka u dzieci noworodkom myszy, umożliwiając precyzyjne, możliwe do powtórzenia modelowanie wczesnych reakcji immunologicznych przeciwko rakiem. Metoda ta umożliwia ocenę wpływu interwencji, takich jak immunomodulacja czy terapia, kiedy są one zastosowane w okresie noworodkowym.

Model noworodka dożylnego przeszczepu do oceny działań odpornościowych we wczesnym okresie życia przeciwko komórkom nowotworowym

Poznaj model myszy PDX nawrotu B-ALL do badania oporności leukocytów na chemioterapię. Ta metoda pozwala śledzić dynamiczną ewolucję oporności poza MRD i testować nowe terapie.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Przeglądaj więcej filmów