Name: Przygotowanie oczu wieprzi do mikroskopii refleksyjnej konfokalnej w celu wizualizacji sieci włókien kolagenowych szklistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii refleksyjnej konfokalnej do wizualizacji sieci włókien kolagenowych ciała szklistego oka wieprza. Technika zachowuje naturalną strukturę tkanki, umożliwiając badanie przyczyn odwarstwienia siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant podstawowy Narodowych Instytutów Zdrowia EY014800; Nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, NY, dla Katedry Okulistyki i Nauk Wzrokowych Uniwersytetu Utah; NIH NEI K08 EY034549; Fundacja Szpitala Dziecięcego Podstawowego; Fundacja E. Matildy Ziegler; Dziękujemy dr Guillaume L. Hoareau i M. Austinowi Johnsonowi za oczy świńskie.

1. Przygotowanie i sekcja tkanek
UWAGA: Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W naszej instytucji nie wymagała się zgody Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użycia Instytucjonalnego na przeprowadzanie eksperymentów na oczach świń ex vivo .
<ol>
	<li>Zdobądź ex vivo ocze wieprzowe z zakładu przetwórstwa mięsa. Użyj oczu w ciągu 48 godzin od śmierci. UWAGA: Chociaż wygląd szklistości nie zmienia się wraz z dłuższym okresem pośmiertnym, siatkówka i naczyniówka ulegają degradacji, co prowadzi do rozpraszania się komórek i pigmentowanych zanieczyszczeń podczas sekcji. Te zanieczyszczenia mogą zakłócać obrazowanie i analizę światłowodów.</li>
	<li>Usuń nadmiar mięśni i tkanki łącznej z globusa.</li>
	<li>Trzybolcowy podstawę umieść na podstawie formy kostkowej, takiej jak bardzo duża silikonowa forma do kostek lodu (Rysunek 1A i Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść kulę na trójłobowym postumencie, tak aby limbus spoczywał na bolcach.</li>
	<li>Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 3%, dodając 3 g agarozy ogólnego przeznaczenia do 100 ml wody destylowanej, a następnie podgrzewając roztwór aż do rozpuszczenia. Gdy roztwór ostygnie do około 37 °C, wlej go do formy, aż oko zostanie zanurzone w agarozie. UWAGA: To osadzi oko w żelu agarozowym, aby ustabilizować oko podczas sekcji.</li>
	<li>Schłodzić kostkę agarozy przez co najmniej 4 godziny. UWAGA: Zwiększa to przyczepność żelu do oka i zapewnia, że oko pozostaje nieruchome podczas sekcji</li>
	<li>Po schłodzeniu wyjmij kostkę agarozy z formy. Następnie usuń podstawę z sześcianu (rysunek 1B).</li>
	<li>Zbuduj trójstronną ramę o tych samych wymiarach co kostka agarozy, używając kombinacji klocków Lego 1 x 8, talerzy i kafelków (Rysunek 3). UWAGA: To zabezpieczy kostkę na miejscu i zapewni przewodnik dla ostrza podczas sekcji. Wysokość ramki Lego zdecyduje o miejscu, w którym zostanie wycięte oko. Można to zobrazować za pomocą półprzezroczystego żelu agarozowego.</li>
	<li>Umieść schłodzony kostkę agarozy w ramce Lego. Trzymaj wysokoprofilowe mikrotomowe ostrze za krawędzie i wyrównuj je z górną częścią ramki Lego. Delikatnie naciskaj w dół na górze sześcianu i delikatnie przeciągaj ostrze mikrotomu tam i z powrotem przez całą kostkę i wbudowane oko (rysunek 1C). UWAGA: Tworzy to fragment tkanki oka osadzony w agaroze, nazywany "ocznym zasłoną".</li>
</ol>
2. Montaż próbki do obrazowania
<ol>
	<li>Używając ostrza mikrotomowego, przytnij około 1 mm agarozy z całej powierzchni przeciętej sześcianu (Rysunek 4A). UWAGA: Pozostawi to mały fragment oczka wystający ponad wyciętą powierzchnię kostki agarozy</li>
	<li>Użyj chusteczki chusteczkowej lub małej trójkątnej gąbki celulozowej, aby wysuszyć przeciętą powierzchnię kostki agarozy, szczególnie w pobliżu krawędzi oczka.</li>
	<li>Dodaj około jednej łyżeczki uniwersalnego silikonowego uszczelniacza do małej plastikowej torebki na kanapki i wytnij 3 mm otwór w jednym z dolnych rogów worka, aby uzyskać worek do uszczelniania silikonu.</li>
	<li>Używając worka do oszy, nałóż cienką kropelkę silikonu na wyciętą powierzchnię kostki agarozy, tuż wzdłuż krawędzi oczka, tworząc wodoodporną ramkę wokół próbki (Rysunek 4B). To zapobiegnie wyciekowi żelu szklistego z nasadki oczu.</li>
	<li>Na nakładkę oczu załóż dużą szklankę z pokrywką i naciśnij tak, aby wycięta powierzchnia nakładki stykała się z pokrywką bez zatrzymania powietrza lub płynu (Rysunek 4C). Upewnij się, że silikonowa kulka tworzy ciągłe uszczelnienie z pokrywką. UWAGA: Jeśli silikonowa masa uszczelniająca nie tworzy ciągłego uszczelnienia, płyn szklisty może wyciekać i umożliwić przedostanie się powietrza do próbki. Ekspozycja na powietrze powoduje kurczenie się ciała szklistego, co skutkuje jaśniejszymi i gęstszymi włóknami, a także powstaniem obszaru bez włókien ciekłych. Jeśli ciało szkliste nie styka się z pokrywką, trudno będzie ją zobrazować.</li>
	<li>Trzymając kostkę agarozy, odwróć próbkę i umieść ją na dużym adapterze pokrywającym do obrazowania na odwróconym mikroskopie (Rysunek 4D i Rysunek 5).</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego, który nie jest typem obrotowego dysku. Użyj obiektywu wodnego (z wodą lub żelem smarującym do oka jako sprzęgacza) lub obiektywu olejowego o co najmniej 0,90 aperturze numerycznej, powiększeniu od 30x-60x oraz odległości roboczej co najmniej 200 μm.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia ścieżki światła w mikroskopie konfokalnym, aby uzyskać obrazy o odbiciu. Zamiast lustra dichroicznego używanego do przekierowywania wzbudzonego światła i przepuszczania emitowanego światła do obrazowania fluorescencyjnego, należy zapewnić lustro rozdzielające wiązkę, które przekierowuje część lasera oświetlającego i przepuszcza część światła odbitego. UWAGA: Sygnał odbicia z włókien kolagenowych szklistych jest dość słaby, więc szum tła może wpływać na zdolność obrazowania włókien. Zaobserwowano poprawę stosunku sygnału do szumu przy długości fali 473 nm, ale udało nam się obrazować włókna kolagenowe szkliste o długościach fal od 405 nm do 635 nm.</li>
	<li>Ustaw długości fal detekcji tak, aby uwzględniały długość fali lasera oświetlającego.</li>
	<li>Aby zorientować pozycję Z w próbce, zmniejsz moc lasera do najniższego możliwego ustawienia i zidentyfikuj błysk światła odbitego z pokrywy pokrywowej. Będzie to możliwe na dole i na górze slipu (rysunek 6). UWAGA: W pobliżu pokrywy znajduje się znaczny sygnał odbijający w tle. Z dala od slipu pokrywy sygnał odbitego światła od włókien kolagenowych maleje.</li>
	<li>Ustawij pozycję z tak, aby znajdowała się powyżej górnej części slipu i wewnątrz próbki.</li>
	<li>Zwiększ moc lasera do poziomu wyższego niż zwykle stosowany w aplikacjach fluorescencyjnych. UWAGA: W centrum pola obrazowania znajduje się artefakt pierścienia odbijającego. Połączenie powiększenia i odśrodkowania pola obrazowania może pomóc wykluczyć ten artefakt (rysunek 7).</li>
	<li>Stosuj uśrednianie liniowe i wydłuż czas zatrzymania pikseli w ustawieniach akwizycji obrazu, które są standardowymi metodami zwiększania stosunku sygnału do szumu w mikroskopach konfokalnych.</li>
</ol>
4. Analiza obrazów szerokości światłowodu z użyciem CT-FIRE 14
<ol>
	<li>Zainstaluj CT Fire zgodnie z instrukcjami na tej stronie: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF). UWAGA: Wersje użyte tutaj to "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" oraz środowisko uruchomieniowe MATLAB "MCR-2018b-win64". Oba muszą być pobrane, aby oprogramowanie działało.</li>
	<li>Przekonwertuj obrazy na 8-bitowe tif i otwórz 8-bitowe tif w CT-FIRE.</li>
	<li>Upewnij się, że oprogramowanie jest ustawione na CT-Fire w prawym górnym rogu, a następnie wybierz Uruchom.</li>
	<li>CT-FIRE automatycznie przesyła wyniki analizy do folderu o nazwie "ctfireout", znajdującego się w tym samym folderze co oryginalny obraz. Sprawdź jakość wyodrębnienia, porównując plik zaczynający się od nazwy "OL_ctFIRE" z oryginalnym obrazem. Aby stosować ten protokół, należy stosować domyślne ustawienia segmentacji obrazu (czyli identyfikację światłowodów): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen: 15<ol>
		<li>Jeśli światłowody nie są dokładnie zidentyfikowane, dostosuj parametry, klikając przycisk Aktualizuj w sekcji parametrów w prawym górnym rogu. UWAGA: Wytyczne dotyczące regulacji parametrów można znaleźć na stronie 20 w sekcji "3 Notatki" podręcznika CT-FIRE, który znajduje się w folderze aplikacji CTFIRE. Dodatkowe wskazówki można znaleźć w artykule Liu i in. w sekcji 3.5.215.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj ustawienia wyjściowe, aby ograniczyć liczbę światłowodów widocznych na obrazach wyjściowych. Aby stosować ten protokół, należy stosować domyślne ustawienia: Minimalna długość światłowodu [pikseli]: 30; Rozdzielczość obrazu [dpi]: 300; Szerokość linii światłowodowej [0-2]: 0,5; Maksymalna szerokość światłowodu [pikseli]: 15</li>
	<li>Aby przeliczyć jednostki szerokości z piksela na μm, otwórz oryginalny obraz na Fidżi. Użyj wymiarów obrazu występującego w obu pikselach oraz μm w lewym górnym rogu okna wyświetlacza, aby obliczyć stosunek.</li>
</ol>
5. Analiza obrazów gęstości włókna, krzywizny, wyrównania, lakunarności, jednostki wzrostu strzępek oraz wymiaru fraktalnego z wykorzystaniem TWOMBLI16
<ol>
	<li>Pobierz TWOMBLI z https://github.com/wershofe/TWOMBLI.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku: TwombliDocumentation w sekcji "Installation and dependencies".</li>
	<li>Otwórz folder TWOMBLI_v1/programs i zastąp AnamorfProperties.xml plik AnamorfPropertiesEH.xml plikiem (Plik Uzupełniający 1).</li>
	<li>W folderze TWOMBLI_v1/programs zastąp plik Twombli_v1.ijm na Twombli_v2.ijm (Supplemental File 2).</li>
	<li>Stwórz folder z pustymi folderami o nazwach "test HDM", "test masks", "HDM" i "masks".</li>
	<li>Przekonwertuj obrazy na 8-bitowy tif.</li>
	<li>Włóż 3-5 obrazów do folderu "test set input".</li>
	<li>Umieść wszystkie obrazy do analizy w jednym folderze bez podfolderów o nazwie "elybilable".</li>
	<li>Na Fidżi kliknij Wtyczki | Makra | Run | wybierz Twombli_v2.ijm w twombli/Programs.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby uruchomić TWOMBLI. Aby stosować ten protokół, należy stosować następujące parametry: Nasycenie kontrastu, 0,35; Minimalna szerokość linii, 3; Maksymalna szerokość linii, 3; Minimalne okno krzywizny, 40; Okno maksymalnej krzywizny, 40; Minimalna długość gałęzi, 10; Maksymalny wyświetlacz HDM, 100; Minimalna średnica szczeliny, 0 UWAGA: Parametry obrazów mogą wymagać korekty. Oprogramowanie poprowadzi użytkownika przez wybór parametrów, a dodatkowe instrukcje można znaleźć w pliku TwombliDocumentation.docx, który dołączony do programu.</li>
</ol>

<ol><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+and+vision+degrading+myodesopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vitreous and vision degrading myodesopsia.</a> Prog Retin Eye Res. 79, 100847(2020).</li>
<li>Phillips, J. D., Hwang, E. S., Morgan, D. J., Creveling, C. J., Coats, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanics+of+the+vitreoretinal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanics of the vitreoretinal interface.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 134, 105399(2022).</li>
<li>Seider, M. I., Conell, C., Melles, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+acute+posterior+vitreous+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Complications of acute posterior vitreous detachment.</a> Ophthalmology. 129 (1), 67-72 (2022).</li>
<li>Ketkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreomacular+traction+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Vitreomacular traction - a review.</a> Eye. 39 (4), 710-717 (2025).</li>
<li>Filas, B. A., Zhang, Q., Okamoto, R. J., Shui, Y. -B., Beebe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+degradation+identifies+components+responsible+for+the+structural+properties+of+the+vitreous+body%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic degradation identifies components responsible for the structural properties of the vitreous body.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 55(2014).</li>
<li>Taufalele, P. V., VanderBurgh, J. A., Muñoz, A., Zanotelli, M. R., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+alignment+drives+changes+in+architectural+and+mechanical+features+in+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fiber alignment drives changes in architectural and mechanical features in collagen matrices.</a> PLoS One. 14 (5), e0216537(2019).</li>
<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19 (3), 323-344 (2000).</li>
<li>Los, L. I., van Luyn, M. J. A., Nieuwenhuis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+rabbit+vitreous+body%3A+Lamellae%2C+Cloquet%27s+channel+and+a+novel+structure%2C+the+%27Alae+canalis+Cloqueti%27%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Organization of the rabbit vitreous body: Lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'Alae canalis Cloqueti'.</a> Exp Eye Res. 69 (3), 343-350 (1999).</li>
<li>Voytik-Harbin, S. L., Brightman, A. O., Waisner, B. Z., Robinson, J. P., Lamar, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestinal+submucosa%3A+A+tissue-derived+extracellular+matrix+that+promotes+tissue-specific+growth+and+differentiation+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Small intestinal submucosa: A tissue-derived extracellular matrix that promotes tissue-specific growth and differentiation of cells in vitro.</a> Tissue Eng. 4 (2), 157-174 (1998).</li>
<li>Bos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibril+organisation+in+mammalian+vitreous+by+freeze+etch%2Frotary+shadowing+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen fibril organisation in mammalian vitreous by freeze etch/rotary shadowing electron microscopy.</a> Micron. 32 (3), 301-306 (2001).</li>
<li>Bembridge, B. A., Crawford, G. N. C., Pirie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-contrast+microscopy+of+the+animal+vitreous+body%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Phase-contrast microscopy of the animal vitreous body.</a> Br J Ophthalmol. 36 (3), 131-142 (1952).</li>
<li>Filas, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+enzymatic+vitreolysis-induced+fiber+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of enzymatic vitreolysis-induced fiber remodeling.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8626-8637 (2014).</li>
<li>Los, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rabbit+as+an+animal+model+for+post-natal+vitreous+matrix+differentiation+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The rabbit as an animal model for post-natal vitreous matrix differentiation and degeneration.</a> Eye. 22 (10), 1223-1232 (2008).</li>
<li>Bredfeldt, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+segmentation+of+collagen+fibers+from+second-harmonic+generation+images+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 016007(2014).</li>
<li>Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+fibrillar+collagen+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying fibrillar collagen alignment.</a> Methods Mol Biol. 1627, 429-451 (2017).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> Life Sci Alliance. 4 (3), e202000880(2021).</li>
<li>François, J., Victoria-Troncoso, V., Albarran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+structure+of+the+vitreous+fibers+studied+by+phase-contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The histochemical structure of the vitreous fibers studied by phase-contrast microscopy.</a> Am J Ophthalmol. 69 (5), 763-773 (1970).</li>
<li>Hwang, E. S., Morgan, D. J., Sun, J., Hartnett, M. E., Toussaint, K. C., Coats, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+reflectance+microscopy+for+mapping+collagen+fiber+organization+in+the+vitreous+gel+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Confocal reflectance microscopy for mapping collagen fiber organization in the vitreous gel of the eye.</a> Biomed Opt Express. 14 (2), 932(2023).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+in+vitro+type+I+collagen+fibrillogenesis+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing in vitro type I collagen fibrillogenesis by transmission electron microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1627, 367-383 (2017).</li>
<li>Arevalo, R. C., Urbach, J. S., Blair, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+rheology+of+type+I+collagen+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Size-dependent rheology of type I collagen networks.</a> Biophys J. 99 (8), L65-L67 (2010).</li>
<li>Raub, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie zgłaszają istotnych konfliktów interesów.

Wcześniejsze metody obrazowania szklistości wykazały sztuczne agregowanie włókien13, utratę organizacji włókien, orientację i lokalizację17, lub polegały na znacznie wyższej rozdzielczości przy mniejszym polu widzenia, co ograniczało wgląd w rozmieszczenie światłowodu10. Mikroskopia refleksyjna konfokalna ex vivo, grubo przekrojona świeża tkanka zapewnia obrazy włókien kolagenu szklistego w skali mikronowej, zachowując naturalną organizację, orientac...

Ciało szkliste to zewnątrzkomórkowa macierz pomiędzy soczewką a siatkówką oka. Trakcja z ciała szklistego na siatkówkę odgrywa kluczową rolę w utracie wzroku w chorobach takich jak odwarstwienie siatkówki, otwór plamki żółtej oraz trakcja szklistaczka 1,2,3,4. Zdolność ciała szklistego do przenoszenia sił trakcyjnych na siatkówkę zależy od sztywności żelu, która z kolei zależy od właściwości głównych składników, kolagenui kwasu hialuronowego. Sztywność żelu ciała szklistego prawdopodobnie zależy od cech sieci włókien kolagenowych, ponieważ sztywność sztucznych żeli kolagenowych zależy od cech sieci, takich jak gęstość, wyrównanie i szerokość włókien6.
Sieć włókien kolagenowych szklistych jest trudna do obrazowania z powodu wysokiej zawartości wody i niskiego stężenia kolagenu7, co prowadzi do sztucznych zniekształceń podczas przetwarzania do mikroskopii lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Tradycyjna histologia i transmisyjna mikroskopia elektronowa wymagają obróbki w celu utwardzenia szklistości do cienkiego przekroju. Odwodnienie wymagane do osadzenia histologicznego powoduje, że włókna szkliste skupiają się w konfiguracji plastra miodu8, a powstawanie kryształów lodu podczas zamarzania zwiększa rozmiar porów w macierzy zewnątrzkomórkowej9. Na szkliście nałożono plastikowe osadzenie8 oraz szybkie zamrażanie10 , aby zminimalizować artefakty, choć prawdopodobnie pozostało coś pozostałego. Mikroskopia z kontrastem fazowym to metoda, która nie wymaga przekroju i została zastosowana na ciele szklistym, ale wymaga usunięcia niewielkiego kawałka szklistości z oka, tracąc tym samym pierwotną pozycję i orientację sieci11. Ostatnio mikroskopia ilościowego światła spolaryzowanego została wykorzystana do mapowania średniej orientacji włókien na grubo przeciętym oku wieprzowym, ale pojedynczych włókien nie udało się rozróżnić12. Dodatkowo, metody znakowania oparte na barwnikach (np. trypan blue, picrosirius red, 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceina) mogą wprowadzać artefakty lub niespecyficzne oznakowanie, dlatego unikano ich w celu zachowania natywnej sieci kolagenowej.
Zastosowaliśmy metodę przygotowania próbki stosowaną przez Filasa i in. do badań w mikroskopii światła spolaryzowanego, czyli rozwarstwienie brutkowego w blokuagarozowym 12, i obrazowaliśmy preparat za pomocą mikroskopii konfokalnej refleksyjnej, która wcześniej nie była stosowana na szklistości. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy obrazy sieci włókien kolagenowych szklistych w stanie nawodnionym, niemal fizjologicznym. Daje to kilka zalet w porównaniu z wcześniejszymi metodami, w tym mniejszą liczbę artefaktów w porównaniu z podejściami opartymi na zamarzaniu i łamaniu lub odwodnieniu10,13. Protokół ten wymaga odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem immersyjnym o co najmniej 30-krotnym powiększeniu, aperturą numeryczną większą niż 0,9 oraz zasięgiem roboczym większą niż 200 μm. Zawieramy kluczowe wskazówki dotyczące przygotowania próbki i pozyskiwania obrazów, aby ułatwić wyraźną rozdzielczość włókien. Utrzymując niemal naturalny stan matrycy kolagenowej szklistości, podejście to umożliwia naukowcom ilościową analizę orientacji włókien, gęstości oraz parametrów rozmieszczenia przestrzennego, które prawdopodobnie są kluczowe dla zrozumienia sztywności ciała szklistego i jej zmian patologicznych. Technika ta jest szczególnie odpowiednia dla badaczy zainteresowanych siecią kolagenu szklistego, jej strukturą oraz patogenezą chorób szklistych i orówek.

<table><tbody><tr><td>Agarose I</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Silikon uniwersalny – 1 uszczelnienie, przezroczyste</td><td>GE</td><td>2795576</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka celulozowa (Włócznia Weck-Cel Eye)</td><td>Beaver -Visitec</td><td>000865</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy podstawek z trzema bolcami&nbsp;</td><td>NIE</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy adapter do montażu dużych szyb pokrywających</td><td>NIE</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Duże szkło pokrywkowe, 1,42" x&nbsp; 2,36" nr 1</td><td>Ted Pella</td><td>260460-100</td><td></td></tr><tr><td>Lego (klasyczna podstawa, 1 x 8 kafelków, 1 x 8 klocków, 1 x 6 płyt)</td><td>Lego</td><td>11023, 3008, 3666, 4162</td><td></td></tr><tr><td>Łopatki mikrotomowe (wysoki profil)&nbsp;</td><td>Lieca Biosystems</td><td>14035838926</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy obiektyw Olympus UPlanSApo 30x</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td></td></tr><tr><td>Duża silikonowa tacka na kostki lodu (Samuelworld)</td><td>Amazonka</td><td>713243280060</td><td></td></tr><tr><td>chusteczki do chusteczek (Kimwipes) i nie wiadomo;</td><td>Kimberly Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie oczu wieprzi do mikroskopii refleksyjnej konfokalnej w celu wizualizacji sieci włókien kolagenowych szklistych

Preparing Porcine Eyes for Confocal Reflectance Microscopy to Visualize the Vitreous Collagen Fiber Network

Szkło szkliste to przezroczysty żel, który wypełnia przestrzeń między soczewką a siatkówką. Jego strukturę wspiera sieć włókien kolagenowych, co prawdopodobnie wpływa na właściwości lepkoelastyczne i przyczynia się do chorób siatkówki. Jednak organizacja tej sieci kolagenowej pozostaje słabo scharakteryzowana, ponieważ obrazowanie ciała szklistego w stanie natywnym jest trudne. Wiele technik obrazowania stosowanych na ciałie szklistym powoduje odwodnienie i zniekształcenia, a metody oparte na barwnikach mogą wprowadzać artefakty lub niespecyficzne oznakowanie, co utrudnia badanie sieci kolagenowej. W tym protokole przedstawiamy: 1) metodę rozcinania oczu wieprzi do obrazowania; 2) strategię montażu oczu na odwróconym mikroskopie; 3) wytyczne dotyczące obrazowania sieci kolagenowej szklistej w jej pierwotnym stanie za pomocą mikroskopii konfokalnej; oraz 4) instrukcje dotyczące ilościowej analizy obrazów cech sieci. Podkreślamy typowe pułapki i podkreślamy kluczowe kwestie techniczne. Raportujemy zastosowanie mikroskopii refleksyjnej konfokalnej na ciało szkliste. W porównaniu z wcześniejszymi strategiami obrazowania szklistego, to podejście zachowuje naturalną strukturę, orientację i rozmieszczenie włókien kolagenowych szklistych bez egzogennych barwników czy artefaktów odwodnienia. Mikroskopia refleksyjna konfokalna może badać strukturalne podstawy sztywności żelu szklistego w zdrowiu i chorobie.

Po jednym oku każdego z trzech młodych dorosłych świń (4-miesięcznej samicy, 5-miesięcznego samca i 6-miesięcznej samicy) sfotografowano po przecięciu oka w płaszczyźnie osiowej przez dolną limbusę. Uzyskano sześć lokalizacji obrazowania w płaszczyźnie przekroju X-Y, oddalonych od siebie o 4 mm. W każdym miejscu obrazowania uzyskano ciągłą siatkę 4 x 4 obrazów o wymiarach 70 μm x 70 μm (rysunek 8). Dla każdego świnia każdy obraz był analizowany osobno pod kątem kilku parametrów (Tabe...

Metoda ta wizualizuje rodzimą strukturę włókien kolagenowych w ciele szklistym za pomocą mikroskopii konfokalnej refleksji.

Przygotowanie oczu wieprzi do mikroskopii refleksyjnej konfokalnej w celu wizualizacji sieci włókien kolagenowych szklistych

The vitreous is a clear gel that fills the space between the lens and retina. Its structure is supported by a network of collagen fibers, which likely ...

Zmiany w kości szklistej prowadzą do odwarstwienia siatkówki. Uważamy, że zmiany w sieci włókien szklistych wpływają na sztywność żelu, powodując ogniskową przyczepność siatkówki. Trudno wyobrazić sobie ciało szkliste.Tradycyjna histologia powoduje kurczenie się, utratę i powstawanie artefaktu plastra miodu, ponieważ szkło to ponad 98% wody. Większość tkanek ma mniej niż 80% wody. Nasza metoda obrazowania zachowuje naturalny układ włókien kolagenowych w ciele szklistym, ponieważ wymaga ono minimalnego przetwarzania, a jedynie rażącego rozwarstwienia.Mamy nadzieję, że ta strategia pozwoli nam odkryć źródło odwarstwienia siatkówki i zapewnić skuteczniejsze sposoby zapobiegania temu. Na początek zdobądź ex vivo ocze wieprzowinkowe z zakładu przetwórstwa mięsa. Używając nożyczek do cięcia lub łyszczy, usuń nadmiar mięśni i tkanki łącznej z globusa.Teraz umieść trójzębny podstawę u podstawy formy kostkowej, na przykład dużą silikonową formę do kostek lodu, i umieść kulę na postumencie, upewniając się, że limbus pewnie opiera się na bolcach. Następnie przygotuj żel 3% agarozy, dodając trzy gramy agarozy ogólnego przeznaczenia do 100 mililitrów wody destylowanej i podgrzej mieszankę aż do całkowitego rozpuszczenia. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do około 37 stopni Celsjusza i wlej go do formy, aż kula kula będzie całkowicie zanurzona.Włóż kostkę agarozy do lodówki i schłodzić przez co najmniej cztery godziny. Po schłodzeniu wyjmij stwardniałą kostkę agarozy z formy i ostrożnie usuń podstawę od podstawy kostki. Zbuduj trójstronną ramę o wymiarach kostki agarozy, używając klocków, talerzy i kafelków LEGO o wymiarach jeden na osiem.Następnie umieść schłodzoną kostkę agarozy w ramie LEGO. Trzymaj wysokoprofilowe ostrze mikrotomu za krawędzie i wyrównuj je z górną częścią ramy LEGO. Delikatnie naciskaj w dół i przeciągaj ostrze tam i z powrotem przez całą kostkę i osadzoną kulę.Używając ostrza mikrotomowego, przytnij około jednego milimetra agarozy z całej powierzchni wyciętej sześcianu. Użyj chusteczki chusteczkowej lub małej trójkątnej gąbki celulozowej, aby delikatnie wysuszyć przeciętą powierzchnię kostki agarozy, skupiając się blisko krawędzi oczu. Teraz dodaj około jednej łyżeczki uniwersalnego silikonowego silikonu do małej plastikowej torebki na kanapki i wytnij otwór o średnicy trzech milimetrów w jednym z dolnych rogów worka, aby stworzyć prowizoryczną torbę do ciastek.Używając worka do ciastek, nałóż cienką kropelkę silikonowego uszczelniacza wzdłuż wyciętej powierzchni kostki agarozy, dokładnie wokół krawędzi oczka, aby uzyskać wodoodporną szczelkę. Upewnij się, że uszczelniacz tworzy pełną i ciągłą granicę, aby zapobiec wycieku żelu szklistego. Następnie załóż na nakładkę dużą szklankę typu slip i dociśnij ją, aż powierzchnia nachylki w pełni styka się ze szkłem.Upewnij się, że silikonowa fuga tworzy nieprzerwane uszczelnienie dzięki slipowi pokrywy. Następnie, trzymając kostkę agarozy, odwróć próbkę i umieść ją na dużym adapterze pokrywającym odpowiednim do obrazowania na odwróconym mikroskopie. Używaj odwróconego mikroskopu konfokalnego, który nie jest typu obrotowego dysku.Wybierz obiektyw olejowy do obrazowania. Dostosuj ustawienia ścieżki światła na mikroskopie konfokalnym, aby uzyskać obrazy o odbiciu. Zamień lustro dichroiczne na lustro rozdzielające wiązkę, które przekierowuje część lasera oświetlającego i przepuszcza część odbitego światła.Następnie ustaw długości fal detekcji tak, aby uwzględniały długość fali lasera oświetlającego. Aby zorientować pozycję Z w próbce, należy zmniejszyć moc lasera do najniższego możliwego ustawienia. Zidentyfikuj krótki błysk światła odbitego na górze i dole pokrywy, aby zaznaczyć granice pozycji Z.Zwiększ moc lasera do poziomu wyższego niż zwykle stosowany do obrazowania fluorescencyjnego. Na koniec, w ustawieniach akwizycji obrazu, aktywuj uśrednianie linii i wydłuż czas zatrzymania pikseli, aby poprawić stosunek sygnału do szumu i uzyskać obrazy. Po jednym oku u trzech młodych dorosłych świń sfotografowano po przecięciu oka w płaszczyźnie osiowej przez dolną limbus.Reprezentatywne obrazy konfokalnej refleksji wykazały wizualnie gęstsze sieci światłowodów u świń 1 i 2 w porównaniu do świń 3. Całkowita długość włókien szklistych na kafelek była podobna we wszystkich trzech świniach, co nie wskazuje na istotną różnicę w liczebności włókien, ale odsetek pikseli zajmowanych przez sygnał różnił się między nimi. Krzywizna włókien, czyli średnia przyrostowa zmiana kąta wzdłuż włókna, oraz lakunarność były podobne między trzema świnkami.Jednostka wzrostu strzępków zdefiniowana jako punkty rozgałęzienia na długość włókna była najwyższa u świni 3, różniąc się znacząco od świń 1 i 2.

preparing-porcine-eyes-for-confocal-reflectance-microscopy-to

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie pokazujemy sekcję przedniego odcinka oka świni, na którym znajduje się rogówka. Wyizolowany segment może być wykorzystany do hodowli narządów w celu zbadania patofizjologii chorób oczu.

Rozwarstwienie przedniego segmentu oka: metoda izolowania przedniego segmentu zawierającego rogówkę od oka świni

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Ta procedura demonstruje in vivo obrazowanie w bliskiej podczerwieni fluorescencji działań remodelujących kolagen u myszy, jak również barwienie ex vivo kolagenu w skrawkach tkanek za pomocą klatkowych peptydów mimetycznych kolagenu, które mogą być fotowyzwalane do hybrydyzacji ze zdenaturowanymi pasmami kolagenu.

Obrazowanie zdenaturowanych pasm kolagenu in vivo i ex vivo poprzez fotowyzwalaną hybrydyzację peptydów mimetycznych kolagenu w klatce

Celem tego protokołu jest pokazanie skutecznej techniki izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnych wyłuszczonych oczu świń.

Sekcja całego ciała szklistego do analizy witreodynamicznej

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Tutaj prezentowana jest łatwa do naśladowania metoda hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świni in vitro.

Pierwotna hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Ten protokół opisuje niezawodną metodę uzyskiwania wysokiej jakości kriosekcji całych oczu królika. Szczegółowo opisuje procedury sekcji, fiksacji, osadzania i cięcia oczu królika, które można łatwo dostosować do użycia w dowolnym badaniu wykorzystującym immunohistochemię w większych oczach.

Uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji całego oka królika

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj metodę mikroskopii refleksyjnej konfokalnej do wizualizacji sieci włókien kolagenowych ciała szklistego oka wieprza. Technika zachowuje naturalną strukturę tkanki, umożliwiając badanie przyczyn odwarstwienia siatkówki.

Przygotowanie oczu wieprzi do mikroskopii refleksyjnej konfokalnej w celu wizualizacji sieci włókien kolagenowych szklistych

Przeglądaj więcej filmów