Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4
14 listopada 2025
W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.
Interesuje nas szybkie i dokładne wykrycie więdnięcia Fusarium patogenu bananowego, znanego jako Foc TR4. Połączenie amplifikacji polimerazy rekombinazowej i CRISPR eliminuje użycie kosztownych maszyn i poprawia dokładność bieżących testów. Na początek przelej 250 miligramów każdego kawałka objawowego pseudostemu do osobnego woreczka ekstrakcyjnego.
Do każdego worka ekstrakcyjnego zawierającego materiał roślinny dodaj dwa mililitry roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 0,5 mola. Używając ręcznego młynka, takiego jak tłuczek, dokładnie zmiel zainfekowane naczynia wewnątrz worka ekstrakcyjnego. Następnie do probówki o pojemności 1,5 mililitra dodaj 195 mikrolitrów buforu Tris-HCl o pojemności 100 milimolarów przy pH 8.
Pipetą podaj pięć mikrolitrów ekstraktu roślinnego z worka ekstrakcyjnego do rurki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej bufor Tris-HCl, aby rozcieńczyć ekstrakt 40-krotnie. Rozkręć rurkę przez 15 do 30 sekund i przechowywać ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Korzystając z zestawu do transkrypcji RNA, dodaj podane składniki do rurki PCR o pojemności 0,2 mililitra.
Inkubuj przygotowaną probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej lub do aparatu PCR przez co najmniej cztery godziny. Teraz użyj spektrofotometru, aby ilościowo określić przepisane RNA. Rozcieńcz RNA do stężenia 250 nanogramów na mikrolitr w końcowej objętości 40 mikrolitrów przy użyciu wody wolnej od nukleazy.
Następnie poddaję próbce RNA DNazie, którą dołączyłem do zestawu do czyszczenia RNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie oczyść próbkę RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA. Użyj urządzenia NanoDrop, aby określić ilość i jakość oczyszczonego RNA CRISPR.
Następnie rozcieńcz RNA do 100 nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleazy. Następnie podgrzej RNA CRISPR zmieszane z barwnikiem RNA do 70 stopni Celsjusza przez 10 minut w kąpieli wodnej i przeprowadź próbkę na żelu 1,5% agarozy, aby zwizualizować RNA CRISPR za pomocą elektroforezy. Przygotuj 20 mikrolitrów mieszaniny reakcji Cas12a w osobnej probówce o pojemności 0,5 mililitra, używając podanych składników.
Następnie przygotuj 9,5 mikrolitra mieszaniny reakcji RPA w osobnej probówce o pojemności 0,5 mililitra z przedstawionymi tutaj składnikami. Włóż pasek z ośmioma probówek do stojaka na lodzie i przelej 20 mikrolitrów mieszaniny reakcji Cas12a do podstawy każdej probówki w pasku. Następnie przelej 9,5 mikrolitra mieszaniny reakcji RPA do pokrywki każdej probówki w pasku.
Dodaj 0,5 mikrolitra octana magnezu o stężeniu 280 nanomolowych do mieszanki RPA w pokrywce i mieszaj przez pipetowanie w górę i w dół. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra wody dejonizowanej do pokrywy rurki sterującej bez szablonu i ostrożnie ją zamknij, aby zapobiec mieszaniu się mieszanin reakcji RPA i Cas12a. Teraz dodaj 0,5 mikrolitra szablonowego DNA do 10 mikrolitrów mieszaniny reakcji RPA zawierającej octan magnezu w pokrywce paska probówki.
Wymieszaj zawartość, pipetując w górę i w dół. Ostrożnie zamykaj wszystkie pokrywki rurek, aby upewnić się, że mieszaniny reakcji RPA i Cas12a się nie mieszają. Następnie włącz przenośny fluorimetr i stwórz profil przebiegu do testu RPA Cas12a.
Otwórz zapisany profil biegu i umieść pasek rurki wewnątrz fluorymetru, aby inkubował przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wyjmij pasek z fluorymetru, odwróć rurkę sześć razy, aby wymieszać reakcje RPA i Cas12a, i krótko obróć pasek w mini wirówce przez pięć sekund. Następnie znowu złóż pasek rurki do fluorymetru i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, korzystając z zapisanego profilu biegu.
Interpretuj średnie względne jednostki fluorescencji mierzone na przenośnym fluorimetrze. Na koniec zwizualizuj lampy reakcyjne pod niebieskim światłem LED o długości fali wzbudzenia 465 nanometrów za pomocą transiluminatora niebieskiego światła i rejestruj obraz sygnału fluorescencyjnego za pomocą aparatu telefonu. Próbki pozytywne wykazały widoczną fluorescencję w przenośnym fluorimetrze Genie III po wykryciu DNA Foc TR4 przez RPA Cas12a, natomiast próbki negatywne wykazały niską fluorescencję końcową.
Pod niebieskim światłem LED probówki zawierające DNA z roślinnego materiału zakażonego Foc TR4 wykazywały widoczną fluorescencję, natomiast probówki z DNA z niezakażonej tkanki nie wykazywały fluorescencji. Opracowaliśmy pierwszy test wykorzystujący technologię CRISPR do wykrywania Foc TR4. Po optymalizacji test zapewnia szybsze i dokładniejsze wykrywanie na tańszych urządzeniach niż istniejące testy komercyjne.
Nasze dalsze badania będą dotyczyć detektora fluorescencyjnego połączonego ze smartfonem, który zostanie połączony z testem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół prezentuje nowatorski test łączący amplifikację polimerazy z rekombinazą oraz system CRISPR/Cas12a w celu wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4. Metoda ta stanowi szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla istniejących technik detekcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fitopatologia
- Detekcja mikrobiologiczna
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 jest istotnym patogenem atakującym uprawy bananowca.
- Obecne metody detekcji mogą być kosztowne i czasochłonne.
- Technologia CRISPR stanowi obiecujące podejście do wykrywania patogenów.
- Polimeraza amplifikacyjna zależna od rekombinazy pozwala na szybką amplifikację DNA.
Cel badania
- Opracowanie metody szybkiego wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.
- Poprawa dokładności obecnych testów detekcyjnych.
- Wykorzystanie niedrogiego sprzętu do przeprowadzenia testu.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja materiału roślinnego, a następnie transkrypcja RNA.
- Przygotowanie mieszanin reakcyjnych Cas12a i RPA.
- Użycie przenośnego fluorometru do detekcji.
- Wizualizacja wyników przy użyciu niebieskiego światła LED.
Główne wyniki
- Próbki pozytywne wykazały widoczną fluorescencję, co wskazywało na pomyślną detekcję.
- Próbki negatywne wykazały niską fluorescencję końcową.
- Test wykazał szybsze uzyskanie wyników w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Potencjał integracji ze smartfonem w celu zwiększenia dostępności.
Wnioski
- Opracowany test stanowi znaczący postęp w detekcji Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.
- Stanowi on kosztowo efektywną i szybką alternatywę dla istniejących testów komercyjnych.
- Dalsze prace skupią się na optymalizacji testu oraz integracji technologii smartfonowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin, takich jak Fusarium oxysporum f. sp. cubense TR4, ma kluczowe znaczenie dla bezpieczeństwa biologicznego w rolnictwie oraz odporności łańcuchów dostaw. Zintegrowany test RPA-CRISPR/Cas12a umożliwia skuteczny nadzór molekularny bez konieczności polegania na kosztownej infrastrukturze laboratoryjnej, co wspiera wczesną interwencję i zarządzanie ryzykiem. Możliwość ta zwiększa pewność prognoz w kluczowych punktach decyzyjnych w procesach badawczo-rozwojowych w rolnictwie i agrobio biotechnologii.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne wykrywanie specyficznego dla patogenu DNA, wspierając walidację obecności choroby w oparciu o postawione hipotezy.
- Poprawia ocenę ryzyka biologicznego poprzez odróżnienie rzeczywistej infekcji patogenem od objawów stresu abiotycznego.
- Ułatwia szybką segregację próbek roślinnych do dalszych analiz molekularnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia izotermiczny przebieg pracy w jednej probówce, odpowiedni do wysokoprzepustowego przesiewania materiału roślinnego.
- Dostarcza wiarygodnych, ilościowych odczytów fluorescencji w celu standaryzacji i powtarzalności testu.
- Umożliwia skalowalne wdrożenie w warunkach polowych lub w miejscach o ograniczonych zasobach, co pozwala na szerszy zakres nadzoru.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wczesne i skuteczne wykrywanie patogenów inwazyjnych.
- Zapewnia ciągłość od nadzoru terenowego po walidację laboratoryjną, co redukuje luki translacyjne.
- Zmniejsza ryzyko związane z preklinicznymi interwencjami rolniczymi, zapewniając szybką informację zwrotną na temat rozprzestrzeniania się patogenów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test RPA-CRISPR/Cas12a integruje się z kontinuum od nadzoru do interwencji, łącząc wczesne wykrywanie z późniejszymi procesami molekularnymi i translacyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzanie obecności patogenów na poziomie molekularnym.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalną, ilościową detekcję odpowiednią do przetwarzania próbek na dużą skalę.
- Analityka: Zapewnia wyniki oparte na fluorescencji, pozwalające na obiektywne porównanie stanu próbek.
- Badania translacyjne: Ułatwia szybkie przejście od detekcji w terenie do potwierdzenia laboratoryjnego i planowania interwencji.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę wymagającą niewielkiej ilości sprzętu, którą można dostosować do innych potrzeb w zakresie detekcji patogenów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w nadzorze nad patogenami.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy przy minimalnych wymaganiach dotyczących sprzętu i szkolenia.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie terminowych decyzji typu go/no-go w zakresie strategii powstrzymywania lub eradykacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zasobów badawczo-rozwojowych i interwencyjnych w rolnictwie z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana podstawowa wiedza z zakresu biologii molekularnej w celu przygotowania próbek i przeprowadzenia analizy.
- Wymagany dostęp do przenośnego fluorymetru oraz standardowych materiałów eksploatacyjnych do laboratorium.
- Standaryzacja etapów ekstrakcji i amplifikacji jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności wyników między zespołami.
- Metoda możliwa do adaptacji do różnych typów tkanek roślinnych poprzez optymalizację protokołu.
- Wyniki ilościowe są zależne od infrastruktury do detekcji fluorescencji.
