Name: Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Naucz się metody hodowli pęcherzyków jajnikowych bez rusztowania w konfigurowalnych formach agarozowych. To podejście poprawia wzrost i owulację przy zachowaniu stabilnej produkcji hormonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były finansowane przez National Institutes of Child Health and Human Development (R01HD105752 dla F.E.D i T32HD094699 dla E.J.Z) oraz program SenNet NIH Common Fund (U54AG075932 i UH3CA268105 dla F.E.D.) oraz grant Bill & Melinda Gates Foundation (INV-003385 dla F.E.D.). Na podstawie warunków przyznania grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów, licencja Creative Commons Attribution 4.0 została już przypisana wersji Autor Accepted Manuscript, która może wyniknąć z tego zgłoszenia.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Gametogeneza in vitro i dojrzewanie to kluczowe technologie dla fundamentalnego zrozumienia biologii oocytów, z potencjalnymi zastosowaniami w technologii wspomaganego rozrodu, zachowaniu płodności oraz ochronie gatunków. Metody wspierające IVG często opierają się na współhodowli z komórkami somatycznymi, aby stworzyć zrekonstruowane jajniki30. Znaczenie tych komórek wspierających jest dobrze znane in vivo, gdzie mikrośrodowisko somatyczne pęcherzykowe jest kluczowe dla zdrowego ...

Oocyt, czyli gameta żeńska, dostarcza większość cytoplazmy i połowę materiału genetycznego do zarodka podczas zapłodnienia, co jest niezbędne dla rozwoju kolejnego pokolenia. Oogeneza rozpoczyna się podczas rozwoju embrionalnego, gdy pierwotne komórki rozrodcze wchodzą w mejozę i zatrzymują się w profazie I. Te oocyty znajdują się wewnątrz pierwotnych pęcherzyków i stanowią rezerwę jajnikową, skończoną i nieodnawialną pulę, z której są stopniowo pozyskiwane. Pęcherzyki rozwijają się w procesie zwanym folikulogenezą, którego celem jest ostatecznie wytworzenie dojrzałej gamety zdolnej do zapłodnienia 1,2,3,4,5. Rozwój pęcherzyków rozpoczyna się we wczesnej, niezależnej od gonadotropiny fazie, w której sygnalizacja parakryna jest niezbędna dla przeżycia i wzrostu pęcherzyka. W miarę dojrzewania pęcherzyków do stadium wtórnego stają się one zależne od gonadotropin, co oznacza przejście do sygnalizacji endokrynalnej. Kluczową cechą pęcherzyków wtórnych jest oocyt otoczony co najmniej dwiema pełnymi warstwami komórek ziarnistka sześciennego, wraz z nowo rozwiniętą warstwą teki. Komórki teki tworzą najbardziej zewnętrzną warstwę pęcherzyka, zapewniając androgeny i wsparcie strukturalne 6,7. Na koniec wypełniona płynem jama antralna tworzy się i pęka w odpowiedzi na wzrost hormonu luteinizującego (LH) podczas owulacji, uwalniając gametę zdolną do zapłodnienia zatrzymaną w mejozie II 2,8,9.
Oocyt osiąga kompetencje rozwojowe do zapłodnienia oraz zdolność wspierania wczesnego rozwoju zarodka przedimplantacyjnego, określanego jako dojrzewanie jądrowe i cytoplazmatyczne, podczas oogenezy i folikulogenezy 10,11,12. Dojrzewanie cytoplazmatyczne jest widoczne morfologicznie, ponieważ oocyty rozszerzają się w trakcie folikulogenezy. W wyniku proliferacji komórek somatycznych, w tym komórek teki, ziarnistka i mężczyźna, same mieszki mieszkowe doświadczają znacznej rozszerzalności objętościowej. U myszy średnica pęcherzyka rośnie pięciokrotnie od wczesnych pęcherzyków wtórnych do przedowulacyjnych. Dwukierunkowa komunikacja między oocytem a otaczającymi komórkami somatycznymi jest niezbędna dla oogenezy. W pęcherzykach pierwotnych zona pellucida powstaje z białek wydzielanych przez oocyt, a komunikacja między tymi przegrodami jest częściowo pośredniczona przez projekcje transzonalne, które zapewniają fizyczny kontakt między tymi dwoma przedziałami pęcherzyków13,14. Dlatego mikrośrodowisko pęcherzykowe jest niezbędne do prawidłowego zarządzania wzrostem oraz dojrzewaniem jądrowym i cytoplazmatycznym oocytu 2,5. Aby lepiej zrozumieć odrębne mechanizmy wspierające te procesy, potrzebne są zaawansowane i fizjologicznie istotne techniki hodowli in vitro. Możliwość hodowli mieszków in vitro ma szerokie zastosowania, w tym technologie wspomaganego rozrodu i zachowanie płodności 15,16,17,18, ochronę gatunków19,20, rozwój leków21 oraz przesiew toksykologiczny22,23.
Systemy hodowli pęcherzyków in vitro są również niezbędnym pośrednim krokiem pośredniczącym w zdolności do wytwarzania gamet z pluripotentnych komórek macierzystych, znanych również jako gametogeneza in vitro (IVG)24. Naukowcy wykorzystywali embrionalne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste oraz indukowane pluripotentne komórki macierzyste do rozwoju gamet u różnych gatunków, często polegając na komórkach somatycznych do odtworzenia rodzimego mikrośrodowiska pęcherzyka 25,26,27,28,29,30 . Chociaż dzięki tym metodom osiągnięto znaczące kamienie milowe potwierdzające koncepcję, nadal istnieje wyzwanie związane z niską jakością oocytów, co odzwierciedla się w niskim tempie rozwoju zarodków i żywych potomstwa po zapłodnieniu in vitro u myszy31,32. Nie dokonano jeszcze żywych urodzeń u innych gatunków, co podkreśla potrzebę dalszego udoskonalania protokołów, aby w pełni wspierać oogenezę i folikulogenezę.
Obecnie stosuje się kilka strategii hodowli mieszków mieszkowych. Technicznie najmniej wymagające i o najwyższej przepustowości podejścia to metody bez rusztowań, gdzie mieszki mieszkowe umieszcza się w plastikowej misce lub wkładce membranowej33,34. Tutaj komórki ziarniskowe przylegają do powierzchni hodowli, tracąc kontakt z oocytem33,34. Rozpad architektury mieszkowej ogranicza użyteczność i biologiczne znaczenie tych technik. Jednak hodowla wolna od rusztowania w płytkach o niskim przyczepie lub odwróconych kroplach pozwala pęcherzykowi zachować integralność strukturalną u kilku gatunków ssaków 35,36,37. Niestety, przy tych technikach trudno jest kontrolować interakcję między pęcherzykami i ilość wsparcia mechanicznego, jakie otrzymują. Dlatego, aby lepiej podsumować fizjologię in vivo, opracowano metody hodowli, w których pęcherzyki są otoczone w hydrożelach o określonym, regulowanym składzie chemicznym i/lub właściwościach mechanicznych 33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53. Na przykład system wzrostu pęcherzyków in vitro z kapsułką alginatu może rekapitulować kluczowe sygnatury transkryptomiczne obserwowane in vivo21.
Pomimo sukcesu i wartości protokołów hodowli enkapsulowanych, istnieje kilka wad. Mogą być technicznie wymagające, pracochłonne, o niskiej przepustowości i niekompatybilne z automatycznymi metodami obrazowania. Ponadto metody hodowli w kapsułkach wymagają wieloetapowych metod dla większych gatunków ssaków ze względu na większe objętościowe rozszerzanie mieszka37. Ponadto techniki enkapsulowane zapewniają jednolite wsparcie we wszystkich kierunkach, a pęcherzyki muszą zostać uwolnione z hydrożelu przed owulacją. Nie dzieje się to in vivo, gdy pęcherzyk oddziałuje z otaczającym mikrośrodowiskiem jajnika, które zapewnia dynamiczne wsparcie biomechaniczne54. Na przykład sztywna kora jajnika utrzymuje spokój pierwotnych pęcherzyków, podczas gdy duże rosnące pęcherzyki zwykle występują w miękkim przedziale rdzeniowym55,56. Gdy pęcherzyk z kompetentnym oocytem osiągnie swój końcowy rozmiar, modyfikacje ściany pęcherzyka i powierzchni nabłonka jajnika umożliwiają owulację. Dlatego techniki hodowla, w których mieszki mieszkowe rosną w jednym kierunku z niewielkim oporem, mogą lepiej naśladować fizjologię in vivo.
W nowatorskim podejściu opracowano powtarzalną, skalowalną, technicznie mniej wymagającą i opłacalną metodę hodowli wielowarstwowych pęcherzyków wtórnych u myszy57. Tutaj wytwarza się mikrootwory z ultra-niską adhezją agarozową o precyzyjnie kontrolowanej geometrii (kształt, wymiary) i układzie przestrzennym (liczba, bliskość) przy użyciu przystępnych cenowo metod. Pęcherzyki w formach agarozowych podlegają mechanicznemu podparciu we wszystkich kierunkach poza jednym i są hodowane w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co umożliwia obrazowanie poklatkowe do zaawansowanej analizy morfokinetycznej. Stereolitografia (SLA) 3D była wykorzystywana jako przystępna metoda produkcji formy głównej, a następnie wykonywane są etapy formowania silikonu wolnego od wycieku do odlewania agarozy. Poprawa wzrostu pęcherzyków i wyników owulacji osiągnięto przy użyciu nowego systemu w porównaniu do tradycyjnego eIVFG, bez kompromisów w przeżyciu, dojrzewaniu czy luteinizacji pęcherzyków57. Niniejszy artykuł protokołu opisuje kroki niezbędne do personalizacji i produkcji agarozowych pleśni, jak zasiać i hodować wielowarstwowe wtórne pęcherzyki, przetwarzać oraz ostatecznie przeprowadzić analizę poklatkową (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td><Mocne>Materiały i chemikalia</wytrzymałe></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Rurki do wirówek polistyrenowych o pojemności 50 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>941-11017-CS</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT-150</td><td>Aby szybko zamrozić i przechować materiały</td></tr><tr><td>Talerz 100 mm, nieimpregnowany</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D&nbsp;</td><td>Do produkcji i przechowywania mikroform agarozowych</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Mercedes Scientific</td><td>1200</td><td>Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L&nbsp; Końcówki pipety, niska retencja</td><td>MIDSCI</td><td>PR-1000BK</td><td>Wskazówki dotyczące kultury&nbsp;</td></tr><tr><td>200 & mikro; L&nbsp; Końcówki pipety, niska retencja</td><td>MIDSCI</td><td>PR-200BK</td><td>Wskazówki dotyczące kultury&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka z 24 dołkami</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>Kultura</td></tr><tr><td>Talerze 35 mm</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>Izolować jajniki i inkubować w ośrodku enymtycznym</td></tr><tr><td>95% etanolu</td><td>Mercedes Scientific</td><td>1210</td><td>Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Hoefer</td><td>GR140</td><td>Mikroformy</td></tr><tr><td>BioXtra olej mineralny, lekki olej, odpowiedni do hodowli komórek zarodków myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310-500ML</td><td>Stosowany jako biokompatybilny środek do wyjmowania z formy</td></tr><tr><td>Albumina z surowicy/nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>103700</td><td>Medium wzrostu</td></tr><tr><td>Sprzątacze do czyszczenia, 10 oz., opakowanie 6</td><td>Office Depot&nbsp;</td><td>110284</td><td>Sprężone powietrze</td></tr><tr><td>Przezroczysta żywica V4 1 L</td><td>Formlabs, Inc</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td>Żywica do druku 3D</td></tr><tr><td>Corning Plastik wielorazowego użytku, niskoformowa zlewka 100 mL, polipropylen, stopniowana</td><td>Corning</td><td>1000P-100</td><td>Zlewka do mieszania elementów silikonowych&nbsp;</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Ośrodki enzymatyczne</td></tr><tr><td>Ecoflex 00-45 Near Clear</td><td>Smooth-On, Inc</td><td>B09M8Y9PTV</td><td>Materiał silikonowy</td></tr><tr><td>F-12 + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31765-035</td><td>Medium wzrostu</td></tr><tr><td>Fetuin bydła płodowa</td><td>Sigma</td><td>F-3385</td><td>Medium wzrostu</td></tr><tr><td>Serum bydła płodu (FBS)</td><td>Serum szczytu</td><td>PS-FB2</td><td>Medium do rozwarstwienia, ośrodka enzymatycznego itdnbsp; Materiały konserwacyjne i materiały Ośrodek dojrzewania</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Sakiewki sterylizacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50&nbsp;</td><td>Sakiewki sterylizacyjne</td></tr><tr><td>Hormon stymulujący pęcherzyki (FSH)</td><td>EMD Serono, Inc.</td><td>Tylko Gonal-F Rx & nbsp;</td><td>Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania</td></tr><tr><td>Gibco &nbsp; DPBS, wapń, magnez</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-040-182 i nbsp;</td><td>Sól fizjologiczna Dulbecco z buforem fosforanowym</td></tr><tr><td>Gonadotropina ludzka kosmówkowa (hCG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1063-1VL</td><td>Ośrodek dojrzewania</td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen (ITS)</td><td>ThermoFisher</td><td>41400045</td><td>Medium wzrostu</td></tr><tr><td>Sondy molekularne invitrogen, Rhodamina falloidyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>Plama cytoszkieletu jajowego</td></tr><tr><td>Naczynia IVF</td><td>Thermo Scientific</td><td>150260</td><td>Aby izolować, wybrać i prerównoważyć pęcherzyki</td></tr><tr><td>Leibovit'z 15 (L15)</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td>Dissection Media & Ośrodki enzymatyczne</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>Ośrodki enzymatyczne</td></tr><tr><td>MEM? + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>32561-037</td><td>Materiały konserwacyjne i Media wzrostu i materiały Ośrodek dojrzewania</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu naskórka myszy (EGF)</td><td>BD Biosciences</td><td>354010</td><td>Ośrodek dojrzewania</td></tr><tr><td>Nalgene Przezroczysty Poliwęglanowy Klasyczny Osuszacz</td><td>Thermo Scientific</td><td>5311-0250</td><td>Odkurzacz próżniowy &nbsp;</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Fisher Scientific</td><td>83-30</td><td>Przetwarzanie tkanek i Osadzanie</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Ośrodki do rozwarstwiania, ośrodki enzymatyczne i ośrodki enzymatyczne Materiały konserwacyjne</td></tr><tr><td>Końcówki do strippera</td><td>Origio</td><td>MXL3-200</td><td>Kultura</td></tr><tr><td>VECTASHIELD PLUS Medium Montażowe Antifade z DAPI</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-2000</td><td>Barwienie jądra jajowego</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Mercedes Scientific</td><td>9840</td><td>Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>&alpha;-Tubulin (11H10) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5063S</td><td>Plama tubulinowej jajka</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbuduj platformę 2</td><td>Formlabs, Inc</td><td>BP-F3-02-01&nbsp;</td><td>Komponent drukarki 3D</td></tr><tr><td>Dino-Lite Edge AF4915ZTL, USB 2.0</td><td>Dino-Lite</td><td>AF4915ZTL</td><td>Obrazowanie do ustawienia timelapse</td></tr><tr><td>Zbiornik żywiczny Form 3 V2.1&nbsp;</td><td>Formlabs, Inc</td><td>RT-F3-02-01</td><td>Komponent drukarki 3D</td></tr><tr><td>Drukarka 3D Form 3B +</td><td>Formlabs, Inc</td><td>F3B-P-PRINTER</td><td>Drukarka 3D stereolitografii (SLA) firmy Formlabs</td></tr><tr><td>Forma utwardzenia&nbsp;</td><td>Formlabs, Inc</td><td>FH-CU-01</td><td>Platforma do utwardzania&nbsp;</td></tr><tr><td>Formowe płukanie</td><td>Formlabs, Inc</td><td>FH-WA-01</td><td>Platforma myjąca</td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem z pompą do parowania</td><td>VWR</td><td>0309-3005</td><td>Aby nałożyć środek do wyjmowania formy</td></tr><tr><td>Nasadka ogniskowania/koncentratora światła dla serii Edge (z wyłączeniem modeli T5, T8)</td><td>Dino-Lite</td><td>N3C-R</td><td>Komponent obrazowania do konfiguracji timelapse</td></tr><tr><td>Pakiet uchwytu montażowego łączący rack RK-10 oraz przedłużenie ramienia RK-10-EX</td><td>Dino-Lite</td><td>RK-10A</td><td>Komponent obrazowania do konfiguracji timelapse</td></tr><tr><td>Osadzenie tkanek</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td>Osadzanie mikroform</td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td>Do przetwarzania mikroform</td></tr><tr><td>211DS Inkubator Drżący (Orbital Shaker)</td><td>Labnet International</td><td>I-5211-DS</td><td>Inkubacja jajników w podłożu enzymatycznym w celu uwalniania pęcherzyków</td></tr><tr><td>Software&nbsp; </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autodesk Fusion</td><td>Autodesk, Inc</td><td></td><td>Oprogramowanie do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Autodesk oferuje bezpłatny dostęp edukacyjny w ramach programu edukacyjnego Autodesk.</td></tr><tr><td>DinoCapture 3.0 wersja 1.1.1.3&nbsp;</td><td>Dino-Lite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td></td><td>Analiza obrazów OCT i pomiar mieszków mieszkowych</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>Formlabs, Inc</td><td></td><td>Darmowe oprogramowanie do przygotowania druku zaprojektowane do pracy z drukarkami stereolitograficznymi (SLA) firmy Formlabs.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Production and Use of Customizable Agarose Molds for Scaffold-Free Mouse Ovarian Follicle Culture

Pęcherzyk jajnika jest funkcjonalną jednostką jajnika, która produkuje hormony i gamety niezbędne do utrzymania funkcji rozrodczych i zdrowia kobiet. Zdolność do odtwarzania folikulogenezy, owulacji i luteinizacji in vitro ma szerokie zastosowanie podstawowe, translacyjne i kliniczne. Najbardziej zaawansowane systemy wzrostu pęcherzyków in vitro utrzymują trójwymiarową (3D) architekturę pęcherzyka, która jest kluczowa dla rozwoju mejotycznie kompetentnych oocytów metafazy II u ludzi. Niedawno opracowano i zweryfikowano metodę wolną od rusztowania wzrostu pęcherzyków wielowarstwowych myszy w metodzie in vitro . Do tego celu użyto niestandardowych form drukowanych 3D do mikrowzorowania agarozy z mikrowgłębiami umożliwiającymi objętościowe rozszerzanie mieszków włosowych. Pęcherzyki hodowane w tym środowisku wolnym od rusztowania wykazywały porównywalną produkcję hormonów i żywotność w porównaniu do dobrze ugruntowanych systemów wzrostu pęcherzyków in vitro (eIVFG) opartych na alginacie. Co ważne, mikrodoły agarozowe są metodą skalowalną, mniej wymagającą technicznie i wykazują poprawę wzrostu mieszków mieszkowych oraz tempo owulacji w porównaniu do eIVFG. Ta metoda pozwala na personalizację pleśni biokompatybilne z oocytem, komórką wysoce wrażliwą na wypłuki specyficzne dla materiału i inne zanieczyszczenia środowiskowe. Ponadto mieszki mieszkowe w tym układzie są hodowane w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co umożliwia obrazowanie i analizę w czasie rzeczywistym. Aby zwiększyć dostępność tego nowego podejścia, artykuł szczegółowo opisuje metody potrzebne do projektowania i druku 3D form głównych, tworzenia silikonowych form dla płytek z 24 lub 96 dołkami oraz hodowli izolowanych wielowarstwowych wtórnych pęcherzyków jajników w formach agarozowych. To rozwiązanie można również zintegrować z opłacalnym systemem obrazowania poklatkowego, umożliwiającym analizę morfokinetyczną. Ponadto pleśnie mogą być osadzane w parafinie do dalszych analiz histologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, ta przyjazna dla użytkownika metoda jest wszechstronnym narzędziem do hodowli mieszków mieszkowych i może być dodatkowo dostosowana, aby wspierać różnicowanie i dojrzewanie komórek rozrodczych w kontekście mieszków genetycznych, aby utrzymać kompletną gametogenezę in vitro .

Aby ustalić, czy przeżywalność i wzrost mieszków były wspierane dzięki tej nowej technologii opisanej w sekcji 7 protokołu, wyizolowano i hodowano równolegle w mikroformach agarozowych lub otoczono w 0,5% alginacie. Reprezentatywne obrazy mieszków mieszkowych z każdego innego dnia hodowli wykazały prawidłowy rozwój, wzrost i tworzenie jamy antralnej przez cały okres hodowli (Rysunek 6A). Wcześniej opublikowane wyniki wykazały, że przeżywalność mieszków nie wykazuje istotnych różnic między me...

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that produces hormones and gametes needed to sustain female reproductive function and health. The ...

Nasze badania mają na celu opracowanie indywidualnych, fizjomimetycznych i wolnych od rusztowania metod hodowli mieszków, aby sprawdzić, czy mogą one poprawić jakość pęcherzyków hodowanych in vitro oraz oocytów, które się przez nie rozwijają. Obecnie najbardziej zaawansowana metoda hodowli wykorzystuje system wzrostu pęcherzyków in vitro otoczony hydrożelem, który pozwala pęcherzykom zachować trójwymiarową architekturę podczas genezy folikulogenezy. Enkapsulacja wodoru jest technicznie wymagająca, pracochłonna, o niskiej przepustowości i niestety nie jest kompatybilna z automatycznymi metodami obrazowania.Dodatkowo, enkapsulacja 3D zapewnia jednolite wsparcie, które nie naśladuje fizjologii in vivo. Stworzyliśmy formy drukowane w 3D, biokompatybilne, które wspierają bardzo wrażliwe komórki oocytów. Pęcherzyki wyhodowane w środowisku wolnym od rusztowania wykazały poprawę wzrostu i owulacji bez zaburzenia produkcji hormonów w porównaniu z ugruntowanymi technikami.Zajmujemy się potrzebą przyjaznego użytkownika i konfigurowalnego systemu hodowli, który lepiej naśladuje naturalne środowisko mieszków mieszków. Obrazowanie poklatkowe umożliwia również monitorowanie na żywo i analizę wydajności mieszków mieszkowych. Na początek uruchom oprogramowanie CAD na komputerze.Otwórz plik kroków projektowania podstawy formy z 24 dołkami w oprogramowaniu. Wybierz wewnętrzną powierzchnię obiektu. Następnie przejdź do zakładki Solid w przestrzeni roboczej projektu i wybierz Create Sketch, aby wstawić pożądany projekt mikroformy.Teraz wprowadź pożądane wymiary x i y oraz liczbę mikrowgłębi. Następnie wybierz Finish Sketch na pasku narzędzi. Tworzą mikrootwory o głębokości 800 mikrometrów za pomocą funkcji Ekstrude, wybierając kolejno Solid, Create i Extrude.Teraz wybierz zaokrożenie o promieniu 0,1 milimetra dla górnej części mikrowgłębień, klikając na Projektowanie, Solid, Modyfikacja i Zaokrągnięcie. Dodaj zaokrąglenie o promieniu 0,25 milimetra, aby stworzyć mikrodołek o okrągłym dnie. Zapisz nowy główny projekt formy i wyeksportuj kopię w formacie krokowym, wybierając Plik i naciskając Eksport.Otwórz 24-dołkowy pojemnik z odlewem silikonowym, jednokrokowy. Następnie wstaw nowy główny projekt formy jako komponent zewnętrzny, klikając prawym przyciskiem myszy na zapisany plik i wybierając Wstaw do aktualnego projektu. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na włożony komponent i wybierz Przerwij link, aby usunąć odniesienie do projektu formy głównej.Umieść nowy główny projekt formy na 24-dołkowatym silikonowym pojemniku jednej powierzchni, zapewniając, że jest skierowany do środka. Wybierz OK, aby wyrównać obiekty. Wybierz operację cięcia, używając pojemnika jako ciała docelowego, a formy głównej jako korpusu narzędzia, aby stworzyć komorę silikonową do formowania.Zapisz i wyeksportuj nowy 24-dołkowy formę silikonową jako pliki STL i kroki. Otwórz pliki STL nowej 24-dołkowej formy silikonowej typu jeden oraz 24-dołkowego silikonowego odlewanego pojemnika numer 2 za pomocą oprogramowania do przygotowania druku 3D. Ukierunkuj wydruk tak, aby mikrofilary były skierowane do góry, a funkcja Wierteń otworów stworzy otwór o szerokości jednego milimetra na bok wydruku.Drukuj oba wzory kontenerów o grubości 25 mikrometrów. Gotowe wydruki myj zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie spryskać fragment mikrofilarów obszernie 95% izopropanolem.Usuń resztki etanolu sprężonym powietrzem. Po wyschnięciu i utwardzeniu obejrzyj każdy wydruk za pomocą mikroskopu stereo. Ostrożnie upewnij się, że wszystkie mikrofilary są rozdzielone i jednolite pod względem wielkości i wyglądu.Po utwardzeniu przykryj zewnętrzną część wydruku parafilmem, jeśli kanał wiertła nie jest wypełniony, i przechowuj do dalszego użycia. Następnie umieść przygotowany silikon w próżniowym osuszacu na pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wlej mieszankę silikonową z równomiernym przepływem do formy wydrukowanej w 3D, dbając o to, by poziom był taki sam lub nieco poniżej powierzchni formy, aby uzyskać płaskość.Usuń uwięzione powietrze końcówką pipety P200 i ponownie odgazuj, jeśli trzeba. Silikon utwardzaj w temperaturze pokojowej w osuszaczu przez co najmniej pięć godzin lub najlepiej przez noc. Po utwardzeniu usuń silikon z formy i obejrzyj mikroformy pod mikroskopem stereo.Usuń nadmiar materiału z kanału wiertniczego i wyrzuć formy z mostkami lub uszkodzonymi odwiertami. Następnie umieść silikonową formę w pojemniku z silikonową formą numer numer dwa na drugi etap formowania, upewniając się, że boczne otwarcie jest wyrównane. Spryskaj silikonową formę lekko olejem mineralnym bezpiecznym dla embrionów.Usuwaj nadmiar olejów z mikrootworów za pomocą sprężonego powietrza. Powtórz procedurę mieszania silikonu i wlej nową mieszankę do drugiego pojemnika, utrzymując poziom na powierzchni formy lub poniżej. Następnego dnia oddziel silikon od formy wydrukowanej w 3D, a silikonowe formy jeden i dwa od siebie.Po mikroskopijnej inspekcji usuń pleśnie z uszkodzonymi mikrofilarami lub nadmiarem ropy w odwiercie. Teraz umyj silikonową formę 70% etanolem. Pozwól wyschnąć na powietrzu przez 30 minut w laminarnym okapu.Po wyschnięciu włóż formę do woreczka sterylizacyjnego przed autoklawem. Lekko wygiąć końcówkę do usuwania mieszków, aby zwiększyć precyzję podczas transferu mieszków. Przełóż mieszki mieszkowe szybko, aby zapobiec wahaniom pH lub temperatury.Pod mikroskopem użyj końcówki do usuwania 200 mikrometrów, aby przenieść 10 wielowarstwowych wtórnych pęcherzyków na mikroformę, umieszczając je w sąsiednich mikrodołkach. Przed ostatecznym ułożeniem potwierdzij, że wszystkie 10 pęcherzyków ma podobny rozmiar. Następnie załóż nasadkę ogniskowca światła na ręcznym mikroskopie.Włóż mikroskop z montażem do inkubatora i podłącz do laptopa za pomocą oprogramowania. Umieść i wyrównuj posiew dobrze pod mikroskopem oraz dostosuj wysokość i ostrość tak, aby wszystkie mieszki były widoczne. Używaj automatycznego balansowania bieli, sterowania AWB i LED.Wyłącz automatyczną ekspozycję, AE i wybierz optymalny czas naświetlania. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe z czasem trwania ośmiu dni i interwałem 30 minut. Wybierz zdjęcie i wyłącz diodę LED, gdy nie robisz zdjęć.Pęcherzyki hodowane w mikropleśniach agarozowych wykazywały ciągły wzrost i tworzenie jamek antralnych. Po indukcji owulacji pęcherzyki hodowane w agarozowych mikroformach dawały więcej owulowanych komórek jajowych niż te w alginacie. Dodatkowo potwierdzając biokompatybilność, morfologia wrzeciona jaj M2 nie różniła się istotnie między grupami.Pęcherzyki otoczone alginatem nie zachowały swojej pozycji podczas hodowli i są niezgodne z obrazowaniem poklatkowym w czasie. Podczas obrazowania poklatkowego można było natychmiast śledzić i mierzyć morfologię poszczególnych mieszków mieszków, w tym średnicę Fereta, okrągłość i proporcje wydłużności, które można było natychmiast śledzić i mierzyć przez cały okres hodowli. Optyczna tomografia koherencyjna umożliwiła 3D wizualizację struktur wewnętrznych pęcherzyków oraz uchwyciła dynamiczne zdarzenia pęknięć pęcherzyków podczas owulacji.Mikroformy agarozowe umożliwiły analizę histologiczną wielu pęcherzyków na tej samej płaszczyźnie po osadzeniu i sekcjonowaniu parafiny, umożliwiając identyfikację obecności lub braku tkanek oraz wspierając barwienie H&E. Aby zademonstrować możliwość personalizacji tej metody, stworzono wersję o wysokiej przepustowości i 96 dołkach, wyposażoną w 10 mikrodołków na formę, która została pomyślnie wykonana. Podobnie jak w przypadku konstrukcji z 24 dołkami, był kompatybilny z obrazowaniem pęcherzyków poklatkowych.

production-use-customizable-agarose-molds-for-scaffold-free-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Naucz się metody hodowli pęcherzyków jajnikowych bez rusztowania w konfigurowalnych formach agarozowych. To podejście poprawia wzrost i owulację przy zachowaniu stabilnej produkcji hormonów.

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Przeglądaj więcej filmów