Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Nasze badania mają na celu opracowanie indywidualnych, fizjomimetycznych i wolnych od rusztowania metod hodowli mieszków, aby sprawdzić, czy mogą one poprawić jakość pęcherzyków hodowanych in vitro oraz oocytów, które się przez nie rozwijają. Obecnie najbardziej zaawansowana metoda hodowli wykorzystuje system wzrostu pęcherzyków in vitro otoczony hydrożelem, który pozwala pęcherzykom zachować trójwymiarową architekturę podczas genezy folikulogenezy. Enkapsulacja wodoru jest technicznie wymagająca, pracochłonna, o niskiej przepustowości i niestety nie jest kompatybilna z automatycznymi metodami obrazowania.

Dodatkowo, enkapsulacja 3D zapewnia jednolite wsparcie, które nie naśladuje fizjologii in vivo. Stworzyliśmy formy drukowane w 3D, biokompatybilne, które wspierają bardzo wrażliwe komórki oocytów. Pęcherzyki wyhodowane w środowisku wolnym od rusztowania wykazały poprawę wzrostu i owulacji bez zaburzenia produkcji hormonów w porównaniu z ugruntowanymi technikami.

Zajmujemy się potrzebą przyjaznego użytkownika i konfigurowalnego systemu hodowli, który lepiej naśladuje naturalne środowisko mieszków mieszków. Obrazowanie poklatkowe umożliwia również monitorowanie na żywo i analizę wydajności mieszków mieszkowych. Na początek uruchom oprogramowanie CAD na komputerze.

Otwórz plik kroków projektowania podstawy formy z 24 dołkami w oprogramowaniu. Wybierz wewnętrzną powierzchnię obiektu. Następnie przejdź do zakładki Solid w przestrzeni roboczej projektu i wybierz Create Sketch, aby wstawić pożądany projekt mikroformy.

Teraz wprowadź pożądane wymiary x i y oraz liczbę mikrowgłębi. Następnie wybierz Finish Sketch na pasku narzędzi. Tworzą mikrootwory o głębokości 800 mikrometrów za pomocą funkcji Ekstrude, wybierając kolejno Solid, Create i Extrude.

Teraz wybierz zaokrożenie o promieniu 0,1 milimetra dla górnej części mikrowgłębień, klikając na Projektowanie, Solid, Modyfikacja i Zaokrągnięcie. Dodaj zaokrąglenie o promieniu 0,25 milimetra, aby stworzyć mikrodołek o okrągłym dnie. Zapisz nowy główny projekt formy i wyeksportuj kopię w formacie krokowym, wybierając Plik i naciskając Eksport.

Otwórz 24-dołkowy pojemnik z odlewem silikonowym, jednokrokowy. Następnie wstaw nowy główny projekt formy jako komponent zewnętrzny, klikając prawym przyciskiem myszy na zapisany plik i wybierając Wstaw do aktualnego projektu. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na włożony komponent i wybierz Przerwij link, aby usunąć odniesienie do projektu formy głównej.

Umieść nowy główny projekt formy na 24-dołkowatym silikonowym pojemniku jednej powierzchni, zapewniając, że jest skierowany do środka. Wybierz OK, aby wyrównać obiekty. Wybierz operację cięcia, używając pojemnika jako ciała docelowego, a formy głównej jako korpusu narzędzia, aby stworzyć komorę silikonową do formowania.

Zapisz i wyeksportuj nowy 24-dołkowy formę silikonową jako pliki STL i kroki. Otwórz pliki STL nowej 24-dołkowej formy silikonowej typu jeden oraz 24-dołkowego silikonowego odlewanego pojemnika numer 2 za pomocą oprogramowania do przygotowania druku 3D. Ukierunkuj wydruk tak, aby mikrofilary były skierowane do góry, a funkcja Wierteń otworów stworzy otwór o szerokości jednego milimetra na bok wydruku.

Drukuj oba wzory kontenerów o grubości 25 mikrometrów. Gotowe wydruki myj zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie spryskać fragment mikrofilarów obszernie 95% izopropanolem.

Usuń resztki etanolu sprężonym powietrzem. Po wyschnięciu i utwardzeniu obejrzyj każdy wydruk za pomocą mikroskopu stereo. Ostrożnie upewnij się, że wszystkie mikrofilary są rozdzielone i jednolite pod względem wielkości i wyglądu.

Po utwardzeniu przykryj zewnętrzną część wydruku parafilmem, jeśli kanał wiertła nie jest wypełniony, i przechowuj do dalszego użycia. Następnie umieść przygotowany silikon w próżniowym osuszacu na pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Wlej mieszankę silikonową z równomiernym przepływem do formy wydrukowanej w 3D, dbając o to, by poziom był taki sam lub nieco poniżej powierzchni formy, aby uzyskać płaskość.

Usuń uwięzione powietrze końcówką pipety P200 i ponownie odgazuj, jeśli trzeba. Silikon utwardzaj w temperaturze pokojowej w osuszaczu przez co najmniej pięć godzin lub najlepiej przez noc. Po utwardzeniu usuń silikon z formy i obejrzyj mikroformy pod mikroskopem stereo.

Usuń nadmiar materiału z kanału wiertniczego i wyrzuć formy z mostkami lub uszkodzonymi odwiertami. Następnie umieść silikonową formę w pojemniku z silikonową formą numer numer dwa na drugi etap formowania, upewniając się, że boczne otwarcie jest wyrównane. Spryskaj silikonową formę lekko olejem mineralnym bezpiecznym dla embrionów.

Usuwaj nadmiar olejów z mikrootworów za pomocą sprężonego powietrza. Powtórz procedurę mieszania silikonu i wlej nową mieszankę do drugiego pojemnika, utrzymując poziom na powierzchni formy lub poniżej. Następnego dnia oddziel silikon od formy wydrukowanej w 3D, a silikonowe formy jeden i dwa od siebie.

Po mikroskopijnej inspekcji usuń pleśnie z uszkodzonymi mikrofilarami lub nadmiarem ropy w odwiercie. Teraz umyj silikonową formę 70% etanolem. Pozwól wyschnąć na powietrzu przez 30 minut w laminarnym okapu.

Po wyschnięciu włóż formę do woreczka sterylizacyjnego przed autoklawem. Lekko wygiąć końcówkę do usuwania mieszków, aby zwiększyć precyzję podczas transferu mieszków. Przełóż mieszki mieszkowe szybko, aby zapobiec wahaniom pH lub temperatury.

Pod mikroskopem użyj końcówki do usuwania 200 mikrometrów, aby przenieść 10 wielowarstwowych wtórnych pęcherzyków na mikroformę, umieszczając je w sąsiednich mikrodołkach. Przed ostatecznym ułożeniem potwierdzij, że wszystkie 10 pęcherzyków ma podobny rozmiar. Następnie załóż nasadkę ogniskowca światła na ręcznym mikroskopie.

Włóż mikroskop z montażem do inkubatora i podłącz do laptopa za pomocą oprogramowania. Umieść i wyrównuj posiew dobrze pod mikroskopem oraz dostosuj wysokość i ostrość tak, aby wszystkie mieszki były widoczne. Używaj automatycznego balansowania bieli, sterowania AWB i LED.

Wyłącz automatyczną ekspozycję, AE i wybierz optymalny czas naświetlania. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe z czasem trwania ośmiu dni i interwałem 30 minut. Wybierz zdjęcie i wyłącz diodę LED, gdy nie robisz zdjęć.

Pęcherzyki hodowane w mikropleśniach agarozowych wykazywały ciągły wzrost i tworzenie jamek antralnych. Po indukcji owulacji pęcherzyki hodowane w agarozowych mikroformach dawały więcej owulowanych komórek jajowych niż te w alginacie. Dodatkowo potwierdzając biokompatybilność, morfologia wrzeciona jaj M2 nie różniła się istotnie między grupami.

Pęcherzyki otoczone alginatem nie zachowały swojej pozycji podczas hodowli i są niezgodne z obrazowaniem poklatkowym w czasie. Podczas obrazowania poklatkowego można było natychmiast śledzić i mierzyć morfologię poszczególnych mieszków mieszków, w tym średnicę Fereta, okrągłość i proporcje wydłużności, które można było natychmiast śledzić i mierzyć przez cały okres hodowli. Optyczna tomografia koherencyjna umożliwiła 3D wizualizację struktur wewnętrznych pęcherzyków oraz uchwyciła dynamiczne zdarzenia pęknięć pęcherzyków podczas owulacji.

Mikroformy agarozowe umożliwiły analizę histologiczną wielu pęcherzyków na tej samej płaszczyźnie po osadzeniu i sekcjonowaniu parafiny, umożliwiając identyfikację obecności lub braku tkanek oraz wspierając barwienie H&E. Aby zademonstrować możliwość personalizacji tej metody, stworzono wersję o wysokiej przepustowości i 96 dołkach, wyposażoną w 10 mikrodołków na formę, która została pomyślnie wykonana. Podobnie jak w przypadku konstrukcji z 24 dołkami, był kompatybilny z obrazowaniem pęcherzyków poklatkowych.