Name: Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę hodowli organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów, zachowujących cechy pierwotnych guzów. Ten protokół wspiera badania nad spersonalizowaną terapią i precyzyjną medycyną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy z wdzięcznością dziękują wsparciu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 82172831) oraz Kluczowemu Projektowi Badawczemu Komisji ds. Zdrowia i Planowania Rodziny Prowincji Jiangsu (Grant nr X20240121).

<ol><li>James, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lancet+commission+on+prostate+cancer%3A+planning+for+the+surge+in+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases.</a> Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).</li>
<li>Knutson, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AR+alterations+inform+circulating+tumor+DNA+detection+in+metastatic+castration+resistant+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients.</a> Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Framework+for+the+pathology+workup+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies.</a> Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).</li>
<li>Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of organoids in cancer research.</a> Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).</li>
<li>Sachs, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+for+the+analysis+of+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes.</a> Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+organoid+models+in+prostate+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Application of organoid models in prostate cancer research.</a> Front Oncol. 11, 736431(2021).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).</li>
<li>Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+in+prostate+cancer%3A+improving+therapeutic+efficacy+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine.</a> Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).</li>
<li>Karkampouna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+and+organoids+model+therapy+response+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer.</a> Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).</li>
<li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li>
<li>Neal, J. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+models+for+neoplastic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organoids as models for neoplastic transformation.</a> Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).</li>
<li>Waseem, M., Wang, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+an+emerging+precision+medicine+model+for+prostate+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research.</a> Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).</li>
<li>Moschovas, M. C., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+bundle+preservation+in+robotic-assisted+radical+prostatectomy%3A+how+I+do+it+after+15%2C000+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Braz+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases.</a> Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).</li>
<li>Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+development+and+applications+in+gynecological+cancers%3A+the+new+stage+of+tumor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment.</a> J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+the+application+of+organoid-based+drug+sensitivity+testing+in+cancer+precision+medicine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development.</a> Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).</li>
<li>Van Hemelryk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+and+organoids+recapitulate+castration-resistant+prostate+cancer+with+sustained+androgen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling.</a> Cells. 11 (22), 3632(2022).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+bladder+cancer+organoids+as+a+valuable+tool+for+understanding+tumor+biology+and+developing+personalized+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment.</a> Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).</li>
<li>Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+organoids+2.0%3A+modelling+the+complexity+of+the+tumour+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment.</a> Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ustanowienie PDO dla PCa stanowi kluczowy postęp w modelowaniu przedklinicznym, oferując znaczące przewagi w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami komórek 2D i PDX16. Metoda przedstawiona w tym badaniu umożliwia generowanie organoidów, które wiernie oddają histologiczne, genetyczne i fenotypowe cechy pierwotnego guza. Zachowując heterogeniczność guza, w tym sygnalizację AR i architekturę komórkową, organoidy stanowią bardziej biologicznie istotną platformę do badania postępu raka prostaty, oporn...

Rak prostaty (PCa) pozostaje jednym z najczęstszych nowotworów u mężczyzn na świecie, ustępującym jedynie rakowi płuc pod względem śmiertelności związanej z nowotworem. Według najnowszych badań epidemiologicznych, globalna częstość zachorowań na PCa stale rośnie, a prognozuje się, że liczba nowych przypadków raka prostaty rocznie wzrośnie z 1,4 miliona w 2020 roku do 2,9 miliona do 2040roku. Pomimo postępów we wczesnym wykrywaniu i rozwoju nowych terapii, w tym terapii deprywacji androgenów (ADT) i środków celowanych, rak prostaty pozostaje istotnym wyzwaniem klinicznym ze względu na swoją heterogeniczność oraz nieuchronny rozwój oporności na leczenie, szczególnie w zaawansowanych stadiach2. Rak prostaty oporny na kastrację (CRPC), który pojawia się po niepowodzeniu ADT, stanowi śmiertelną formę choroby, charakteryzującą się słabymi wynikami przeżycia i ograniczonymi opcjami terapeutycznymi3. Zrozumienie molekularnych mechanizmów napędzających postęp choroby i oporność jest zatem kluczowe dla identyfikacji nowych celów terapeutycznych i poprawy wyników leczenia pacjentów.
Opracowanie modeli przedklinicznych, które wiernie oddają złożoność raka prostaty u człowieka, jest kluczowe dla rozwoju badań w tej dziedzinie. Tradycyjne hodowle komórek 2D, choć szeroko stosowane, nie oddają heterogeniczności komórkowej, architektury guza i mikrośrodowiska obserwowanych in vivo4. W rezultacie translacyjne zastosowanie tych modeli jest ograniczone, szczególnie do badania postępu guza, oporności na leki oraz dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymia mikrośrodowiskiem guza. Dla porównania, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) oraz hodowle organoidów stały się bardziej zaawansowanymi narzędziami łączącymi konwencjonalne linie komórkowe z klinicznymi guzami 4,5,6.
Systemy hodowli organoidów zrewolucjonizowały modelowanie nowotworów. Te trójwymiarowe (3D) struktury pochodzą z tkanek pacjentów i mogą zachować cechy histologiczne, genomiczne oraz fenotypowe oryginalnego guza 7,8,9,10. Co ważne, organoidy raka prostaty zachowują kluczowe cechy heterogeniczności choroby, w tym sygnalizację AR, odporność na leczenie oraz niestabilność genomową, co czyni je idealnymi narzędziami do badań translacyjnych 11. W porównaniu z modelami PDX, organoidy są bardziej opłacalne, skalowalne i podatne na modyfikację genetyczną, co ułatwia wysokoprzepustowe badania leków, odkrywanie biomarkerów oraz badania funkcjonalne. Platformy organoidalne już wykazały obiecujące wyniki w innych nowotworach, w tym rakach jelita grubego, piersi i trzustki, podkreślając ich potencjał dla spersonalizowanej onkologii 4,12.
Jednak ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty (PCO) wiąże się z unikalnymi wyzwaniami technicznymi. Nabłonek prostaty jest z natury zależny od sygnalizacji androgenowej i wsparcia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co wymaga specjalistycznych warunków hodowlanych. Ponadto rak prostaty wykazuje szeroki zakres zachowań klinicznych, od miejscowych guzów wrażliwych na hormony po wysoce agresywne, oporne na leczenie CRPC, co dodatkowo komplikuje rozwój powtarzalnych układów organoidalnych11,12. Skuteczne protokoły generowania PCO muszą uwzględniać te biologiczne złożoności poprzez optymalizację kluczowych etapów, w tym przetwarzania tkanek, trawienia enzymatycznego, osadzania ECM oraz suplementacji kluczowymi czynnikami wzrostu, hormonami i małymi cząsteczkami. Takie protokoły są niezbędne do zapewnienia wierności organoidów wobec guzów rodzicielskich oraz ułatwienia ich zastosowania w dalszych analizach.
W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy i powtarzalny protokół dotyczący ustanawiania i długoterminowego utrzymania PDO. Nasz proces obejmuje cały proces – od pozyskiwania tkanek i przetwarzania biopsji oraz próbek chirurgicznych, po przekazywanie organoidów, kriokonserwację i resuscytację (Rysunek 1). Protokół ten został zoptymalizowany w celu zachowania integralności fenotypowej i genomowej tkanek nowotworowych prostaty, umożliwiając solidne systemy hodowli 3D odpowiednie do szerokiego zakresu zastosowań, w tym profilowania genomowego, testów odpowiedzi na leki oraz testów funkcjonalnych. Warto zauważyć, że nasza metoda rozwiązuje typowe techniczne przeszkody, takie jak niskie wskaźniki sukcesu hodowli organoidów, nieoptymalny wzrost oraz trudności w późniejszym passage, a także dostarcza ustandaryzowanych wytycznych, co ułatwia powtarzalność w różnych laboratoriach.
Opracowanie wiarygodnych modeli organoidów raka prostaty ma ogromne znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i translacyjnych13. Systemy te oferują potężną platformę do rozszyfrowania mechanizmów chorobowych, identyfikacji nowych celów terapeutycznych oraz rozwijania podejść precyzyjnych do medycyny dostosowanej do indywidualnych pacjentów. Poprzez rozwiązywanie istniejących luk technicznych i dostarczanie kompleksowego protokołu, nasza praca ma na celu przyspieszenie wdrażania technologii organoidów w badaniach nad rakiem prostaty oraz wsparcie globalnych działań na rzecz zwalczania tej trudnej choroby14.

<table><tbody><tr><td>A 83-01</td><td>TOCRIS</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>adMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Jinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Shenzhen Ruiwode Life Technology Co., Ltd</td><td>M1416R</td><td></td></tr><tr><td>Rurki wirówkowe</td><td>Nanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultrex PathClear BM</td><td>R& D</td><td>3533-010-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Obniżony Czynnik Wzrostu BME, typ 2</td><td>R& D</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki hodowlane (płytki o niskiej przyczepności z 24 dołkami)</td><td>Termo</td><td>Nunc-174930-ZX</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>ISOREAG</td><td>521-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Nanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaminePlus-200mM</td><td>R& D</td><td>B90210</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>R& D</td><td>1254/10</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórek nawilżonych (37 stopni; C, 5% CO2)</td><td>Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>HY-160SY</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Nanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Średniej wielkości naczynia kulturowe</td><td>Absin</td><td>abs7005</td><td></td></tr><tr><td>Suplement medialny N21-MAX (50X)</td><td>R& D</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>R& D</td><td>3533-010-02</td><td></td></tr><tr><td>Normocyna</td><td>Invivogen</td><td>ANT-NR-2</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid pipetowanie</td><td>Nanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Nanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PM-2</td><td></td></tr><tr><td>rhEGF</td><td>R& D</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF-10</td><td>R& D</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>rhNoggin</td><td>R& D</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>rhR-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>4656-RS-100</td><td></td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>TOCRIS</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej</td><td>Napęd na tylne koła</td><td>DSC-400</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek/skalpel</td><td>Nanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TryplE Express</td><td>Gibco</td><td>126A04013</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji guza, ludzki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Nanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kąpiel wodna</td><td>Changzhou Zhongjie Eksperymentalna Produkcja Instrumentów, Ltd</td><td>HH-600</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorek Y-27632</td><td>R& D</td><td>1254/10</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Establishment and Maintenance of Patient-derived Prostate Cancer Organoids: A Detailed Experimental Protocol

Rak prostaty (PCa) to wysoce zróżnicowany nowotwor i główna przyczyna śmiertelności związanej z nowotworem u mężczyzn, z istotnymi wyzwaniami klinicznymi w zakresie leczenia oporności na leczenie i postępu choroby. Istniejące modele przedkliniczne, takie jak dwuwymiarowe (2D) linie komórkowe i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), mają ograniczenia w wiernym oddaniu złożoności PCa, w tym heterogeniczność nowotworów, sygnalizację zależną od receptorów androgenowych (AR) oraz interakcje mikrośrodowiskowe. Aby wypełnić tę lukę, badanie przedstawia solidny i powtarzalny protokół ustanawiający organoidy pochodzenia od pacjentów (PDO), które zachowują cechy genetyczne, fenotypiczne i histologiczne guzów rodzicielskich. Metoda ta umożliwia hodowlę organoidów zarówno z lokalnej, jak i zaawansowanej PCa, dostarczając biologicznie istotny model do badania mechanizmów chorób, odpowiedzi na leki oraz odkrywania biomarkerów. Wyniki pokazują zdolność protokołu do generowania organoidów z różnych próbek klinicznych, z zastosowaniami w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków oraz medycynie precyzyjnej. Oferując ustandaryzowany przepływ pracy, który odpowiada na kluczowe wyzwania techniczne, badanie podkreśla znaczenie PDO jako wszechstronnych narzędzi do rozwoju badań nad rakiem prostaty i opracowywania skuteczniejszych strategii terapeutycznych.

Morfologiczne i dynamiczne cechy wzrostu organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów Organoidy raka prostaty pochodzące od pacjentów zostały pomyślnie ustalone ze świeżych tkanek nowotworowych pobranych podczas zabiegów klinicznych. Początkowe powstawanie organoidów zwykle obserwowano w ciągu 5-7 dni od hodowli (Rysunek 2). Pod mikroskopią w świetle organoidy wykazywały wyraźne cechy morfologiczne, tworząc zwarte, dobrze zdefiniowane sferoidy lub struktury przypo...

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Prostate cancer (PCa) is a highly heterogeneous malignancy and a leading cause of cancer-related mortality in men, with significant clinical challenges in ...

Badania koncentrują się na ustanowieniu i utrzymaniu organoidu raka prostaty pochodzącego od pacjenta do spersonalizowanych badań terapeutycznych. Postępy obejmują zoptymalizowany system hodowli organoidów, który wzmacnia zachowanie wierności, oraz badania przesiewowe leków w spersonalizowanej terapii raka prostaty. Na początek należy zebrać bloki tkanek do 50-mililitrowych stożkowych rurek i odpowiednio oznaczyć każdą probówkę.Dodaj do każdej rurki roztwór konserwacyjny, aż tkanki będą całkowicie zanurzone. Za pomocą sterylnych pęset, przenieś próbki tkanek raka prostaty do średniej wielkości naczynia do hodowli. Myj tkanki dwa do trzech razy dwoma mililitrami DPBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia.Następnie ostrożnie usuń tkankę tłuszczową, mięśnie i inne elementy nienabłonkowe za pomocą cienko zakończonej pęsety, zachowując jedynie obszary nabłonkowe. Za pomocą nożyczek pokrój oczyszczoną tkankę na małe fragmenty o wymiarze około jednego do trzech milimetrów sześciennych. Następnie przenieś fragmenty tkanek do probówek do przetwarzania tkanek i dodaj do każdej rurki roztwór trawienia tkanki nowotworowej.Uruchom urządzenie trawienne i uruchom program dysocjacji tkanek średniotwardych dla enzymatycznej dysocjacji mechanicznej. Następnie dodaj równą lub podwójną objętość substratu ADDMEM i F12 uzupełnionego FBS do zawiesiny komórkowej, aby zakończyć trawienie enzymatyczne. Wstępnie zwilż 100-mikrometrowe sitko ogniwa jednym mililitrem medium adDMEM/F12 i przefiltruj przez niego zawiesinę ogniwową.Następnie dwukrotnie przepłucz rurkę do przetwarzania tkanek i sitko komórkowe pięcioma mililitrami podłoża adDMEM/F12, uzupełnionym roztworem inhibitora ROCK. Zbierz filtrat do 50-mililitrowej sterylnej stożkowej wirówki. Przepuszcz zebrane zawieszenie przez sitko o średnicy 70 mikrometrów i przelej całe przefiltrowane zawieszenie do nowej rurki 50 milimetrów.Następnie wiruj zebraną zawiesinę ogniwową w stężeniu 200 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Ostrożnie odrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie osad komórkowy w dwóch mililitrach buforu lizy czerwonych krwinek. Następnie inkubuj zawieszenie na lodzie przez dwie do trzech minut.Aby zakończyć lizę, dodaj sześć mililitrów adDMEM/F12 z dodatkiem inhibitora ROCK. Przelej mieszankę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i wiruj w 200 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu przemyj granulki komórkowe raz do dwóch razy tym samym uzupełnionym medium i przelej ostatnią zawiesinę do rurki Eppendorfa o pojemności 1,5 mililitra.Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwowej z 10 mikrolitrami roztworu trypanu. Ponownie zawiesij granulki komórkowe w jednym mililitrze adDMEM/F12. Pipetować sześć mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny na cytometrze hemo i liczyć komórki pod mikroskopem.Teraz wiruj zawiesinę ogniwa w 200 G przez pięć minut w 25 stopniach Celsjusza. Przełóż ostatni osad komórkowy do rurki Eppendorfa o pojemności 1,5 mililitra. Określ wymaganą objętość żelu matrycowego na podstawie liczby komórek.Używając wcześniej schłodzonych końcówek pipet, ostrożnie dodaj żel matrycowy do osadu komórkowego. Delikatnie mieszaj mieszankę żelu komórkowego na lodzie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i zachować integralność żelu matrycowego. Następnie podaj około 30 mikrolitrów mieszaniny żelu matrycy komórkowej na kroplę do płytki hodowli o niskiej przyczepności, 24-dołkowej.Umieść płytkę hodowlę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla na pięć minut, aby umożliwić wstępne zastygnięcie żelu. Odwróć płytkę i pozwól jej stać przez 20 minut, aby zachować trójwymiarową formę żelu. Do każdego dołku dodaj od 800 do 1 000 mikrolitrów podłoża hodowlanego.Używając wcześniej schłodzonej końcówki pipety, mechanicznie rozbij żel matrycowy w każdej dołku, aby rozbić skupiska organoidów. Przepłukaj każdy dołek raz do dwóch razy podłożem adDMEM/F12 z dodatkiem roztworu inhibitora ROCK. Przenieś rozdrobnione skupiska i pożywkę hodowlową do 15-mililitrowej sterylnej stożkowej wirówki.Wiruj rurkę w 200 G przez pięć minut w 25 stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesij powstały pellet w dwóch mililitrach wcześniej podgrzanego roztworu enzymów rekombinowanych trypsynowopodobnych. Pipetować mieszankę w górę i w dół, aby rozpocząć dysocjację.Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Teraz dodaj równą lub podwójną objętość podłoża adDMEM/F12 z dodatkiem FBS, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Wiruj zawieszenie przy 200 G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie odrzuć nadmiar. Aby rozpocząć usuwanie żelu matrycowego, ponownie zawiesij pellet w dwóch mililitrach roztworu do odzyskiwania komórek. Inkubuj zawiesinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 do 40 minut, aby rozpuścić pozostałości żelu matrycowego.Wiruj próbkę w 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyrzuceniu supernatantu przemyj granulkę dwukrotnie przy użyciu adDMEM i medium F12, aby wyeliminować pozostałe składniki matrycy. Na koniec przenieś granulat do sterylnej rurki Eppendorfa o pojemności 1,5 mililitra do dalszego przetwarzania.Rozsiewaj rozłączone skupiska organoidów po procedurach ponownego siewania. Początkowe formowanie organoidów obserwowano między piątym a siódmym dniem hodowli na zdjęciach jasnych pol pokazujących zwarte i dobrze zdefiniowane sferoidy lub struktury przypominające gruczoły. Barwienie hematoksyliny i eozyny wykazało zachowaną architekturę gruczołową w organoidach pochodzących z dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka, przypominających dopasowaną tkankę pacjenta.Immunohistochemia wykazała silną ekspresję receptorów androgenowych jądrowych zarówno w organoidach, jak i w pierwotnych guzach pochodzących z hormonalnie wrażliwych tkanek raka prostaty. CK5, PSMA i NKX3.1 były silnie eksprymowane zarówno w próbkach organoidów, jak i nowotworów, co wspiera wierność pochodzenia nabłonka i linii genealogii. Barwienie KI-67 wykazało, że organoidy zachowały wskaźnik proliferacyjny porównywalny z pierwotnymi tkankami nowotworowymi.Opracowaliśmy solidne protokoły utrzymania organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów, umożliwiając spersonalizowane testy leków i odkrywanie biomarkerów. Nasze wyniki stanowią wiarygodną platformę do badania biologii raka prostaty, ułatwiając spersonalizowane terapie i postępy w medycynie precyzyjnej. Przyszłe badania będą dotyczyć heterogeniczności organoidów, interakcji z mikrośrodowiskiem nowotworowym oraz mechanizmów oporności na leki w raku prostaty.

establishment-maintenance-patient-derived-prostate-cancer-organoids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Organoidy pochodzące z nowotworów są rodzajem modelu hodowli komórek 3D, który może zachować patologiczne cechy i specyficzną dla narządu linię komórkową guzów. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują organoidy z guza prostaty z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy.

Przygotowanie organoidów z guzów: model guza 3D in vitro

Tutaj prezentujemy protokół, który pomaga w postępowaniu z ludzkimi organoidami pierwotnymi prostaty, a następnie sugerujemy punkty końcowe do oceny fenotypu. Opisano wysiew, utrzymanie kultur, odzysk z żelu matrycowego, kwantyfikację morfologiczną, osadzanie i sekcjonowanie, cięcie FFPE, barwienie całego mocowania oraz zastosowanie testów komercyjnych.

Postępowanie z ludzką pierwotną hodowlą organoidów gruczołu krokowego i ich ocena

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Poznaj metodę hodowli organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów, zachowujących cechy pierwotnych guzów. Ten protokół wspiera badania nad spersonalizowaną terapią i precyzyjną medycyną.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Przeglądaj więcej filmów