Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Opracowaliśmy wielkoskalowe chipy mikroprzepływowe, aby umożliwić analizę multiomiczną w celu zilustrowania mechanizmu metabolicznego neuronów po uszkodzeniu aksonów. Wykorzystujemy głównie technologię mikroprzepływową, analizę strumienia metabolicznego i transkryptomikę, aby posunąć naprzód badania nad mechanizmami metabolicznymi neuronów podczas uszkodzenia aksonów i regeneracji. Odkryliśmy, że istnieją różnice metaboliczne między neuronami korowymi w różnych chorobach rozwojowych i że młode neurony przechodzą przebudowę metaboliczną po urazie zewnętrznym.

Główną zaletą naszego protokołu jest konstrukcja platformy mikroprzepływowej na większą skalę i standardy operacyjne, które umożliwiają dokładną multiomikę i rozmiar milionów komórek. Aby rozpocząć, przenieś bazę PDMS i utwardzacz do probówki wirówkowej. Umieścić probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w mieszadle odśrodkowym.

Wirować przy 2 000 G przez cztery minuty dwa razy w celu wymieszania i odgazowania. Wlej od 13 do 15 gramów odgazowanego PDMS do formy mikroprzepływowej, upewniając się, że dno formy jest całkowicie zakryte. Teraz umieść formę w eksykatorze próżniowym, a następnie użyj pompy próżniowej do opróżniania powietrza przez pięć do 10 minut, aby dokładnie usunąć pęcherzyki z PDMS.

Za pomocą gumowej gruszki delikatnie postukaj w powierzchnię PDMS, aby rozbić wszelkie pozostałe pęcherzyki na powierzchni. Przenieś formę do pieca konwekcyjnego i piecz w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 100 minut, aby utwardzić polidimetylosiloksan. Gdy PDMS jest w pełni utwardzony, delikatnie wsuń końcówkę skalpela pod krawędź PDMS, aby ostrożnie podnieść i oddzielić go od formy.

Za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy od 2,0 do 2,5 milimetra utwórz otwory w PDMS do infuzji pożywki hodowlanej i ładowania komórek. Usuń wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe z PDMS za pomocą taśmy klejącej, a następnie umieść go w czystym szklanym naczyniu i owiń folią aluminiową do przechowywania. Przed eksperymentem należy autoklawować urządzenie mikroprzepływowe w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 101 kilopaskali przez pięć minut, aby zapewnić sterylność.

Umieść szkiełko nakrywkowe przeznaczone do konwencjonalnych urządzeń mikroprzepływowych w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów. Dodaj do naczynia dwa mililitry 0,1 miligrama na mililitr roztworu poli-D-lizyny. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin lub przez noc.

Po inkubacji ostrożnie pobrać roztwór poli-D-lizyny w celu ponownego użycia lub właściwej utylizacji. Teraz dodaj do naczynia dwa mililitry sterylnej ultraczystej wody. Obróć go 50 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 50 razy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

Zassać wodę za pomocą pompy próżniowej podłączonej do sterylnej końcówki pipety, zbierając odpady do pojemnika na odpady płynne. Po zakończeniu wszystkich prań, przed użyciem pozostaw szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą sterylnych kleszczyków z cienką końcówką umieść autoklawowany chip mikroprzepływowy na środku szklanej powierzchni z mikrokanalikami skierowanymi w dół.

Delikatnie dociśnij chip do szklanej powierzchni za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zapewnić pełną przyczepność. Następnie zaznacz lewą komorę kropką za pomocą markera permanentnego, aby oznaczyć komorę soma. Odessać 10 mikrolitrów zawiesiny neuronalnej za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie powoli dozować zawiesinę do portu ładowania nad zaznaczoną komorą somy.

Upewnij się, że płyn przepływa prawidłowo do dolnego zbiornika lewej komory. Przenieś naczynie hodowlane do nawilżonego inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 minut. Po inkubacji umieść szalkę pod mikroskopem 20X, aby potwierdzić obfitość pożywki z komory somy do komory aksonalnej przez mikrokanaliki.

Teraz odpipetuj 150 mikrolitrów neuronalnej pożywki podstawowej do górnego portu przedziału aksonalnego. Podobnie dodaj 150 mikrolitrów kompletnej pożywki neuronalnej do górnego portu komory somy. Następnie wlej 20 mililitrów ultraczystej wody do 150-milimetrowego naczynia hodowlanego, aby utworzyć komorę wilgotnościową.

Umieść 35-milimetrową naczynie hodowlane w dużym naczyniu, a następnie przenieś cały system hodowli do inkubatora i utrzymuj przez wymagany czas. Użyj szalki Petriego o szerokości 10 centymetrów do umieszczenia dużego urządzenia mikroprzepływowego. Wybierz rozsiewanie kanałów pełnokanałowych lub interwałowych w oparciu o potrzeby eksperymentalne, ponieważ każda metoda wymaga różnych protokołów uszkodzenia aksonów.

Po zakończeniu wysiewu dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki do hodowli neuronów na szalkę Petriego, aby utrzymać wzrost neuronów. Przenieś odpowiednią ilość neuronalnej pożywki podstawowej do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej do późniejszego wykorzystania. Umieść urządzenie mikroprzepływowe zawierające neurony korowe na czystej ławce.

Używając niestrzępiącego się papieru, osusz dno 35-milimetrowej naczynia hodowlanego, a następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zassać pożywkę z dwóch prawych bocznych otworów urządzenia mikroprzepływowego. Następnie podłącz rurkę pompy próżniowej do sterylnej, bezfiltrowej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Włącz pompę próżniową z szybkością ssania 60 litrów na minutę i skieruj końcówkę w punkt połączenia między dolnym otworem komory końcowej aksonu a komorą, aby zassać stare medium, powodując pęknięcie aksonu z powodu podciśnienia.

Wymień końcówkę pipety i pobierz 150 mikrolitrów neuronalnej pożywki podstawowej, powoli dodając ją przez dolny otwór prawej komory. Po wykonaniu dodania i czterokrotnej aspiracji, zastąp je świeżą, kompletną pożywką neuronalną, a następnie odessaj starą pożywkę z bocznego otworu ciała komórki i w razie potrzeby dodaj świeżą, kompletną pożywkę neuronalną zawierającą leki. Umieść urządzenie mikroprzepływowe wraz z szalką hodowlaną w 150-milimetrowym naczyniu hodowlanym i kontynuuj hodowlę przez wymagany czas, np. 24 godziny.

W przypadku ręcznego uszkodzenia aksonów należy umieścić neurony we wszystkich komorach wielkoskalowego urządzenia mikroprzepływowego. Inkubuj urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. W siódmym dniu in vitro wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane zawierające urządzenie mikroprzepływowe i umieścić je w sterylnym miejscu.

Przygotuj mikroskop z 20-krotnym powiększeniem i wysterylizuj obszar roboczy za pomocą 75% etanolu. Trzymaj sterylną końcówkę pipety z filtrem o pojemności 10 mikrolitrów i zidentyfikuj wiązki aksonów w oryginalnych mikrokanalikach pod kierunkiem mikroskopu. Wykonaj podłużne zadrapania wzdłuż każdej wiązki aksonów za pomocą końcówki pipety.

Obserwuj pękanie aksonów pod mikroskopem w czasie rzeczywistym. Mikrokanaliki standardowego urządzenia mikroprzepływowego pozwalają na wzrost aksonów, ale nie somy, co zostało potwierdzone przez barwienie tubuliną beta 3 po siedmiu dniach in vitro. Gęstość neuronów nie wykazała znaczącej różnicy po uszkodzeniu aksonów, co wskazuje na brak obserwowalnej śmierci neuronów.

Do analiz multiomicznych opracowano wielkoskalowe urządzenie mikroprzepływowe o trójwymiarowej konstrukcji z możliwością rozbudowy. Zarówno nieperforowane, jak i perforowane repliki PDMS bezpiecznie przylegały do 10-centymetrowych czasz lub płytek PC. Uszkodzenie aksonów wywołane drapaniem końcówki pipety doprowadziło do wyraźnie odciętych aksonów o zaburzonej morfologii, w przeciwieństwie do nienaruszonych aksonów przed uszkodzeniem.

Regenerację aksonów obserwowano zarówno po sześciu godzinach, jak i 24 godzinach po urazie, podczas gdy nieuszkodzone aksony pozostawały stabilne. Stężenie białek neuronalnych znacznie wzrosło z 1420,4 mikrogramów na mililitr na początku badania do 1748,9 na mililitr po sześciu godzinach i 1823,7 mikrogramów na mililitr po 24 godzinach od urazu. Wydajność RNA z grup kontrolnych i uszkodzonych aksonów była prawie identyczna.

Sekwencjonowanie RNA ujawniło 595 genów specyficznych dla obrażeń i 609 genów specyficznych dla kontroli, z 17 471 genami wspólnymi dla grup. Analiza szlaku KEGG wykazała znaczącą regulację w górę fosforylacji oksydacyjnej, odpowiedzi reaktywnych form tlenu, autofagii i szlaków cyklu TCA po urazie.