Name: Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj mikroprzepływową platformę do analizy multiomicznej neuronów po uszkodzeniu aksonalnym. Metoda umożliwia badanie przebudowy metabolicznej młodych neuronów korowych z wykorzystaniem transkryptomiki i analizy strumienia metabolicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (grant nr L222080, F251031, Z240011, 7192103) oraz Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (grant nr 82271513)

<ol><li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sub-compartmentalization%3A+a+strategy+to+optimize+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Required+growth+facilitators+propel+axon+regeneration+across+complete+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Required growth facilitators propel axon regeneration across complete spinal cord injury.</a> Nature. 561 (7723), 396-400 (2018).</li>
<li>Hilton, B. J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+injured+adult+CNS+axons+regenerate+by+recapitulating+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Can injured adult CNS axons regenerate by recapitulating development.</a> Development. 144 (19), 3417-3429 (2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-organized+scar-free+spinal+cord+repair+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice.</a> Nature. 587 (7835), 613-618 (2020).</li>
<li>Hilton, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+vesicle+priming+machinery+suppresses+axon+regeneration+upon+adult+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An active vesicle priming machinery suppresses axon regeneration upon adult CNS injury.</a> Neuron. 110 (1), 51-69 (2022).</li>
<li>Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi Abdolrezaee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+spinal+cord+injury%3A+An+overview+of+pathophysiology%2C+models+and+acute+injury+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Traumatic spinal cord injury: An overview of pathophysiology, models and acute injury mechanisms.</a> Front Neurol. 10, 441408(2019).</li>
<li>Anjum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+Pathophysiology%2C+multimolecular+interactions%2C+and+underlying+recovery+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7533(2020).</li>
<li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+to+mimic+initial+event+of+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model to mimic initial event of neovascularization.</a> J Vis Exp. (170), e62003(2021).</li>
<li>Li, N., Sip, C., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+controlled+with+elastomeric+microvalve+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays.</a> J Vis Exp. (8), e296(2007).</li>
<li>Chowdhury, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+customizable+chamber+for+measuring+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A customizable chamber for measuring cell migration.</a> J Vis Exp. (121), e55264(2017).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> J Vis Exp. (170), e61895(2021).</li>
<li>Shahryari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+orthotopic+murine+model+of+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical orthotopic murine model of human prostate cancer.</a> J Vis Exp. (114), e54125(2016).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+soluble+signal-mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions.</a> J Vis Exp. (38), e1749(2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
<li>Liu, R., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmine+promotes+axon+regeneration+through+enhancing+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Harmine promotes axon regeneration through enhancing glucose metabolism.</a> J Biol Chem. 301 (3), 108254(2025).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+the+study+of+neuronal+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for the study of neuronal injury in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 115 (4), 815-830 (2018).</li>
<li>Van Laar, V. S., Arnold, B., Berman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+embryonic+rat+cortical+neuronal+culture+and+chronic+rotenone+treatment+in+microfluidic+culture+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary embryonic rat cortical neuronal culture and chronic rotenone treatment in microfluidic culture devices.</a> Bio Protoc. 9 (6), e3192(2019).</li>
<li>Huang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+an+energetic+AKT-PAK5+axis+boosts+axon+energy+supply+and+facilitates+neuron+survival+and+regeneration+after+injury+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia.</a> Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+axon+regeneration+by+enhancing+mitochondrial+transport+and+rescuing+energy+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits.</a> J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).</li>
<li>Cartoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian-specific+protein+armcx1+regulates+mitochondrial+transport+during+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mammalian-specific protein armcx1 regulates mitochondrial transport during axon regeneration.</a> Neuron. 92 (6), 1294-1307 (2016).</li>
<li>Han, S. M., Baig, H. S., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+localize+to+injured+axons+to+support+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitochondria localize to injured axons to support regeneration.</a> Neuron. 92 (6), 1308-1323 (2016).</li>
<li>Yang, L. Q., Chen, M., Ren, D. L., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+oxidase+mutant+retards+mauthner-cell+axon+regeneration+at+an+early+stage+via+modulating+mitochondrial+dynamics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Dual oxidase mutant retards mauthner-cell axon regeneration at an early stage via modulating mitochondrial dynamics in zebrafish.</a> Neurosci Bull. 36, 1500-1512 (2020).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+and+in+vivo+stable+isotope+labelling+of+central+carbon+metabolism+and+related+pathways+with+analysis+by+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS.</a> Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).</li>
<li>Mercimek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+effects+of+3D+printed+mold+material%2C+curing+temperature%2C+and+duration+on+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+curing+characteristics+for+lab-on-a-chip+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications.</a> Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).</li>
<li>Derosa, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+pathways+in+idiopathic+autism+revealed+by+time+course+transcriptomic+analysis+of+patient-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons.</a> Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).</li>
<li>Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+axonal+mitochondrial+maintenance+and+bioenergetics+in+neurodegeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration.</a> Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).</li>
<li>Huang, N., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+as+model+platforms+of+CNS+injury-ischemia+to+study+axonal+regeneration+by+regulating+mitochondrial+transport+and+bioenergetic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism.</a> Cell Regen. 11 (1), 33(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ustanowienie zaawansowanych modeli in vitro do badania uszkodzeń i regeneracji aksonów jest niezbędne do odkrycia mechanizmów molekularnych i metabolicznych zaangażowanych w naprawę neuronów16,19. W tym badaniu przedstawiamy ustandaryzowany przepływ pracy, który integruje urządzenia mikroprzepływowe, wielkoskalowe hodowle neuronów i precyzyjne protokoły uszkodzeń aksonów, umożliwiając solidną analizę multiomiczną uszkodzonych neuronów korowych.
<p cl...

Neurony tworzą dwa odrębne typy wypukłości o wyspecjalizowanych funkcjach, aksony i dendryty, poprzez polaryzację podczas rozwoju 1,2. Regeneracja nerwów odnosi się do procesu odrastania aksonów po uszkodzeniu neuronów3, z naciskiem na naprawę ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W przeciwieństwie do obwodowego układu nerwowego, OUN ma ograniczoną zdolność regeneracyjną 4,5,6, co często prowadzi do trwałych zaburzeń funkcjonalnych lub trwałej niepełnosprawności u pacjentów z urazami rdzenia kręgowego lub urazami mózgu 7,8. W związku z tym kluczowe znaczenie ma opracowanie strategii usprawniających naprawę ośrodkowego układu nerwowego i wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw regeneracji aksonów.
Urządzenia mikroprzepływowe, funkcjonujące jako zintegrowane, opłacalne i wysokoprzepustowe systemy hodowli in vitro, wykazały w ostatnich latach niezwykłe zalety w badaniach nad komórkami i neuronami 9,10. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, technologia mikroprzepływowa umożliwia precyzyjną regulację naprężeń ścinających płynu, gradientów stężeń i struktur przestrzennych, dzięki czemu ściśle symuluje autentyczne fizjologiczne i patologiczne mikrośrodowiska w celu promowania wzrostu, migracji, różnicowania i interakcji komórek 11,12,13,14. Oparte na mikrofluidyce modele uszkodzeń aksonalnych in vitro umożliwiają przedziałową hodowlę ciał i procesów komórek nerwowych poprzez polaryzację przestrzenną, zapewniając niezbędne narzędzie do badania wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów i ich adaptacji metabolicznych po urazie15,1, 6,17,18. Zapewnia kluczowe okno na to, jak neurony reagują na urazy, regulują procesy metaboliczne19 i promują regenerację aksonów20. Jednak istniejące platformy mikroprzepływowe do uszkodzeń aksonów i badań metabolicznych nadal stoją przed wyzwaniami, w tym niską wydajnością komórek neuronalnych, zmniejszoną dokładnością pomiarów metabolicznych i brakiem ustandaryzowanych procedur operacyjnych.
W odpowiedzi na te ograniczenia, w ramach tego badania opracowano nową, wielkoskalową platformę mikroprzepływową, która umożliwia standaryzowaną, wysokoprzepustową indukcję uszkodzenia aksonów i zapewnia wystarczającą ilość materiału komórkowego do podzielonych na przedziały analiz multiomicznych. Ten zintegrowany projekt bezpośrednio konfrontuje się z krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w badaniach nad uszkodzeniami neuronalnymi. W szczególności zaprojektowany przez nas chip mikroprzepływowy charakteryzuje się naprzemiennym układem komór somalnych i aksonalnych połączonych mikrorowkami, z transsekcją aksonalną osiągniętą poprzez kontrolowane zasysanie próżniowe. Takie podejście jest idealne do badań, które wymagają powtarzalnych, wysokoprzepustowych modeli uszkodzeń aksonów i precyzyjnego profilowania metabolicznego, takiego jak badanie mechanizmów metabolicznych leżących u podstaw regeneracji aksonów. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, technika ta oferuje wyższą przepustowość, większą precyzję metaboliczną i możliwość ustanowienia ustandaryzowanych modeli urazów. Na przykład wcześniejsze badania wykazały znaczenie transportu mitochondrialnego w regeneracji aksonów 20,21,22,23, podczas gdy nasza platforma dodatkowo ujawnia rolę metabolizmu glukozy w regeneracji aksonów po urazie. Protokół ten ustanawia system techniczny do aksotomii i analizy metabolicznej na dużą skalę, który jest zarówno weryfikowalny wizualnie, jak i znormalizowany operacyjnie.

<table><tbody><tr><td>Neurobasel-A Podłoże</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10888022</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysz</td><td>Invitrogen</td><td>A-21042</td><td>Immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Shanghai Shunyu Hengping Instrument Naukowy Co., Ltd.</td><td>FA1004 powiedział:</td><td>Precyzyjne ważenie odczynników/próbek</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>17504044</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Test białka BCA</td><td>Boster (Boster)</td><td>Zobacz materiał AR1189</td><td>Stężenia białka</td></tr><tr><td>Analizator biologiczny</td><td>Agilent</td><td>https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Widok genowy</td><td>FA016 powiedział:</td><td>Immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Mieszadło odśrodkowe</td><td>MYŚLEĆ</td><td>ARE-310 powiedział:</td><td>Mieszanie PDMS i odgazowanie</td></tr><tr><td>Analizator CLARIOstarPlus-ACU</td><td>BMG LABTECH</td><td>CLARIOstar Plus</td><td>Stężenia białka</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific (Asheville) Sp. z o.o.</td><td>3111</td><td>Inkubacja kultur komórkowych w temperaturze 37 ° C, 5% CO?</td></tr><tr><td>Odporna na korozję membranowa pompa próżniowa</td><td>Szanghaj Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.</td><td>LC-85DLC</td><td>Odessać zużytą ciecz i zapewnić ssanie do aksotomii</td></tr><tr><td>D-GLUCOSE (U-13C6, 99%)</td><td>Laboratoria Izotopowe w Cambridge</td><td>Zobacz materiał CLM-1396</td><td>Strumień metaboliczny</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>Platforma Dr.TOM2&nbsp;</td><td>BGI Genomika</td><td></td><td>Wykonywanie i analiza sekwencjonowania RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektryczny piec do suszenia gorącym powietrzem</td><td>BIOM Huahong Bonn / Huaying Bosi</td><td>DHG-9070A</td><td>Utwardzanie PDMS</td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Szanghaj Huachao Industrial Co., Ltd.</td><td>Zobacz materiał HC313</td><td>Rutynowe ważenie materiałów</td></tr><tr><td>Fluoromount Wodne medium montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F4680</td><td>Immunofluorescencji</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>35050061</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>Kontroler G8200</td><td>Immunofluorescencji</td></tr><tr><td>HBSS (Sieć HBSS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14025092</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14175095</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowy sterylizator parowy</td><td>STIK Instrument (Szanghaj) Co., Ltd.</td><td>HMJ-54A</td><td>Sterylizacja sprzętu i pożywek laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Komora hipoksyjna</td><td>Technologie STEMCELL</td><td>27310</td><td>Leczenie niedotlenienia</td></tr><tr><td>ObrazJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Służy do analizy obrazów mikroskopowych</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td>DMIL LED Fluo</td><td>Obserwacja na żywo i fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>A14291DJ</td><td>Obrazowanie żywych komórek</td></tr><tr><td>Medyczny pojemnik do przechowywania w niskiej temperaturze (-80 &deg; C)</td><td>Qingdao Haier Biomedical Co., Sp. z o.o.</td><td>DW-86L388J</td><td>Długotrwałe przechowywanie próbki w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>Mini biurkowa pompa próżniowa</td><td>Haimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td>GL-805</td><td>Zastosowania próżniowe na małą skalę</td></tr><tr><td>MitoTracker Pomarańczowy CMTMRos</td><td>Invitrogen</td><td>Zobacz materiał M7510</td><td>Barwienie potencjału błony mitochondrialnej</td></tr><tr><td>Program MRMPROBS</td><td></td><td>Wersja 2.60</td><td>Aby wyodrębnić surowe dane ze spektrometrii mas&nbsp;</td></tr><tr><td>Podłoże nerwowo-podstawowe</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>21103049</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Neurobaseal-A bez glukozy</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>A2477501</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P6148</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>PDMS (system zarządzania zasobami ludzkimi)</td><td>Dow Corning</td><td>Zobacz materiał DC184</td><td>Produkcja urządzeń</td></tr><tr><td>Fiolka z inhibitorem PDS Kit</td><td>Worthington</td><td>LK003182</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140122</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Ostrze biologiczne</td><td>BL302A</td><td>Rozcieńczyć substancje i oczyścić pojemniki na komórki</td></tr><tr><td>Czyścik plazmowy</td><td>Plazma Harricka</td><td>ODC-32G-2</td><td>Aktywacja</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P6407</td><td>Hodowla neuronów</td></tr><tr><td>Pryzmat&nbsp;</td><td>Podkładka graficzna</td><td>Wersja 8.4.3</td><td>Analizy statystyczne</td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf AG (Niemcy)</td><td>5430R</td><td>Rozdzielanie próbek w kontrolowanych temperaturach</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNArep Pure Cell/Bacterial Total RNA</td><td>Prowincja Tiangen</td><td>DP430 powiedział:</td><td>Transkryptomika</td></tr><tr><td>Rotametr</td><td>Dwyer</td><td>Przekaźnik RMA-23-SSV</td><td>Kontroluj niski przepływ tlenu</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Korporacja Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td>Obserwacja i analiza próbki</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Stuarta</td><td>Kylin-Bell powiedział:</td><td>TS-200 powiedział:</td><td>Mieszanie kultur komórkowych/roztworów z regulowaną prędkością</td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Silnik X100</td><td>Immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Rotacyjna łopatkowa pompa próżniowa ULVAC</td><td>ULVAC (Ningbo) Co., Sp. z o.o.</td><td>GLD-N202</td><td>Wytwarzanie próżni do filtracji/suszenia</td></tr><tr><td>&beta; III-tubulina</td><td>Preparat Promega</td><td>Zobacz materiał G7121</td><td>Immunofluorescencji</td></tr></tbody></table>

chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Microfluidic Chip for Axonal Injury Models Construction and Enabling Multi-Omics Analysis

Neurony polaryzują się, tworząc dendryty i aksony, umożliwiając komunikację międzykomórkową. Uszkodzenie aksonów przerywa te połączenia i przekazuje sygnały o uszkodzeniu do somy, często prowadząc do zwyrodnienia neuronów. Tak więc utrzymanie homeostazy aksonalnej jest niezbędne do promowania lokalnej regeneracji aksonów i ochrony przed neurodegeneracją. Proces ten opiera się na metabolizmie komórkowym w celu dostarczania energii i prekursorów biosyntezy i jest podtrzymywany przez mechanizmy regulujące równowagę metaboliczną i eliminujące produkty uboczne. Jednak metabolizm neuronalny jest podzielony między somę a akson i jest dodatkowo wpływany in vivo przez otaczające mikrośrodowisko, takie jak aktywność metaboliczna pochodząca z astrocytów (np. Wahadłowiec mleczanowy astrocytów-neuronów). Czynniki te komplikują badanie wewnętrznych mechanizmów metabolicznych neuronów. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do hodowli pierwotnych neuronów korowych in vitro , która zachowuje kluczowe cechy metaboliczne obserwowane in vivo, w tym fizjologiczny przepływ glikolityczny i oddychanie mitochondrialne. System ten zapewnia uproszczony model do badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej neuronów po uszkodzeniu aksonów. Konwencjonalne chipy mikroprzepływowe obsługują modele uszkodzeń aksonalnych in vitro i są kompatybilne z obrazowaniem żywych komórek, barwieniem immunofluorescencyjnym i leczeniem hipoksji. Aby umożliwić wielkoskalowe analizy transkryptomiczne i metabolomiczne obejmujące miliony komórek, zaprojektowaliśmy i wyprodukowaliśmy wysokowydajne chipy mikroprzepływowe ze zoptymalizowanymi protokołami operacyjnymi. Urządzenie posiada naprzemiennie ułożone komory somy i aksonów połączone mikrokanalikami, a uszkodzenie aksonów jest indukowane przez próżniowe zasysanie płynu z komory aksonowej. Platforma ta umożliwia szybką ocenę dynamiki metabolitów i enzymów, poprawiając dokładność i odtwarzalność badań multiomicznych.

Aby stworzyć kompleksową platformę badawczą do badania mechanizmów regulacji metabolicznej w neuronach korowych, najpierw wyhodowaliśmy neurony korowe w konwencjonalnym urządzeniu mikroprzepływowym, precyzyjnie kontrolując wzrost aksonów wzdłuż mikrokanałów (ryc. 2A). Dzięki odpowiedniej konstrukcji mikrokanały zostały zbudowane z małą wysokością (5 μm) i większą szerokością (10 μm), dzięki czemu każdy kanał może pomieścić więcej aksonów bez wpuszczania ciał ...

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Neurons polarize to form dendrites and axons, enabling intercellular communication. Axonal injury disrupts these connections and transmits damage signals ...

Opracowaliśmy wielkoskalowe chipy mikroprzepływowe, aby umożliwić analizę multiomiczną w celu zilustrowania mechanizmu metabolicznego neuronów po uszkodzeniu aksonów. Wykorzystujemy głównie technologię mikroprzepływową, analizę strumienia metabolicznego i transkryptomikę, aby posunąć naprzód badania nad mechanizmami metabolicznymi neuronów podczas uszkodzenia aksonów i regeneracji. Odkryliśmy, że istnieją różnice metaboliczne między neuronami korowymi w różnych chorobach rozwojowych i że młode neurony przechodzą przebudowę metaboliczną po urazie zewnętrznym.Główną zaletą naszego protokołu jest konstrukcja platformy mikroprzepływowej na większą skalę i standardy operacyjne, które umożliwiają dokładną multiomikę i rozmiar milionów komórek. Aby rozpocząć, przenieś bazę PDMS i utwardzacz do probówki wirówkowej. Umieścić probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w mieszadle odśrodkowym.Wirować przy 2 000 G przez cztery minuty dwa razy w celu wymieszania i odgazowania. Wlej od 13 do 15 gramów odgazowanego PDMS do formy mikroprzepływowej, upewniając się, że dno formy jest całkowicie zakryte. Teraz umieść formę w eksykatorze próżniowym, a następnie użyj pompy próżniowej do opróżniania powietrza przez pięć do 10 minut, aby dokładnie usunąć pęcherzyki z PDMS.Za pomocą gumowej gruszki delikatnie postukaj w powierzchnię PDMS, aby rozbić wszelkie pozostałe pęcherzyki na powierzchni. Przenieś formę do pieca konwekcyjnego i piecz w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 100 minut, aby utwardzić polidimetylosiloksan. Gdy PDMS jest w pełni utwardzony, delikatnie wsuń końcówkę skalpela pod krawędź PDMS, aby ostrożnie podnieść i oddzielić go od formy.Za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy od 2,0 do 2,5 milimetra utwórz otwory w PDMS do infuzji pożywki hodowlanej i ładowania komórek. Usuń wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe z PDMS za pomocą taśmy klejącej, a następnie umieść go w czystym szklanym naczyniu i owiń folią aluminiową do przechowywania. Przed eksperymentem należy autoklawować urządzenie mikroprzepływowe w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 101 kilopaskali przez pięć minut, aby zapewnić sterylność.Umieść szkiełko nakrywkowe przeznaczone do konwencjonalnych urządzeń mikroprzepływowych w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 milimetrów. Dodaj do naczynia dwa mililitry 0,1 miligrama na mililitr roztworu poli-D-lizyny. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin lub przez noc.Po inkubacji ostrożnie pobrać roztwór poli-D-lizyny w celu ponownego użycia lub właściwej utylizacji. Teraz dodaj do naczynia dwa mililitry sterylnej ultraczystej wody. Obróć go 50 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 50 razy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Zassać wodę za pomocą pompy próżniowej podłączonej do sterylnej końcówki pipety, zbierając odpady do pojemnika na odpady płynne. Po zakończeniu wszystkich prań, przed użyciem pozostaw szkiełka nakrywkowe do naturalnego wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą sterylnych kleszczyków z cienką końcówką umieść autoklawowany chip mikroprzepływowy na środku szklanej powierzchni z mikrokanalikami skierowanymi w dół.Delikatnie dociśnij chip do szklanej powierzchni za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zapewnić pełną przyczepność. Następnie zaznacz lewą komorę kropką za pomocą markera permanentnego, aby oznaczyć komorę soma. Odessać 10 mikrolitrów zawiesiny neuronalnej za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie powoli dozować zawiesinę do portu ładowania nad zaznaczoną komorą somy.Upewnij się, że płyn przepływa prawidłowo do dolnego zbiornika lewej komory. Przenieś naczynie hodowlane do nawilżonego inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 20 minut. Po inkubacji umieść szalkę pod mikroskopem 20X, aby potwierdzić obfitość pożywki z komory somy do komory aksonalnej przez mikrokanaliki.Teraz odpipetuj 150 mikrolitrów neuronalnej pożywki podstawowej do górnego portu przedziału aksonalnego. Podobnie dodaj 150 mikrolitrów kompletnej pożywki neuronalnej do górnego portu komory somy. Następnie wlej 20 mililitrów ultraczystej wody do 150-milimetrowego naczynia hodowlanego, aby utworzyć komorę wilgotnościową.Umieść 35-milimetrową naczynie hodowlane w dużym naczyniu, a następnie przenieś cały system hodowli do inkubatora i utrzymuj przez wymagany czas. Użyj szalki Petriego o szerokości 10 centymetrów do umieszczenia dużego urządzenia mikroprzepływowego. Wybierz rozsiewanie kanałów pełnokanałowych lub interwałowych w oparciu o potrzeby eksperymentalne, ponieważ każda metoda wymaga różnych protokołów uszkodzenia aksonów.Po zakończeniu wysiewu dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki do hodowli neuronów na szalkę Petriego, aby utrzymać wzrost neuronów. Przenieś odpowiednią ilość neuronalnej pożywki podstawowej do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej do późniejszego wykorzystania. Umieść urządzenie mikroprzepływowe zawierające neurony korowe na czystej ławce.Używając niestrzępiącego się papieru, osusz dno 35-milimetrowej naczynia hodowlanego, a następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zassać pożywkę z dwóch prawych bocznych otworów urządzenia mikroprzepływowego. Następnie podłącz rurkę pompy próżniowej do sterylnej, bezfiltrowej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Włącz pompę próżniową z szybkością ssania 60 litrów na minutę i skieruj końcówkę w punkt połączenia między dolnym otworem komory końcowej aksonu a komorą, aby zassać stare medium, powodując pęknięcie aksonu z powodu podciśnienia.Wymień końcówkę pipety i pobierz 150 mikrolitrów neuronalnej pożywki podstawowej, powoli dodając ją przez dolny otwór prawej komory. Po wykonaniu dodania i czterokrotnej aspiracji, zastąp je świeżą, kompletną pożywką neuronalną, a następnie odessaj starą pożywkę z bocznego otworu ciała komórki i w razie potrzeby dodaj świeżą, kompletną pożywkę neuronalną zawierającą leki. Umieść urządzenie mikroprzepływowe wraz z szalką hodowlaną w 150-milimetrowym naczyniu hodowlanym i kontynuuj hodowlę przez wymagany czas, np. 24 godziny.W przypadku ręcznego uszkodzenia aksonów należy umieścić neurony we wszystkich komorach wielkoskalowego urządzenia mikroprzepływowego. Inkubuj urządzenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżanym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy dni. W siódmym dniu in vitro wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane zawierające urządzenie mikroprzepływowe i umieścić je w sterylnym miejscu.Przygotuj mikroskop z 20-krotnym powiększeniem i wysterylizuj obszar roboczy za pomocą 75% etanolu. Trzymaj sterylną końcówkę pipety z filtrem o pojemności 10 mikrolitrów i zidentyfikuj wiązki aksonów w oryginalnych mikrokanalikach pod kierunkiem mikroskopu. Wykonaj podłużne zadrapania wzdłuż każdej wiązki aksonów za pomocą końcówki pipety.Obserwuj pękanie aksonów pod mikroskopem w czasie rzeczywistym. Mikrokanaliki standardowego urządzenia mikroprzepływowego pozwalają na wzrost aksonów, ale nie somy, co zostało potwierdzone przez barwienie tubuliną beta 3 po siedmiu dniach in vitro. Gęstość neuronów nie wykazała znaczącej różnicy po uszkodzeniu aksonów, co wskazuje na brak obserwowalnej śmierci neuronów.Do analiz multiomicznych opracowano wielkoskalowe urządzenie mikroprzepływowe o trójwymiarowej konstrukcji z możliwością rozbudowy. Zarówno nieperforowane, jak i perforowane repliki PDMS bezpiecznie przylegały do 10-centymetrowych czasz lub płytek PC. Uszkodzenie aksonów wywołane drapaniem końcówki pipety doprowadziło do wyraźnie odciętych aksonów o zaburzonej morfologii, w przeciwieństwie do nienaruszonych aksonów przed uszkodzeniem.Regenerację aksonów obserwowano zarówno po sześciu godzinach, jak i 24 godzinach po urazie, podczas gdy nieuszkodzone aksony pozostawały stabilne. Stężenie białek neuronalnych znacznie wzrosło z 1420,4 mikrogramów na mililitr na początku badania do 1748,9 na mililitr po sześciu godzinach i 1823,7 mikrogramów na mililitr po 24 godzinach od urazu. Wydajność RNA z grup kontrolnych i uszkodzonych aksonów była prawie identyczna.Sekwencjonowanie RNA ujawniło 595 genów specyficznych dla obrażeń i 609 genów specyficznych dla kontroli, z 17 471 genami wspólnymi dla grup. Analiza szlaku KEGG wykazała znaczącą regulację w górę fosforylacji oksydacyjnej, odpowiedzi reaktywnych form tlenu, autofagii i szlaków cyklu TCA po urazie.

microfluidic-chip-for-axonal-injury-models-construction-enabling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

Niniejszy film opisuje wytwarzanie i zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Urządzenie to jest kompatybilne z...

BioMEMS: nawiązywanie nowych współprac pomiędzy biologami a inżynierami

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i hodowli mikrośrodowiska przerzutowego guza bariery krew-mózg, a następnie ilościowego określenia jego stanu za pomocą obrazowania konfokalnego i sztucznej inteligencji (uczenia maszynowego).

Kwantyfikacja mikrośrodowiska guza z przerzutami do mózgu za pomocą modelu 3D Organ-On-A Chip, uczenia maszynowego i tomografii konfokalnej

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Poznaj mikroprzepływową platformę do analizy multiomicznej neuronów po uszkodzeniu aksonalnym. Metoda umożliwia badanie przebudowy metabolicznej młodych neuronów korowych z wykorzystaniem transkryptomiki i analizy strumienia metabolicznego.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Przeglądaj więcej filmów