Name: Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj ocenę interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia jelita grubego. Ta metoda umożliwia testowanie nowych leków na chorobę Leśniowskiego-Crowna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te są wspierane przez placówkę opieki nad zwierzętami w BC Children's Hospital Research Institute oraz finansowanie z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada poprzez Canadian Glycomics Network (GlycoNet, Sieć Centrum Doskonałości) oraz Canadian Institutes of Health Research (MOP-133607 do LS). K.S. i W.M. są laureatami stypendiów doktoranckich TRIANGLE (TRaIning a New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr).

Badania dotyczące zwierząt powinny być przeprowadzane zgodnie z protokołami etycznymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz zgodnie z Wytycznymi Krajowych Rad Badawczych dotyczących opieki nad zwierzętami. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w tym protokole były zgodne z wytycznymi etycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej (protokół A21-0212).
UWAGA: Aby ocenić terapeutyczny wpływ leku na patologię jelit myszy SHIP-/-, należy uwzględnić SHIP+/+ jako zdrowe kontrolne składniki do porównania. W przypadku interwencji terapeutycznej rozpocznij leczenie w wieku 6 tygodni, gdy choroba jest już w pełni ugruntowana w modelu. Tutaj zarówno myszy SHIP+/+, jak i SHIP-/- otrzymywały codzienną doustną dawkę deksametazonu w dawce 3 mg/kg w dawce 0,5% β-cyklodekstryny (pojazd) lub samemu postrojowi przez 2 tygodnie, w objętości 10 μL/g.
1. Test FITC-dekstran do pomiaru przepuszczalności bariery nabłonkowej
<ol>
	<li>Szybkie myszy przez 4 godziny przed badaniem.</li>
	<li>Rozpuścić 4 kDa FITC-dekstranu w sterylnym 1x PBS do końcowego stężenia 80 mg/mL.</li>
	<li>Przygotuj wystarczająco dużo na 150 μL na mysz, plus 50 μL więcej na standardową krzywą. UWAGA: Minimalizuj ekspozycję na światło roztworu FITC-dekstranu oraz próbek plazmy podczas całego zabiegu.</li>
	<li>Delikatnie unieruchom (skarż) każdą mysz i podaj 150 μL roztworu FITC-dekstranu za pomocą doustnej gavage. UWAGA: Rozpocznij timer zaraz po podaniu pierwszego gavage. Czekaj 10-15 minut między kolejnymi myszami, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na przeprowadzenie eutanazji i dalszych procedur w sposób stopniowy, minimalizując zmienność wynikającą z różnic czasowych.</li>
	<li>Trzymaj myszy bez jedzenia przez 4 godziny.</li>
	<li>Uśpienie myszy przy użyciu izofluranu 5% (znieczulenie wziewne podawane z 1,5 litra tlenu/min), a następnie dwutlenku węgla zgodnie ze standardową procedurą instytucjonalną. Pobieranie krwi poprzez nakłucie serca za pomocą igieł 25 g i 1 ml strzykawek.</li>
	<li>Natychmiast należy dodać 10 μL roztworu kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowego do każdego 100 μL pobranej krwi jako środek przeciwzakrzepły. Dokładnie mieszaj przez inwersję.</li>
	<li>Wiruj w 1500 x g przez 10 minut w 4 °C i ostrożnie przelej plazmę (supernatant) do oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 1,7 mL. Trzymaj próbki na lodzie i chronione przed światłem do czasu analizy.</li>
	<li>Każdą próbkę plazmy rozcieńcz w proporcjach 1:2 i 1:10 za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 100 μL każdego rozcieńczenia do nieprzezroczystej płyty 96-dołkowej w duplikatach.</li>
	<li>Wykonaj rozcieńczenia seryjne 1:2 oryginalnego zapasu FITC-dekstrów o masie 80 mg/mL przy użyciu 1x PBS, aby uzyskać następujące stężenia: 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,8, 46,9, 23,4 oraz 0 ng/mL. Dodaj 100 μL każdego stężenia do płytki z 96 dołkami w duplikacie.</li>
	<li>Zmierz fluorescencję przy wzbudzeniu 485 nm i emisji 535 nm za pomocą czytnika mikropłyt.</li>
</ol>
2. Ocena patologiczna ogólna
<ol>
	<li>Po pobraniu krwi do testu FITC-dekstern, ostrożnie wyciąć całe jelito cienkie.</li>
	<li>Delikatnie usuń przymocowany tłuszcz i tkankę łączną. UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z tkanką, ponieważ chore obszary mogą być delikatne i podatne na pękanie.</li>
	<li>Połóż jelito płasko na arkuszu czystego białego papieru dla maksymalnego kontrastu. Wizualnie obejrzyj tkankę pod kątem makroskopowych oznak choroby. Stan zapalny jest zazwyczaj lokalizowany w dalszej części jelita cienkiego na odległość 10 cm u myszy SHIP-/-. UWAGA: Kluczowe cechy makroskopowe do oceny to zmiany koloru, w których obszary wykazują widoczne zaczerwienienie lub hiperemię w porównaniu do sąsiedniej tkanki o normalnym wyglądzie. Dodatkowo sprawdź pogrubienie tkanek, ponieważ dotknięte obszary mogą wyglądać na opuchnięte, obrzęknięte lub sztywne po delikatnym dotyku. Zwracaj uwagę na obecność krwi, która może pojawiać się jako widoczne krwotoczne plamy, ciemnoczerwone przebarwienia lub przylegająca krew.</li>
	<li>Ustaw jelito obok linijki dla skali i zrób zdjęcie, aby udokumentować ogólne wyniki patologiczne.</li>
</ol>
3. Ocena histologiczna
<ol>
	<li>Usuń zawartość jelit, delikatnie przepłukując lumen 1x PBS za pomocą strzykawki. Nie wywieraj zbyt dużej siły na tkankę, ponieważ może to zniekształcić strukturę kosmków i krypt.</li>
	<li>Zidentyfikuj i pobierz około 1 cm dalszej części jelita jelenia, która najlepiej odzwierciedla ogólną patologię. Uwzględnij widoczne obszary dotknięte, jeśli występują. Do porównań (SHIP+/+ vs. SHIP-/-) upewnij się, że tkanki są pobierane z dopasowanych pozycji anatomicznych. UWAGA: Do wstępnej oceny skuteczności leczenia zaleca się przygotowanie jelita jelewego jako rolka szwajcarska. Ta metoda zapewnia globalną wizualizację chorób i zmniejsza błędy próbkowe.</li>
	<li>Ułóż tkankę płasko w kasecie histologicznej, umieszczając ją między gąbkami, aby zapobiec złożeniu.</li>
	<li>W przypadku barwienia trójchromowego hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz trójbarwnego barwienia Massona należy utrwalić tkankę na noc w 10% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 °C, używając co najmniej 10-20 razy większej objętości tkanki (około 5 mL na kasetę) i dbając o pełne zanurzenie. Przelewaj kasety do 70% etanolu do przechowywania, utrzymując je całkowicie zanurzone aż do przetworzenia. UWAGA: 10% formalina, utrwalacz zawierający 3,7% formaldehydu, jest silnym drażniącym czynnikiem oddechowym, uczulającym na skórę i jest klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Wdychanie, połknięcie lub kontakt ze skórą może powodować ostrą toksyczność, podczas gdy przewlekła ekspozycja może zwiększać ryzyko nowotworów. Wszystkie procedury z udziałem formaliny powinny być wykonywane w certyfikowanym okapie chemicznym, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), w tym fartucha laboratoryjnego, rękawiczek odpornych na chemikalia oraz ochrony oczu. Zbieraj odpady w pojemnikach wyraźnie oznaczonych jako "Odpady formalinowe" w celu właściwej utylizacji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Wszystkie materiały skażone formaliną (np. końcówki pipet, chusteczki, rękawiczki) powinny być traktowane jako chemicznie niebezpieczne odpady i wyrzucane zgodnie z lokalnymi procedurami Ochrony Środowiska i Bezpieczeństwa (EHS).</li>
	<li>W przypadku barwienia błękitu alcjanskiego/PAS utrwalaj tkankę w roztworze Carnoya (60% etanolu, 30% chloroformu i 10% kwasu octowego lodowca) w temperaturze 4 °C przez noc, używając około 5 mL na kasetę, czyli 10-20 razy większą objętość tkanki. Przenieś kasety do 100% etanolu do przechowywania aż do przetworzenia. UWAGA: Roztwór Carnoya składa się z 60% etanolu, 30% chloroformu i 10% kwasu octowego glacjalnego. Ta mieszanina jest wysoce lotna, łatwopalna i toksyczna. Roztwór Carnoy należy przechowywać wyłącznie w okapie i przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach, z dala od źródeł ciepła lub zapłonu. Odpady Carnoy's powinny być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na mieszane rozpuszczalniki organiczne i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Wszystkie materiały skażone roztworem Carnoya powinny być traktowane jako chemicznie niebezpieczne odpady.</li>
	<li>Osadz tkanki w parafinie i wycinaj przekroje o wymiarach 5 μm do barwienia.</li>
	<li>Oceniaj przekroje brzęczne barwione H&E w skali 16-punktowej zgodnie z kryteriami z Tabeli 1. Ostateczny wynik uszkodzeń histologicznych ustalany jest na podstawie uśredniania wyników od dwóch recenzentów, którzy są ślepi na warunki eksperymentalne.</li>
	<li>Oceń trójbarwne przekroje poprzeczne Masson, używając skali 6-punktowej na podstawie kryteriów z Tabeli 2. Ostateczny wynik z włóknieniem obliczany jest jako mediana wyników przydzielonych przez dwóch niezależnych recenzentów nieświadomych warunków eksperymentalnych.</li>
</ol>
4. Ocena cytokinowa
<ol>
	<li>Po sekcji i usunięciu próbki histologicznej pobierz pozostałą część dystalnego 10 cm jelita krętego.</li>
	<li>Osusz tkankę i zapisz wagę. Szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania.</li>
	<li>Gdy są gotowe do obróbki, pobierz tkankę i trzymaj ją na lodzie przez cały czas.</li>
	<li>Zważ próbki tkanek. Przygotuj wystarczający bufor homogenizacyjny dla wszystkich próbek, dodając inhibitory proteazy do 1x PBS (aprotynina i leupeptyna, każdy w dawce 10 μg/mL). Użyj 10 μL buforu na mg tkanki (np. 100 mg tkanki wymaga 1 mL buforu). UWAGA: Bufor homogenizacyjny musi być przygotowany świeżo w dniu homogenizacji, aby zapewnić skuteczność inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Homogenizuj pełnogrubą tkankę jelita w lodowatym buforze homogenizacyjnym za pomocą homogenizatora laboratoryjnego. Upewnij się, że ujednolicenie jest jednolite i wolne od widocznych fragmentów tkanek. Dokładnie opłucz końcówkę homogenizatora PBS między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
	<li>Wiruj tkankę w 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oczyszczone supernatanty są aliquotowane, aby uniknąć cykli zamarzania i rozmrażania oraz przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.</li>
	<li>Wykonaj enzymatyczne immunosorbentne testy (ELISA) na oczyszczonych supernatantach w celu ilościowego określenia cytokin zainteresowanych tematem, zgodnie z instrukcjami producenta. UWAGA: Gęstość optyczna na 450 nm została zmierzona za pomocą czytnika mikropłyt Varioskan LUX z oprogramowaniem Skanlt RE 7.0.2, z długością fali odniesienia 570 nm do korekcji. Do analizy danych użyto Microsoft Excel, a wartości absorpcji w zakresie liniowym krzywej standardowej zostały interpolowane w celu określenia stężeń cytokin.</li>
</ol>

<ol><li>Khor, B., Gardet, A., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474 (7351), 307-317 (2011).</li>
<li>Ng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+incidence+and+prevalence+of+inflammatory+bowel+disease+in+the+21st+century%3A+a+systematic+review+of+population-based+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies.</a> Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).</li>
<li>Wang, R., Li, Z., Liu, S., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional+and+national+burden+of+inflammatory+bowel+disease+in+204+countries+and+territories+from+1990+to+2019%3A+a+systematic+analysis+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Global, regional and national burden of inflammatory bowel disease in 204 countries and territories from 1990 to 2019: a systematic analysis based on the Global Burden of Disease Study 2019.</a> BMJ Open. 13 (1), e065186(2023).</li>
<li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Guan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+and+update+on+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review and update on the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> J Immunol Res. 2019, 7247238(2019).</li>
<li>Chang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of inflammatory bowel diseases.</a> N Engl J Med. 383 (27), 2652-2664 (2020).</li>
<li>Graham, D. B., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+paradigms+revealed+from+the+genetics+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathway paradigms revealed from the genetics of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 578 (7796), 527-539 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+fibrostenosing+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of fibrostenosing Crohn's disease.</a> Transl Res. 209, 39-54 (2019).</li>
<li>Rieder, F., Mukherjee, P. K., Massey, W. J., Wang, Y., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+IBD%3A+from+pathogenesis+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in IBD: from pathogenesis to therapeutic targets.</a> Gut. 73 (5), 854-866 (2024).</li>
<li>D'Alessio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+fibrosis+in+inflammatory+bowel+disease%3A+the+gut+thickens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Revisiting fibrosis in inflammatory bowel disease: the gut thickens.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (3), 169-184 (2022).</li>
<li>Louis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+Crohn%27s+disease+according+to+the+Vienna+classification%3A+changing+pattern+over+the+course+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Behaviour of Crohn's disease according to the Vienna classification: changing pattern over the course of the disease.</a> Gut. 49 (6), 777-782 (2001).</li>
<li>Iliopoulou, L., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+murine+models+of+Crohn%27s+disease+ileitis+to+advance+concepts+of+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing murine models of Crohn's disease ileitis to advance concepts of pathophysiology and treatment.</a> Mucosal Immunol. 15 (1), 10-26 (2022).</li>
<li>Rivera-Nieves, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+perianal+fistulizing+disease+in+the+SAMP1%2FYitFc+mouse%2C+a+spontaneous+model+of+chronic+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis.</a> Gastroenterology. 124 (4), 972-982 (2003).</li>
<li>Pizarro, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMP1%2FYitFc+mouse+strain%3A+a+spontaneous+model+of+Crohn%27s+disease-like+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis.</a> Inflamm Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).</li>
<li>Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+on%2Foff+regulation+of+TNF+biosynthesis+in+mice+lacking+TNF+AU-rich+elements%3A+implications+for+joint+and+gut-associated+immunopathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies.</a> Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).</li>
<li>Steiner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF%CE%94ARE+mouse+as+a+model+of+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The TNFΔARE mouse as a model of intestinal fibrosis.</a> Am J Pathol. 193 (8), 1013-1028 (2023).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of intestinal fibrosis.</a> Methods Mol Biol. 2299, 385-403 (2021).</li>
<li>Pauls, S. D., Marshall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+cell+signaling+by+SHIP1%3A+a+phosphatase%2C+scaffold+protein%2C+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune cell signaling by SHIP1: a phosphatase, scaffold protein, and potential therapeutic target.</a> Eur J Immunol. 47 (6), 932-945 (2017).</li>
<li>McLarren, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP-deficient+mice+develop+spontaneous+intestinal+inflammation+and+arginase-dependent+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">SHIP-deficient mice develop spontaneous intestinal inflammation and arginase-dependent fibrosis.</a> Am J Pathol. 179 (1), 180-188 (2011).</li>
<li>Kerr, W. G., Park, M. Y., Maubert, M., Engelman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+deficiency+causes+Crohn%27s+disease-like+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">SHIP deficiency causes Crohn's disease-like ileitis.</a> Gut. 60 (2), 177-188 (2011).</li>
<li>Ngoh, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+SHIP%2C+which+prevents+expression+of+interleukin+1%CE%B2%2C+is+reduced+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 150 (2), 465-476 (2016).</li>
<li>Fernandes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP1+deficiency+in+inflammatory+bowel+disease+is+associated+with+severe+Crohn%27s+disease+and+peripheral+T+cell+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">SHIP1 deficiency in inflammatory bowel disease is associated with severe Crohn's disease and peripheral T cell reduction.</a> Front Immunol. 9, 9(2018).</li>
<li>Ma, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bespoke+plant+glycoconjugates+for+gut+microbiota-mediated+drug+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bespoke plant glycoconjugates for gut microbiota-mediated drug targeting.</a> Science. 388 (6706), 1410-1416 (2025).</li>
<li>Park, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+T-cell+survival+promotes+mucosal+inflammatory+disease+in+SHIP1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impaired T-cell survival promotes mucosal inflammatory disease in SHIP1-deficient mice.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1429-1439 (2014).</li>
<li>Tsai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive%2C+flow+cytometry-based+measurement+of+intestinal+permeability+in+models+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive, flow cytometry-based measurement of intestinal permeability in models of experimental colitis.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 425-438 (2023).</li>
<li>Lo, Y., Sauve, J. P., Menzies, S. C., Steiner, T. S., Sly, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+p110%CE%B4+drives+intestinal+fibrosis+in+SHIP+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase p110δ drives intestinal fibrosis in SHIP deficiency.</a> Mucosal Immunol. 12 (5), 1187-1200 (2019).</li>
<li>Sellon, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+enteric+bacteria+are+necessary+for+development+of+spontaneous+colitis+and+immune+system+activation+in+interleukin-10-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice.</a> Infect Immun. 66 (11), 5224-5231 (1998).</li>
<li>Taurog, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germfree+state+prevents+development+of+gut+and+joint+inflammatory+disease+in+HLA-B27+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats.</a> J Exp Med. 180 (6), 2359-2364 (1994).</li>
<li>Dobranowski, P. A., Tang, C., Sauvé, J. P., Menzies, S. C., Sly, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+changes+to+the+ileal+microbiome+precede+the+onset+of+spontaneous+ileitis+in+SHIP-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Compositional changes to the ileal microbiome precede the onset of spontaneous ileitis in SHIP-deficient mice.</a> Gut Microbes. 10 (5), 578-598 (2019).</li>
<li>Robertson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-housing+and+littermate+methods+for+microbiota+standardization+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-housing and littermate methods for microbiota standardization in mouse models.</a> Cell Rep. 27 (6), 1910-1919.e2 (2019).</li>
<li>Goodman, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+estrogen-mediated+immunoprotection+underlies+female+gender+bias+in+experimental+Crohn%27s-like+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of estrogen-mediated immunoprotection underlies female gender bias in experimental Crohn's-like ileitis.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1255-1265 (2014).</li>
<li>Org, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+and+hormonal+effects+on+gut+microbiota+composition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Sex differences and hormonal effects on gut microbiota composition in mice.</a> Gut Microbes. 7 (4), 313-322 (2016).</li>
<li>Helgason, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+SHIP+leads+to+hemopoietic+perturbations%2C+lung+pathology%2C+and+a+shortened+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of SHIP leads to hemopoietic perturbations, lung pathology, and a shortened life span.</a> Genes Dev. 12 (11), 1610-1620 (1998).</li>
<li>Boyapati, R., Satsangi, J., Ho, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Crohn's disease.</a> F1000Prime Rep. 7, 44(2015).</li>
<li>Mizoguchi, E., Low, D., Ezaki, Y., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+updates+on+the+basic+mechanisms+and+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+diseases+in+experimental+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Intest+Res%22%5BJournal%5D)">Recent updates on the basic mechanisms and pathogenesis of inflammatory bowel diseases in experimental animal models.</a> Intest Res. 18 (2), 151-167 (2020).</li>
<li>Koboziev, I., Karlsson, F., Zhang, S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+intervention+studies+using+mouse+models+of+the+inflammatory+bowel+diseases%3A+translating+preclinical+data+into+new+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological intervention studies using mouse models of the inflammatory bowel diseases: translating preclinical data into new drug therapies.</a> Inflamm Bowel Dis. 17 (6), 1229-1245 (2011).</li>
<li>Raftery, A. L., Pattaroni, C., Harris, N. L., Tsantikos, E., Hibbs, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+inflammatory+factors+influencing+concurrent+gut+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and inflammatory factors influencing concurrent gut and lung inflammation.</a> Inflamm Res. 73 (12), 2123-2139 (2024).</li>
<li>Maxwell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+segregation+of+inflammatory+lung+disease+and+autoimmune+disease+severity+in+SHIP-1-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic segregation of inflammatory lung disease and autoimmune disease severity in SHIP-1-/- mice.</a> J Immunol. 186 (12), 7164-7175 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Protokół ten określa procedury oceny zapalenia jelita i włóknienia jelit u myszy SHIP-/-, mysiego modelu zapalenia jelit podobnego do CD, z towarzyszącą patologią włóknistą. Model myszy SHIP-/- odtwarza cechy CD, które rzadko występują w innych mysich modelach zapalenia jelit, w szczególności lokalizację jelita podstępnego, plamy i przezmuralne oraz patologię włóknistą19,26. W połączeniu z łatwością hodowli i krótkim czasem do pojawienia się choroby, model SHIP-/- jest dobrze pozycjonowany jako potężne narzędzie badań translacyjnych wcyklu 19 cyklu.
W tym badaniu oceniono istotność statystyczną dla testu FITC-dextran oraz oceny histologicznej za pomocą testu Kruskal-Wallis, ponieważ te zbiory danych nie spełniały założeń normalności wymaganych dla jednokierunkowej ANOVA, a oceny histologiczne reprezentują zmienne nieciągłe, nieparametryczne. Chociaż nasze analizy nie wykazały statystycznie istotnych różnic między grupami leczonymi deksametazonem a leczonymi pojazdem, zaobserwowaliśmy wyraźne trendy. Deksametazon zmniejszał przepuszczalność jelit i histopatologię myszy SHIP-/-, a efekty te mogły osiągnąć istotność przy większych próbkach.
Przy realizacji tego protokołu mogą pojawić się liczne wyzwania techniczne. Jeśli chodzi o kontakt z tkankami, SHIP-/- ilea wymagają delikatnej manipulacji podczas sekcji, ponieważ są podatne na pękanie. Jest to szczególnie ważne przy przygotowywaniu tkanek do obrazowania grubego. Utrwalanie tkanek jest kolejnym kluczowym czynnikiem w analizie histologicznej. Tkanka utrwalona formaliną nadaje się zarówno do barwienia trójchromowego H&E, jak i Masson, ale jest niekompatybilna z barwieniem Alcian Blue/PAS. Natomiast tkanka utrwalona Carnoya nadaje się do barwienia H&E i Alcian Blue/PAS, ale nie do barwienia trójchromowego Massona. Fiksacja Carnoya prowadzi do intensywnego i rozproszonego ciemnoniebieskiego przebarwienia, które zaciemnia wizualizację kolagenu i warstw mięśniowych. Do analizy cytokinowej niezbędne jest przetwarzanie próbek na lodzie, ponieważ cytokiny są bardzo wrażliwe na degradację. Kluczowe jest, aby aliquot ujednolicił się bezpośrednio po przetworzeniu. Powtarzające się cykle zamrożenia i rozmrażania mogą znacząco ograniczyć integralność cytokin i podważyć potencjalne różnice między genotypami i/lub grupami leczonymi. Na koniec, aby zapewnić dokładną ilościfikację, zalecamy wielokrotne rozcieńczanie każdej próbki, aby potwierdzić, że odczyty mieszczą się w liniowym zakresie standardowej krzywej testu oraz zminimalizować potencjalne zakłócenia ze strony złożonej matrycy tkankowej. Uwzględnienie tych technicznych kwestii jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych i interpretowalnych wyników, ale biologiczna zmienność inherentna dla myszy SHIP-/- musi być również starannie zarządzana.
Istnieje kilka kluczowych aspektów myszy SHIP-/-, które należy również wziąć pod uwagę i starannie kontrolować, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować zmienne zakłócające. Mikrobiom jelitowy ma głęboki wpływ na rozwój choroby i odpowiedzi terapeutyczne w modelach włobrzymionego jelita mysich27,28. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że zapalenie jelit u myszy SHIP-/- jest zależne od mikrobioty i można go złagodzić antybiotykami29. Dlatego należy stosować kontrolę dla rodzeństwa miotu, aby zmniejszyć zmienność wywołaną przez mikrobiom, a grupy leczenia muszą być zrównoważone dla30 punktów pochodzenia w klatce. Ponadto niezbędna jest staranna dopasowywanie płci. Chociaż u myszy SHIP-/- nie zaobserwowano różnic płciowych w penetrancji ani nasileniu choroby, inne modele zapalenia krętoruchu, takie jak SAMP1/YitFc, wykazują wcześniejszy początek i zwiększoną ciężkość choroby u kobiet14,31. Ponieważ hormony płciowe mogą również modulować skład mikroorganizmów32, dopasowanie płci jest kluczowe, aby zminimalizować potencjalne zakłócenia w badaniach terapeutycznych. Ponadto indywidualne leczenie oceniane może wykazywać różną skuteczność u samców i samic myszy. Chociaż obecne wyniki nie wykazują różnic związanych ze płcią w chorobach ani odpowiedzi terapeutycznej na deksametazon, dopasowanie płci powinno być przeprowadzane we wszystkich badaniach terapeutycznych.
Oprócz wspomnianych powyżej kwestii mikrobiomu i płci, ważne jest uwzględnienie myszy SHIP+/+ w badaniach terapeutycznych, aby ocenić działanie pojazdu i środków terapeutycznych w przypadku braku zapalenia jelit. Zapewnia to, że ani lek, ani sposób podawania nie powodują ani nie przyczyniają się do patologii zdrowego jelita, co poprawia interpretację skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa.
Termin interwencji leczeń jest również istotny i powinien być dostosowany do celów eksperymentalnych, ponieważ u myszy występują istotne różnice zarówno w stanie zapalnym, jak i włóknieniu, w wieku19, 26 lat. SHIP-/- myszy rozwijają zapalenie jelit już w wieku 4 tygodni, przy czym wszystkie myszy wykazują stan zapalny do 6. tygodnia życia, a markery patologii włóknistej można mierzyć już w wieku 6 tygodni i są dobrze ustalone w wieku 8 tygodni życia, 19,26 lat. Dlatego leczenie ukierunkowane na zapalenie jelita jelita powinno rozpocząć się w wieku 6 tygodni życia. Interwencje przeciwfibrotyczne mogą być rozpoczęte profilaktycznie w 6. tygodniu lub terapeutycznie między 8. a 10. tygodniem. Jednak początek i nasilenie choroby mogą się różnić w zależności od środowiska mikrobiologicznego, które różni się w zależności od placówek. Badacze muszą najpierw określić kinetykę choroby w swojej kolonii, zanim wdrożą protokoły leczenia. Dodatkowo, myszy SHIP-/- mogą wykazać nawet 17% spadku masy ciała w ciągu 4-5 tygodni, a kolejne 5% do 8-10 tygodni33. Zwierzęta wykazujące znaczną utratę masy ciała powinny być wyłączone z badań, ponieważ świadczy to o ciężkim przejawie choroby i może zaszkodzić efektom leczenia związanym z patologią jelit.
Ważnym aspektem przy analizie postępu choroby w modelu SHIP-/- jest wybór odpowiednich markerów zapalnych. Na podstawie naszego bogatego doświadczenia z myszą SHIP-/-, profilowanie cytokin koncentruje się zazwyczaj na konkretnych mediatorach, takich jak IL-1β, które są znane z podwyższonej aktywności podczas postępu choroby. Jednak do początkowej charakterystyki odpowiedzi zapalnych lub przy ocenie nowych strategii terapeutycznych zaleca się multipleksową analizę cytokinową. Takie bezstronne podejście umożliwia szersze profilowanie środowiska zapalnego i może ujawnić nieoczekiwane cele istotne dla patogenezy choroby lub odpowiedzi na leczenie.
Model myszy SHIP-/- oferuje praktyczne zalety umożliwiające powtarzalność i efektywność. SHIP-/- myszy rozwijają spontaniczne i stałe zapalenie jelita jelita oraz włóknienie bez potrzeby stosowania zewnętrznych czynników. Eliminuje to zmienność związaną z przygotowaniem odczynników oraz niestandaryzowane protokoły dawkowania przy wywoływaniu zapalenia jelit. Rozpoczęcie choroby jest szybkie, z objawami zapalnymi widocznymi w wieku 4-6 tygodni, a włóknieniem w wieku 8 tygodni, co czyni model zarówno efektywnym czasowo, jak i kosztownie. Dodatkowo, myszy SHIP-/- są łatwe w hodowli i utrzymaniu, genotypowanie jest proste, a nie wymagają specjalistycznych strategii hodowlanych. Upraszcza to zarządzanie kolonią, zmniejsza obciążenie techniczne i zmniejsza ryzyko wprowadzenia niezamierzonej zmienności genetycznej 19,21,26. Chorobę można wiarygodnie oceniać za pomocą szeroko dostępnych technik w większości środowisk badawczych, w tym testu FITC-dekstern, trójchromatycznego barwienia H&E i Massona oraz ELISA. Te połączone cechy wspierają efektywne projektowanie badań, obniżają bariery finansowe i techniczne oraz promują spójne generowanie danych między laboratoriami.
Chociaż model SHIP-/- oferuje unikalne zalety, ma on również swoje ograniczenia. Jak wszystkie modele przedkliniczne, nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożonej, wieloczynnikowej natury ludzkiego IBD, na którą wpływają czynniki genetyczne, immunologiczne i środowiskowe34. Modele DSS i TNBS pozostają szeroko popularne dzięki swojej prostocie i opłacalności. W połączeniu z modyfikacjami genetycznymi, te modele chemiczne mogą służyć jako skuteczne narzędzia do zrozumienia wkładu specyficznego dla genów w funkcjonowanie bariery35. Jednak ich główną użytecznością jest modelowanie ostrych uszkodzeń nabłonka; nie oddają one przewlekłej patologii immunologicznej charakteryzującej CD oraz mechanizmu uszkodzenia nabłonka wywołanego przez substancje chemiczne, które nie mają bezpośredniego znaczeniaklinicznego 36. Wyłączne poleganie na jednym modelu może skutkować niepełną i/lub mylącą oceną potencjału terapeutycznego, dlatego zaleca się stosowanie wielu modeli, aby mieć pewność skuteczności leczenia.

Dwa główne typy zapalnych chorób jelit (IBD) to choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) oraz wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), które charakteryzują się przewlekłym zapaleniem przewodu pokarmowego, które może nastąpić po nawrotach z remitentem lub postępującymprzebiegiem 1. Chociaż IBD historycznie była uznawana za chorobę krajów zwesternizowanych, jej częstość występowania szybko rośnie w krajach rozwijających się w Ameryce Południowej, Azji i Afryce2. Równocześnie rozpowszechnienie nadal rośnie w Ameryce Północnej, Europie i Australii, z niemal 50% wzrostem zarówno zachorowalności, jak i częstości występowania w latach 1990–2019, co podkreśla rosnące globalne obciążenie zdrowotne IBD 2,3. Pomimo znacznych badań naukowych, przyczyna IBD pozostaje nieznana. Obecne dowody wskazują na złożoną interakcję między podatnością genetyczną, dysfunkcją układu odpornościowego a czynnikami środowiskowymi, w tym zmianami w mikrobiomie 4,5.
Istnieją istotne różnice między CD a UC. W UC zapalenie jest ograniczone do jelita grubego i charakteryzuje się ciągłym zaangażowaniem ograniczonym do warstwy śluzowej 6,7. Natomiast CD charakteryzuje się nieciągłym i przezmuralnym zapaleniem, które może dotyczyć dowolnej części przewodu pokarmowego, najczęściej w końcowym jelicie krętym 6,7. Charakterystycznym powikłaniem CD jest włóknienie jelit, które przyczynia się do powstawania zwężeń i niedrożności jelit8. Włóknienie definiuje się poprzez nadmierne odkładanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, oraz pogrubienie warstw mięśni jelit 9,10. Około 30% osób z chorobą księżną rozwija chorobę zwężające w ciągu 10lat od diagnozy. Obecnie żadna terapia nie celuje bezpośrednio w zwłóknienie, co jest niezaspokojoną potrzebą kliniczną, którą można rozwiązać za pomocą odpowiednich modeli przedklinicznych do badania tego powikłania 9,12.
Aby lepiej zrozumieć patogenezę IBD i ułatwić rozwój nowych terapii, opracowano liczne modele myszy12. Chociaż istnieje wiele modeli zapalenia jelita grubego, tylko kilka z nich powtarza zapalenie jelita jelita i włóknienie związane z CD.12. Wśród nich są opisane tutaj homologii 2 z niedoborem 5'-inozytolowej fosfatazy (SHIP-/-), a także myszy SAMP1/YitFc i myszyTnf ΔARE. Modele te łącznie odzwierciedlają złożoność ludzkiego CD, ponieważ każdy z nich jest napędzany przez odrębne mechanizmy komórkowe i molekularne. Choroba u myszy SAMP1/YitFc wynika z predyspozycji poligenowej wpływającej na funkcję bariery nabłonkowej i regulację odporności13,14, podczas gdy myszyTnf ΔARE mają delecję elementów bogatych w AU w mRNA TNF, co prowadzi do zwiększonej stabilności mRNA i nadprodukcji TNF15,16. Choć są cenne, te modele mają swoje ograniczenia. Model SAMP1/YitFc cierpi na niską efektywność hodowlę, co stanowi wyzwanie w uzyskaniu wystarczającej wielkości kohorty dla badań17. Ponadto modelTnf ΔARE wymaga do 24 tygodni na rozwinięcie zauważalnej patologii fibrotycznej, co czyni badania interwencyjnych kosztownymi i trudnymi16.
SHIP jest ujemnym regulatorem szlaku sygnalizacyjnego fosfatydylinozytol-3-kinazy (PI3K) i jest głównie ekspresjonowany w komórkach hematopoietycznych. Działa poprzez usunięcie grupy fosforanowej 5' z fosfatydylinozytolu 3,4,5-trisfosforanu, co tłumi sygnał PI3K18 w dalszej fazie. Myszy SHIP-/- oferują kilka zalet w badaniach przedklinicznych. Te myszy są stosunkowo łatwe do rozmnażania i wykazują oznaki zwłóknienia już od 8. tygodnia życia19 lat. Przyspieszona remodelacja włóknistości w tym modelu prawdopodobnie jest napędzana przez zwiększone odpowiedzi zapalne spowodowane zaburzeniem szlaku PI3K, co prowadzi do hiperaktywacji komórek odpornościowych i późniejszej szybkiej remodelacji tkanek. Co najważniejsze, my i grupa Kerra niezależnie wykazaliście, że myszy SHIP-/- rozwijają zapalenie kręci kręcowej o cechach bardzo przypominających ludzkie19,20 cykl cyklu. Potwierdzając znaczenie tego modelu, podgrupa osób z CD miała zmniejszoną aktywność SHIP zarówno w biopsjach jelita, jak i PBMC21. Co więcej, osoby o niskiej aktywności SHIP mają tendencję do poważniejszych przebiegów choroby, często wymagających wielu operacji22.
SHIP-/- myszy zaczynają rozwijać spontaniczny, nieciągły stan zapalny jelit lokalizowany w dalszej części jelita już w wieku 4 tygodni, a stan zapalny występuje u wszystkich myszy do 6. tygodnia życia20 lat. Do 8. tygodnia życia myszy mają już wykształconą patologię fibrotyczną, charakteryzującą się pogrubieniem mięśnia zewnętrznego oraz rozległym nagromadzeniem kolagenu w podśluzówce i między warstwami mięśniowymi19. Stan zapalny w tym modelu jest wywoływany przez interleukinę-1β (IL-1β)21 pochodzącą z makrofagów. Zarówno wyczerpanie makrofagów przy użyciu liposomów zawierających klodronaty, jak i farmakologiczna blokada sygnalizacji IL-1 za pomocą antagonisty receptora IL-1 (anakinra) złagodziły stan zapalny jelit u myszy SHIP-/-21. Oprócz zapalenia jelita krętego, myszy SHIP-/- wykazują zapalenie płuc, które wykorzystaliśmy do oceny efektów poza celem terapii przeznaczonych do lokalnego dostarczania jelita23. Inni zgłaszali, że hamowanie kaspazy-8 przy użyciu Z-IETD-FMK znacząco zmniejsza zarówno stan zapalny jelita mięciowego, jak i płucnego u myszy SHIP-/- 24, co dodatkowo wspiera patologię płuc jako dodatkową cechę do oceny ogólnoustrojowej kontroli zapalnej.
Niniejszy artykuł metodologiczny powraca do naszych niedawno opublikowanych badań nad skutecznym leczeniem deksametazonem23 oraz zawiera szczegółowy opis kluczowych procedur technicznych, z dodatkowymi rozważaniami dotyczącymi wykorzystania modeli mysich w badaniach farmakologicznych. Konkretnie podkreślamy standardowe parametry oceny skuteczności leków w modelach IBD, w tym ocenę przepuszczalności jelit, patologii grubej, histopatologii oraz mediatorów i efektorów prozapalnych, oraz omawiamy sposoby integracji tych danych w celu wyciągania wniosków dotyczących ogólnej skuteczności terapii.

<table><tbody><tr><td>1,7 mL mikrorurka z zatrzaskiem i mikrorurką;</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS (bez chlorku wapnia, bez chlorku magnezu)</td><td>Gibco</td><td>REF 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>25G x <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/68928/68928eq1.jpg" style="margines: auto; "/>&rdquo; igły & nbsp;</td><td>BD</td><td>REF 305122</td><td>Do nakłucia serca</td></tr><tr><td>26G x <img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/68928/68928eq2.jpg" style="margines: auto; "/>&rdquo; igły</td><td>BD</td><td>REF 305110</td><td>Rozpłukanie jelit</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Roztwór kwasowego cytrynianu (38 mM kwasu cytrynowego, 107 mM cytrynianu sodu, 136 mM dekstrozy)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3821</td><td></td></tr><tr><td>Igła karmienia dla zwierząt, niesterylna, wielokrotnego użytku, typ 304SS</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CAD7900&nbsp;</td><td>Do gavage Proste Rozmiar: 24G, Lxdiam. 1 w. x 1,25 mm, kula</td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Cayman Chemical</td><td>9087-70-1</td><td>Bufor homogenizacyjny</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok strzykawka sterylna, jednorazowa, 5 mL</td><td>BD</td><td>REF 309646</td><td>Rozpłukanie jelit</td></tr><tr><td>BD OptEIA Mouse IL-6 ELISA Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555240</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA Mysz TNF ELISA Set II</td><td>BD Biosciences</td><td>558534</td><td></td></tr><tr><td>BD&reg; Sterylna strzykawka Luer Slip Tip, jednorazowa, 1 mL</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>Piankowe podkładki do biopsji kwadratowe, 30,2 x 25,4 x 2 mm średnicy.</td><td>Simport Scientific</td><td>REF M476-1</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Buforowany Formalde-Fresh (niski zapach 10% Formaliny)</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF93-4</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Przezroczyste płytki immuno-niesterylne z płaskim dnem na 96 dołków</td><td>Thermo Scientific</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5415R Chłodzona Wirówka&nbsp;</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy bezwodny</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Kaseta tkankowa Fisherbrand TRU-FLOW</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-200-403</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>FITC-dektranowy, 3-5kDa (1g)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD4-1G Numer CAS: 60842-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Millipore Sigma</td><td>103476-89-7</td><td>Bufor homogenizacyjny</td></tr><tr><td>Mouse IL-1 beta/IL-1F2 DuoSet ELISA &nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>DY401</td><td></td></tr><tr><td>Płyta wieloekranowa z 96 dołkami, pełne dno</td><td>Millipore Sigma</td><td>MSSWNFX40</td><td>Białe, niesterylne, niepoddające zabiegi</td></tr><tr><td>OmniPur Chloroform</td><td>Millipore Sigma</td><td>3150</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Homogenizator Polytron PT-MR2100</td><td>Kinematica AG</td><td>632081</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłyt Varioskan Lux</td><td>Thermo Scientific</td><td>VL0L00D0</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym ship zapalenia i włóknienia choroby leśniowskiego-crowna podobnego do choroby leśniowskiego-cruna

Evaluating Therapeutic Interventions in the SHIP-deficient Mouse Model of Crohn Disease-like Ileitis and Fibrosis

Choroba Crohna (CD) to przewlekła, nawracająca choroba zapalna charakteryzująca się segmentowym, przezmuralnym zapaleniem, które może dotyczyć dowolnej części przewodu pokarmowego. Charakterystyczną cechą CD jest upośledzenie funkcji bariery jelitowej, a włóknienie jelit jest częstym powikłaniem. Myszy niedoborowe SHIP (SHIP-/-) spontanicznie rozwijają dysfunkcję bariery jelitowej, zapalenie jelita oraz patologię włóknistą, co powtarza kluczowe cechy zapalenia kręta (CD-podobnego). Myszy SHIP-/- stanowią cenny wzór do testowania terapii przeciwzapalnych i przeciwfibrotycznych w CD.
Tutaj opisujemy metody oceny interwencji terapeutycznych w tym modelu, wykorzystując deksametazon jako przykład skutecznej terapii. Oferujemy krok po kroku protokół charakteryzacji choroby i odpowiedzi na leczenie , w tym ocenę przepuszczalności jelit mierzoną za pomocą FITC-dektranu, a także ogólne badanie patologiczne i szczegółowe analizy histologiczne. Oceny histologiczne obejmują barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w przypadku stanu zapalnego, barwienie trójchromowe Massona w przypadku włóknienia oraz barwienie błękitu alcjanowego/kwasowo-Schiffowego (PAS) w przypadku hiperplazji i hipertrofii komórek pucharowych. Dodatkowo w celu oceny stanu zapalnego określa się cytokiny i markery zapalne w tkance biodrowej. Razem te metody stanowią kompleksowe ramy oceny skuteczności leczenia w modelu mysim SHIP-/- zapalenia jelczyny przypominającej CD. Protokół ten jest szeroko stosowany wśród badaczy badających stan zapalny jelit, gojenie się błony śluzowej oraz włóknienie jelit.

6-tygodniowe myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były doustnie podawane 0,5% β-cyklodekstryny (kontrola pojazdu; n = 6/genotyp) lub 3 mg/kg deksametazonu (n = 6/genotyp) dziennie przez 2 tygodnie. Czas i czas trwania leczenia zależą od modelu i powinny uwzględniać początek oraz tempo postępu choroby, a także to, czy interwencja ma charakter profilaktyczny czy terapeutyczny. W eksperymentach należy stosować równą liczbę samców i samic myszy. Chociaż nie zidentyfikowaliśmy różnic płciowych w naturalnym przebiegu choroby u myszy SHIP-/-, różne protokoły leczenia mogą wykazywać odpowiedzi specyficzne dla płci. W tym modelu profilaktyczne leczenie od 4 do 6 tygodnia życia może być stosowane w celu zapobiegania wystąpieniu stanu zapalnego i włóknienia, natomiast programy terapeutyczne wykonywane w wieku 6-8, 8-10 lub 6-10 tygodnia życia mogą służyć do oceny skuteczności leczenia w przypadku choroby ugruntowanej. Optymalne dawkowanie i czas dawkowania powinny być kierowane literaturą i badaniami nad miareczkowaniem. Wcześniej wykazano, że ten schemat dawkowania deksametazonu jest skuteczny, gdy podaje się go po rozwinięciu zapalenia jelita jelita.
Zalecany harmonogram dnia zbiorów przedstawiony jest na rysunku 1A. Deksametazon nie wywołał żadnej patologii jelitowej u myszy SHIP+/+ na podstawie badania ogólnego. Myszy SHIP-/- wykazywały widoczne miejsca zaczerwienienia i pogrubienia, wskazujące na stan zapalny. Te grube cechy patologiczne nie występowały u myszy SHIP-/- leczonych deksametazonem (Rysunek 1B). Aby ocenić funkcję bariery jelitowej, po doustnym gavage zmierzono stężenia FITC-dekstranu w osoczu. Chociaż nie istotne statystycznie, myszy SHIP-/- miały podwyższone stężenia FITC-dekstran w osoczu w porównaniu do kontrolnych SHIP+/+, co sugeruje zwiększoną przepuszczalność jelit. Leczenie deksametazonem obniżyło stężenie FITC-dekstranu u myszy SHIP-/- do poziomu podobnego do obserwowanego u myszy SHIP+/+ (rysunek 1C).
Histologiczne badanie przekrojów jelitowych myszy SHIP-/- wykazało charakterystyczne cechy patologiczne, w tym infiltrację komórek odpornościowych, zakłóconą architekturę krypt kozmków, hiperplazję/hipertrofię komórek pucharowych oraz pogrubienie warstwy mięśniowej (Rysunek 2A). Cechy te odzwierciedlały się w znacząco wyższych wynikach uszkodzeń histologicznych w porównaniu do myszy SHIP+/+ (p = 0,0005, rysunek 2B). Uszkodzenia histologiczne nie zaobserwowano u myszy SHIP+/+ leczonych deksametazonem. Zgodnie z poprawą obserwowaną w patologii grubej i funkcji barierowej, deksametazon zmniejszał histopatologię u myszy SHIP-/-, choć efekt ten nie był statystycznie istotny (p = 0,0981, rysunek 2A i rysunek 2B). Trójchromowe barwienie Massona wykazało znaczne osadzanie kolagenu w tkankach jelitowych SHIP-/-, wraz ze znacząco wyższymi wynikami zwłóknienia w porównaniu z kontrolą SHIP+/+ (Rysunek 2C). Deksametazon skutecznie osłabił cechy włóknistej u myszy SHIP-/-, obniżając wyniki zwłóknienia do wartości porównywalnych z kontrolami SHIP+/+ (Rysunek 2C). Dodatkowo, barwienie błękitu alcowego/PAS potwierdziło hiperplazję/hipertrofię komórek pucharowych u myszy SHIP-/-, która została zmniejszona po leczeniu deksametazonem (Rysunek 2D).
Aby ocenić stężenia cytokin zapalnych, przeprowadzono badania ELISA na homogenatach tkanek jelita o pełnej grubości (Rysunek 3A). Stężenia IL-1β były istotnie wyższe u myszy SHIP-/- w porównaniu z kontrolnymi SHIP+/+ (p = 0,0468), co zgadza się z wcześniejszymi ustaleniami korelującymi ekspresję IL-1β z nasileniem choroby w tym modelu. Leczenie deksametazonem znacząco obniżyło stężenie IL-1β u myszy SHIP-/- (p = 0,0023). Zgodnie z wcześniejszymi raportami, stężenia IL-6 lub TNF nie różniły się w czterech grupach eksperymentalnych. Zmierzyliśmy także stężenia białek związanych z neutrofilami: mieloperoksydazy (MPO) i lipokaliny-2 (LCN-2) w homogenatach o pełnej grubości jeli, jako dodatkowe biochemiczne markery stanu zapalnego (Rysunek 3B). Zarówno stężenia MPO, jak i LCN-2 były istotnie wyższe (p = 0,0031 i p = 0,0002 odpowiednio) u myszy SHIP-/- w porównaniu do kontrolnych SHIP+/+, choć wzrost LCN-2 był w dużej mierze spowodowany wysokimi stężeniami zmierzonymi u 2 z 6 myszy. Leczenie deksametazonem zmniejszyło MPO i umiarkowanie obniżyło LCN-2, różnice nie były istotne. Dane te sugerują, że MPO jest użytecznym markerem stanu zapalnego u myszy SHIP-/-, podczas gdy stężenia LCN-2 nie są tak stałe ani wiarygodne.
Aby zbadać związek między cechami zapalnymi a włóknistymi w modelu myszy SHIP-/-, przeprowadziliśmy analizy korelacji Spearmana z wykorzystaniem histologicznych wskaźników uszkodzeń, wyników zwłóknienia oraz stężeń IL-1β z tkanki szyjkowej o pełnej grubości (Rysunek 4). Stężenia IL-1β pozytywnie korelowały z wynikami uszkodzeń histologicznych (r = 0,6813), co wskazuje, że zwiększone zapalenie wiązało się ze zwiększonym uszkodzeniem tkanek (Rysunek 4A). Zaobserwowano również umiarkowaną korelację między stężeniami IL-1β a wynikami włóknienia (r = 0,4117), co sugeruje związek między produkcją cytokin zapalnych a przebudową włóknistą (Rysunek 4B). Dodatkowo, oceny uszkodzeń histologicznych istotnie korelowały z wynikami zwłóknienia (r = 0,6241), co sugeruje, że uszkodzenia strukturalne i włóknienie przebiegają równolegle u myszy SHIP-/- (rysunek 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68928/68928fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Deksametazon zmniejsza ogólną patologię jelit i przepuszczalność u myszy SHIP-/-. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryny jako środka kontrolnego (VC), albo deksametazonu (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Zalecany harmonogram eksperymentów. (B) Oceniono morfologię całkowitej nasypu i dalszej części kości jelewnej, a przedstawiono reprezentatywne obrazy (n = 4-6 myszy na grupę). Gwiazdki oznaczają obszary o plamastym zaczerwienieniu i pogrubieniu zaobserwowanym podczas badania ogólnego. Obrazy te mają służyć jako reprezentatywne przykłady ogólnej patologii i nie są przeznaczone do analizy ilościowej. (C) Aby ocenić przepuszczalność jelit, myszy były na czczo przez 4 godziny i podawano 80 mg/mL FITC-dektranowi. Po kolejnych 4 godzinach postu pobrano krew za pomocą nakłucia serca, a stężenia FITC-dekstranu w osocze zmierzono. Dane są prezentowane jako średni±SD. Szary pasek reprezentuje zakres stężeń FITC-deksranów w osoczu, zwykle obserwowanych u zdrowych myszy C57BL/6 cztery godziny po gavage25. Istotność statystyczną określono za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68928/68928fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68928/68928fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Deksametazon zmniejsza oceny uszkodzeń histologicznych, kolagen, grubość mięśni oraz hiperplazję i hipertrofię komórek pucharowych w dalszej jelicie jelita jelita SHIP-/- myszy. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryny jako środka kontrolnego (VC), albo deksametazonu (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Przekroje poprzeczne myszy z barwieniem H&E zostały sfotografowane z powiększeniem 10x; skala = 200 μm. (B) oceny uszkodzeń histologicznych dla myszy SHIP+/+ i SHIP-/- wyrażone jako mediana ± IQR. (C) Stałe przekroje poprzeczne szyldu biodrowego zostały barwione trichromem Massona pod kątem włóknienia; kolagen jest zabarwiony na niebiesko. Zdjęcia wykonano z 10-krotnym powiększeniem; Paski skalowe = 200 μm. Wyniki zwłóknienia dla myszy SHIP+/+ i SHIP-/- wyrażone jako mediana ± IQR. (D) Stałe przekroje boczne zostały bejcowane błękitem alkowym/PAS. Zdjęcia były fotografowane przy powiększeniu 10×; Paski skalowe = 200 μm. Wszystkie sekcje reprezentują n = 6 myszy na grupę (z wyjątkiem SHIP+/+ Dex i SHIP-/- Dex, n = 5). Istotność statystyczna dla wyniku uszkodzeń histologicznych została określona za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68928/68928fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68928/68928fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Deksametazon obniża stężenie IL-1β w pełnogrubych homogenatach narządu z myszy SHIP-/-. Myszy SHIP+/+ i SHIP-/- były codziennie doustnie podawane albo 0,5% β-cyklodekstryną jako kontrolą pojazdu (VC), albo deksametazonem (Dex; 3 mg/kg) w wieku od 6 do 8 tygodni życia. (A) Stężenia IL-1β, TNF i IL-6 mierzono w homogenatach szylowych o pełnej grubości. (B) stężenia mieloperoksydazy (MPO) i lipokaliny-2 (LCN-2) mierzono w homogenatach tkanek brzęgowych o pełnej grubości. Dane prezentowane są jako średnia ± SD. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Kruskal-Wallis, a następnie testu wielokrotnych porównań Dunna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68928/68928fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68928/68928fig4v2.jpg" /> 
Rysunek 4: Stężenia IL-1β korelują pozytywnie z uszkodzeniami histologicznymi, a włóknienie i włóknienie korelują z wynikiem uszkodzeń histologicznych u myszy SHIP-/-. Analiza korelacji Spearmana została przeprowadzona w celu oceny zależności między oceną uszkodzeń histologicznych, oceną zwłóknienia oraz stężeniami IL-1β w tkance szyjnej o pełnej grubości u myszy SHIP-/-. Zaobserwowano istotne pozytywne korelacje między (A) oceną uszkodzeń histologicznych a stężeniami IL-1β (r = 0,6813), (B) wynikiem włóknienia i stężeniami IL-1β (r = 0,4117) oraz (C) oceną uszkodzeń histologicznych i wskaźnikami włóknienia (r = 0,6241). Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczą mysz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68928/68928fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent obrażeń</td>
			<td colspan="2">Ścieżka dźwiękowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrata architektury krypt</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = <25% straty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = strata 25-50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">3 = strata 50-75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">4 = >75% straty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infiltracja komórek odpornościowych</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = okazjonalna komórka odpornościowa w lamina propria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = zwiększony poziom odporności w lamina propria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">3 = zbieżne komórki odpornościowe w warstwie błonki i błonie śluzowej przenikających</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">4 = infiltracja komórek odpornościowych w całym przekroju</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przerost i hipertrofia komórek pucharowych</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = <50% wzrost liczby i rozmiaru buziarskich komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = >50% wzrost liczby i rozmiaru bucharowych komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrzody</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = wrzód pośredni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = znaczne wrzody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obrzęk</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = <50% sekcji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = >50% sekcji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pogrubienie mięśni</td>
			<td colspan="2">0 = brak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">1 = pogrubienie pośrednie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">2 = znaczne pogrubienie</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Oceny obrażeń histologicznych. Histologiczne uszkodzenia przekrojów poprzecznych jelia z SHIP+/+ i SHIP-/- myszy zabarwionych H&E są oceniane na podstawie kluczowych cech zapalenia jelita kręcowego charakteryzujących model myszy SHIP-/-, w tym utraty architektury (0-4), infiltracji komórek odpornościowych (0-4), hiperplazji i przerostu komórek pucharowych (0-2), wrzodów (0-2), obrzęku (0-2) oraz pogrubienia mięśni (0-2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent włóknienia</td>
			<td colspan="3">Ścieżka dźwiękowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nadmiar kolagenu</td>
			<td colspan="3">0 = Normalna architektura; brak nadmiaru kolagenu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">1 = Niewielki wzrost kolagenu; ograniczone do podśluzówki lub podserozy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">2 = Umiarkowana ekspansja kolagenu do podśluzówki i częściowej muscularis propria, z nieuporządkowanymi pęczkami</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">3 = Rozległy, gęsty kolagen zastępujący normalną strukturę, obejmujący podśluzówkę i mięśnie (przezmuralne)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibromusckularna hiperplazja/mięśniowa/zatarcie mięśni podśluzówki</td>
			<td colspan="3">0 = Brak, prawidłowa zawartość podśluzówki mięśni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">1 = Niewielki wzrost zawartości mięśni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">2 = Duża ilość mięśni w podśluzowości, wpływa na morfologię, ale na prawidłową strukturę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">3= Mięsień zniszczył całą przestrzeń podśluzową</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Ocena zwłóknienia. Włóknienie w przekrojach poprzecznych jelita SHIP+/+ i SHIP-/- myszy zabarwionych masonem Massona trichrom oceniono na podstawie kluczowych cech włóknienia jelit obserwowanych w modelu SHIP-/-, w tym nadmiernego odkładania kolagenu (0-3) oraz fibromusckularnej hiperplazji lub zatarcia mięśni podśluzówki (0-3). Kolagen ocenia się pod kątem zakresu i zaburzenia architektonicznego, natomiast zmiany mięśniowe oceniane są na podstawie stopnia infiltracji mięśni i zniekształcenia struktury podśluzowej.

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Crohn disease (CD) is a chronic, relapsing inflammatory condition characterized by segmental, transmural inflammation that can affect any part of the ...

Używamy myszy niedoborowych SHIP do badania mechanizmów napędzających zapalenie i włóknienie jelit w chorobie Crohna oraz do oceny nowych leków lub strategii terapeutycznych w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna. Dlatego wykorzystaliśmy ten model w badaniach przedklinicznych, aby wykazać skuteczność leków na glikogen IBD w celowanym dostarczaniu leków. Nasz protokół wykorzystuje myszy niedoborowe SHIP, które naturalnie rozwijają zapalenie i włóknienie jelita mięciowego, zapewniając model bardziej fizjologiczny niż tradycyjne modele chemicznie indukowane lub oparte na urazach.Nasze wyniki potwierdzają, że myszy niedoborowe w SHIP są solidnym modelem zapalenia i włóknienia jelita miedziowego, umożliwiając badania mechanistyczne i przedkliniczne testy terapii choroby Crohna. Na początek pości myszy przez cztery godziny przed wykonaniem testu. Rozpuszcz cztery kilodaltony FITC-dekstranu w sterylnym PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 80 miligramów na mililitr.Następnie delikatnie unieruchom każdą mysz i podaj 150 mikrolitrów roztworu FITC-dekstranu za pomocą doustnej gavage, a następnie trzymaj myszy bez jedzenia przez kolejne cztery godziny po gavage. Po uśpieniu myszy wykonaj nakłucie serca za pomocą igły 25 gauge i strzykawki o pojemności 1 mililitra, aby pobrać krew. Natychmiast należy dodać 10 mikrolitrów roztworu kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowego do każdego 100 mikrolitrów pobranej krwi jako środek przeciwzakrzepowy.Dokładnie wymieszaj, odwracając rurkę kilka razy. Wiruj pobrane próbki krwi w dawce 1 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś plazmę do oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra.Wszystkie próbki trzymaj na lodzie i chronione przed światłem, dopóki nie będą gotowe do analizy. Teraz rozcieńcz każdą próbkę plazmy w proporcjach 1 do 2 i 1 do 10 za pomocą PBS. Dodaj 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia plazmy do nieprzezroczystej płyty z 96 dołkami, umieszczając je w podwójnych dołkach.Wykonaj jedno do dwóch seryjne rozcieńczeń oryginalnego zapasu FITC-deksranów o dawce 80 miligramów na mililitr, używając PBS do przygotowania różnych stężeń roztworu. Dodaj 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do podwójnych dołków płyty 96-dołowej. Następnie zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłyt ustawionych na 485 nanometrów dla wzbudzenia i 535 nanometrów dla emisji.Po pobraniu krwi W testie FITC-dextran ostrożnie usuń całe jelito cienkie myszy. Delikatnie usuń przymocowany tłuszcz i tkankę łączną z jelit. Połóż oczyszczone jelito płasko na arkuszu białego papieru, aby zwiększyć kontrast wizualny.Zbadaj tkankę wzrokowo pod kątem makroskopowych oznak choroby, zwracając szczególną uwagę na dalsze 10 centymetrów u myszy z nokautacją SHIP, gdzie często występuje stan zapalny. Ustaw jelito obok linijki, aby uzyskać skalę, i sfotografuj cały okaz, aby udokumentować wszelkie poważne znaleziska patologiczne. Delikatnie przepłukaj światło jelit PBS za pomocą strzykawki, aby usunąć zawartość jelit, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec zniekształceniu kosetek i architektury krypt.Zidentyfikuj obszar dalszego jelita kręcowego najbardziej reprezentatywnego dla patologii grubej i wyciz około jednego centymetra tkanki. Połóż wyciętą tkankę płasko w kasecie histologicznej i umieść ją między dwoma gąbkami, aby zapobiec fałszowaniu podczas fiksacji. W przypadku barwienia hematoksyliny i eozyny oraz barwienia trójchromowego Masson, utrwal tkankę w 10% neutralnej formalinie buforowanej przez noc przy temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po utrwaleniu przelej kasety do 70% etanolu do przechowywania i upewnij się, że pozostaną całkowicie zanurzone aż do przetworzenia. W przypadku barwienia błękitu alcjańskiego i okresowego kwasu Schiffa utrwal tkankę w roztworze Carnoya na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu przelej kasety na 100% etanolu do przechowywania aż do przetworzenia.Następnie osadz ustalone tkanki w parafinie i podziel je na pięciomikrometrowe plastry do późniejszego barwienia. Oceniaj przecięcia brzęgowe barwione hematoksyliną i eozyną w skali 16-punktowej zgodnie z określonymi kryteriami histopatologicznymi. Oceń trójbarwne przekroje poprzeczne Masson, używając sześciopunktowej skali opartej na wcześniej określonych kryteriach.Oblicz końcowy wynik zwłóknienia jako medianę wyników przypisanych przez dwóch niezależnych recenzentów, którzy są ślepi na warunki eksperymentalne. Po sekcji i usunięciu próbki histologicznej pobierz pozostałą część dalszego 10 centymetrów jelita krętego. Osusz zebraną tkankę ręcznikiem papierowym lub chusteczką bez kłaczków, a następnie zarejestruj wagę tkanki na skalibrowanej wadze.Szybko zamroz tkankę w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego przetwarzania. Gdy są gotowe do obróbki, pobierz zamrożoną tkankę i zawsze trzymaj ją na lodzie. Następnie ponownie zważ próbki tkanek, aby potwierdzić dokładną masę.Przygotuj bufor homogenizacyjny, dodając inhibitor proteazy do PBS. Użyj 10 mikrolitrów buforu na miligram tkanki. Za pomocą homogenizatora stołowego ujednolic tkankę szydową o pełnej grubości w buforze homogenizacyjnym lodowatego.Kontynuuj, aż homogenata stanie się jednolita i wolna od widocznych fragmentów tkanek. Dokładnie opłucz końcówkę homogenizatora PBS między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Wiruj tkankę w 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zachowaj oczyszczone supernatanty w mniejszych objętościach, aby zapobiec cyklom zamarzania i rozmrażania, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Analiza histologiczna wykazała istotnie większe uszkodzenia jelit u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP. Leczenie deksametazonem zmniejszyło uszkodzenia histologiczne u myszy z niedoborem SHIP, choć spadek ten nie był statystycznie istotny.Trójchromowe barwienie Massona wykazało istotnie zwiększone odkładanie kolagenu u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP, co wskazuje na wyższe wyniki zwłóknienia. Leczenie deksametazonem znacząco zmniejszyło włóknienie u myszy z niedoborem SHIP, zbliżając wyniki do kontroli pozytywnej dla SHIP. Błękit alcowy i barwienie PAS potwierdziły hiperplazję komórek pucharowych u myszy z niedoborem SHIP, która była widocznie zmniejszona po leczeniu deksametazonem.Stężenia beta IL-1 były istotnie podwyższone u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do kontroli SHIP. Deksametazon znacząco obniżył stężenie IL-1beta u myszy z niedoborem SHIP. Stężenia MPO były istotnie podwyższone u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP, a wzrost ten został zmniejszony przez deksametazon, nie osiągając istotności statystycznej.Stężenia LCN-2 były również podwyższone u myszy z niedoborem SHIP, ale wysokie wartości nie były konsekwentnie obniżane przez deksametazon. Stężenia IL-1 beta pozytywnie korelowały z wynikami uszkodzeń histologicznych i zwłóknienia, wskazując na związek między stanem zapalnym a uszkodzeniem tkanek. Wyniki uszkodzeń histologicznych korelowały pozytywnie z wynikami zwłóknienia, co sugeruje, że uszkodzenia tkanek i przebudowa włóknistości przebiegały równolegle.

evaluating-therapeutic-interventions-ship-deficient-mouse-model-crohn

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Poznaj ocenę interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia jelita grubego. Ta metoda umożliwia testowanie nowych leków na chorobę Leśniowskiego-Crowna.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA (Wideo) | JoVE Journal

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Przeglądaj więcej filmów