Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Używamy myszy niedoborowych SHIP do badania mechanizmów napędzających zapalenie i włóknienie jelit w chorobie Crohna oraz do oceny nowych leków lub strategii terapeutycznych w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna. Dlatego wykorzystaliśmy ten model w badaniach przedklinicznych, aby wykazać skuteczność leków na glikogen IBD w celowanym dostarczaniu leków. Nasz protokół wykorzystuje myszy niedoborowe SHIP, które naturalnie rozwijają zapalenie i włóknienie jelita mięciowego, zapewniając model bardziej fizjologiczny niż tradycyjne modele chemicznie indukowane lub oparte na urazach.

Nasze wyniki potwierdzają, że myszy niedoborowe w SHIP są solidnym modelem zapalenia i włóknienia jelita miedziowego, umożliwiając badania mechanistyczne i przedkliniczne testy terapii choroby Crohna. Na początek pości myszy przez cztery godziny przed wykonaniem testu. Rozpuszcz cztery kilodaltony FITC-dekstranu w sterylnym PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 80 miligramów na mililitr.

Następnie delikatnie unieruchom każdą mysz i podaj 150 mikrolitrów roztworu FITC-dekstranu za pomocą doustnej gavage, a następnie trzymaj myszy bez jedzenia przez kolejne cztery godziny po gavage. Po uśpieniu myszy wykonaj nakłucie serca za pomocą igły 25 gauge i strzykawki o pojemności 1 mililitra, aby pobrać krew. Natychmiast należy dodać 10 mikrolitrów roztworu kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowego do każdego 100 mikrolitrów pobranej krwi jako środek przeciwzakrzepowy.

Dokładnie wymieszaj, odwracając rurkę kilka razy. Wiruj pobrane próbki krwi w dawce 1 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś plazmę do oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra.

Wszystkie próbki trzymaj na lodzie i chronione przed światłem, dopóki nie będą gotowe do analizy. Teraz rozcieńcz każdą próbkę plazmy w proporcjach 1 do 2 i 1 do 10 za pomocą PBS. Dodaj 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia plazmy do nieprzezroczystej płyty z 96 dołkami, umieszczając je w podwójnych dołkach.

Wykonaj jedno do dwóch seryjne rozcieńczeń oryginalnego zapasu FITC-deksranów o dawce 80 miligramów na mililitr, używając PBS do przygotowania różnych stężeń roztworu. Dodaj 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do podwójnych dołków płyty 96-dołowej. Następnie zmierz fluorescencję za pomocą czytnika mikropłyt ustawionych na 485 nanometrów dla wzbudzenia i 535 nanometrów dla emisji.

Po pobraniu krwi W testie FITC-dextran ostrożnie usuń całe jelito cienkie myszy. Delikatnie usuń przymocowany tłuszcz i tkankę łączną z jelit. Połóż oczyszczone jelito płasko na arkuszu białego papieru, aby zwiększyć kontrast wizualny.

Zbadaj tkankę wzrokowo pod kątem makroskopowych oznak choroby, zwracając szczególną uwagę na dalsze 10 centymetrów u myszy z nokautacją SHIP, gdzie często występuje stan zapalny. Ustaw jelito obok linijki, aby uzyskać skalę, i sfotografuj cały okaz, aby udokumentować wszelkie poważne znaleziska patologiczne. Delikatnie przepłukaj światło jelit PBS za pomocą strzykawki, aby usunąć zawartość jelit, unikając nadmiernej siły, aby zapobiec zniekształceniu kosetek i architektury krypt.

Zidentyfikuj obszar dalszego jelita kręcowego najbardziej reprezentatywnego dla patologii grubej i wyciz około jednego centymetra tkanki. Połóż wyciętą tkankę płasko w kasecie histologicznej i umieść ją między dwoma gąbkami, aby zapobiec fałszowaniu podczas fiksacji. W przypadku barwienia hematoksyliny i eozyny oraz barwienia trójchromowego Masson, utrwal tkankę w 10% neutralnej formalinie buforowanej przez noc przy temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po utrwaleniu przelej kasety do 70% etanolu do przechowywania i upewnij się, że pozostaną całkowicie zanurzone aż do przetworzenia. W przypadku barwienia błękitu alcjańskiego i okresowego kwasu Schiffa utrwal tkankę w roztworze Carnoya na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu przelej kasety na 100% etanolu do przechowywania aż do przetworzenia.

Następnie osadz ustalone tkanki w parafinie i podziel je na pięciomikrometrowe plastry do późniejszego barwienia. Oceniaj przecięcia brzęgowe barwione hematoksyliną i eozyną w skali 16-punktowej zgodnie z określonymi kryteriami histopatologicznymi. Oceń trójbarwne przekroje poprzeczne Masson, używając sześciopunktowej skali opartej na wcześniej określonych kryteriach.

Oblicz końcowy wynik zwłóknienia jako medianę wyników przypisanych przez dwóch niezależnych recenzentów, którzy są ślepi na warunki eksperymentalne. Po sekcji i usunięciu próbki histologicznej pobierz pozostałą część dalszego 10 centymetrów jelita krętego. Osusz zebraną tkankę ręcznikiem papierowym lub chusteczką bez kłaczków, a następnie zarejestruj wagę tkanki na skalibrowanej wadze.

Szybko zamroz tkankę w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego przetwarzania. Gdy są gotowe do obróbki, pobierz zamrożoną tkankę i zawsze trzymaj ją na lodzie. Następnie ponownie zważ próbki tkanek, aby potwierdzić dokładną masę.

Przygotuj bufor homogenizacyjny, dodając inhibitor proteazy do PBS. Użyj 10 mikrolitrów buforu na miligram tkanki. Za pomocą homogenizatora stołowego ujednolic tkankę szydową o pełnej grubości w buforze homogenizacyjnym lodowatego.

Kontynuuj, aż homogenata stanie się jednolita i wolna od widocznych fragmentów tkanek. Dokładnie opłucz końcówkę homogenizatora PBS między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Wiruj tkankę w 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zachowaj oczyszczone supernatanty w mniejszych objętościach, aby zapobiec cyklom zamarzania i rozmrażania, a następnie przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Analiza histologiczna wykazała istotnie większe uszkodzenia jelit u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP. Leczenie deksametazonem zmniejszyło uszkodzenia histologiczne u myszy z niedoborem SHIP, choć spadek ten nie był statystycznie istotny.

Trójchromowe barwienie Massona wykazało istotnie zwiększone odkładanie kolagenu u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP, co wskazuje na wyższe wyniki zwłóknienia. Leczenie deksametazonem znacząco zmniejszyło włóknienie u myszy z niedoborem SHIP, zbliżając wyniki do kontroli pozytywnej dla SHIP. Błękit alcowy i barwienie PAS potwierdziły hiperplazję komórek pucharowych u myszy z niedoborem SHIP, która była widocznie zmniejszona po leczeniu deksametazonem.

Stężenia beta IL-1 były istotnie podwyższone u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do kontroli SHIP. Deksametazon znacząco obniżył stężenie IL-1beta u myszy z niedoborem SHIP. Stężenia MPO były istotnie podwyższone u myszy z niedoborem SHIP w porównaniu do grup kontrolnych SHIP, a wzrost ten został zmniejszony przez deksametazon, nie osiągając istotności statystycznej.

Stężenia LCN-2 były również podwyższone u myszy z niedoborem SHIP, ale wysokie wartości nie były konsekwentnie obniżane przez deksametazon. Stężenia IL-1 beta pozytywnie korelowały z wynikami uszkodzeń histologicznych i zwłóknienia, wskazując na związek między stanem zapalnym a uszkodzeniem tkanek. Wyniki uszkodzeń histologicznych korelowały pozytywnie z wynikami zwłóknienia, co sugeruje, że uszkodzenia tkanek i przebudowa włóknistości przebiegały równolegle.