Name: Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę mikronaczyniowej embolii u myszy z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych do mikroskopii dwufotonowej in vivo. Technika umożliwia badanie skutków zablokowania naczyń włosowatych mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić szczere podziękowania dr. Iwanowi Dobbe za opracowanie oprogramowania Articulus , które zostało wykorzystane do rekonstrukcji obrazów 3D in situ. Dziękujemy również prof. dr Nikolausowi Plesnila za uprzejme udostępnienie myszy TIE2-GFP (Jackson Laboratory, Stock No. 003658) wykorzystywanych do hodowli na miejscu.
Badanie to zostało sfinansowane przez Amsterdam Neuroscience (813294 do I.M.), Amsterdam Cardiovascular Sciences (sprzęt wywołany 2021 i 2023 do I.M.) oraz Dutch Heart Foundation (03-006-2021-T019 do I.M.).  
Badania te są również finansowane przez Holenderską Fundację Serca oraz Fundację Mózgu Holandii i prowadzone we współpracy oraz wspieranej przez Holenderski Sojusz Kardiowaskularystyczny, 01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0. Ponadto prace te były częściowo finansowane z nieograniczonego finansowania przez Stryker, Medtronic i Penumbra. Źródła finansowania nie były zaangażowane w projektowanie badań, monitorowanie, zbieranie danych, analizy statystyczne, interpretację wyników ani pisanie manuskryptów.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Aby modelować zatory mikronaczyniowe, opisano protokół wstrzykiwania mikrosfer do krążenia mózgowego myszy, który umożliwia badanie mikrozatoru za pomocą mikroskopii in vivo dwufotonowej mikroskopii. Metoda ta zoptymalizowała uwięzienie mikrosfery w mózgu, z wieloma mikrosferami uwięzionymi w pierwszych 500 μm kory ipsilateralnej, co umożliwiło skuteczne obrazowanie dwufotonowe.
Wysoka liczba mikrosfer w korowej części mózgu jest kluczowa dla obrazowania in vivo dwufotonowego. Utrata mikrosfer została zminimalizowana podczas przygotowania mieszanki mikrosfery poprzez pokrycie końcówek pipety 5% BSA lub 0,1% Tween20, co zmniejszało przyczepność mikrosfery (patrz Plik Uzupełniający 1). Chociaż dokładnej liczby przyklejonych mikrosfer nie dało się określić, pomiary średniej intensywności pokazały wpływ powłok. Dodatkowo, Tween20 wydawał się zapobiegać skupianiu mikrokul w cewniku, co skutkowało wizualnie większą liczbą pojedynczych mikrosfer przepływających przez cewnik, choć nie jest to zmierzone ilościowo. Zmniejsza to ryzyko zatkań dużych naczyń oraz potencjalnego powstawania dużych obszarów niedokrwiennych i hipoksycznych, co jest niepożądane ze względu na model embolizacji mikronaczyniowych. Ponadto myszy wykazywały mniejsze utraty masy ciała i szybciej wracały do wagi przedoperacyjnej po wstrzyknięciu mieszaniny mikrosfery zawierającej niskie stężenia Tween20. Tween20 jest powszechnie stosowanym dyspersantem 45,46,47, dlatego niskie stężenia stosowane w tym badaniu nie powinny powodować toksyczności ani negatywnych skutków dla integralności BBB. Ponadto nasze dane pokazują, że wyciek BBB występuje tylko w pobliżu (lub po przejściu) miejsca zalżenia mikrosfery, a nie systematycznie, nie powodując istotnego wzrostu całkowitego pokrycia leukocytami (patrz Plik Uzupełniający 2), co potwierdza stosowanie 0,1% Tween20. Ogólnie rzecz biorąc, dodanie Tween20 przyczynia się do zmniejszenia zlepiania mikrosfer oraz zwiększenia dostarczania mikrosfer do krążenia mózgowego, co potwierdzają liczebność mikrosfer w plasterkach mózgu, a także skutkuje wystarczającą liczbą mikroskopów widocznych dla mikroskopii dwufotonowej. Chociaż stosowanie Tween20 zwiększa liczbę mikrosfer umieszczonych w mózgu, zmienność w wstrzykiwaniu mikrosfer pozostaje niezmienna. Na tę zmienność może wpływać kilka czynników. Po pierwsze, tworzenie zakrzepów w cewniku lub naczyniach może powodować przyczepianie mikrosfer do skrzepu. Po drugie, obecność pęcherzyków powietrza może zakłócać płynne dostarczanie. Wreszcie, niepełne przywrócenie przepływu krwi w CCA lub ICA może zmienić hemodynamikę, potencjalnie sprzyjając przyczepności mikrosfery do ściany naczynia lub skupianie się w lumenie. Niestety, tych odchyleń nie można wykryć podczas zabiegu wstrzyknięcia.
Mikrosfery polistyrenowe są gęstsze niż woda, co prowadzi do nierównomiernego rozłożenia po załadowaniu mieszaniny mikrosfery do cewnika. Większość mikrosfer osiada w pobliżu ściany cewnika, gdzie tarcie płynu spowalnia ich ruch względem szybszego przepływu centralnego. Ostatecznie prowadzi to do nagromadzenia mikrosfer w ostatnich 20 μL cewnika. Należy unikać wstrzykiwania tej skoncentrowanej części, ponieważ może ona powodować duże zatory i incydenty niedokrwienne. Aby temu zapobiec, objętość mieszanki mikrosfery powinna być przygotowywana na dwukrotnie większej niż zamierzona objętość wtrysku.
Operacja mikronaczyniowej embolii wymaga znacznego szkolenia i precyzji. Jednym z najbardziej wymagających technicznie etapów jest umieszczenie szwu wokół PPA, OA oraz bocznych gałęzi ICA, aby zapewnić dokładne dostarczanie mieszaniny mikrosfery do kręgu Willisa i terytorium MCA. Ten etap jest utrudniony przez bliskość nerwu błędnego w pobliżu CCA, małą średnicę naczyń i ograniczoną przestrzeń chirurgiczną, co utrudnia ustawienie szwów bez uszkodzenia nerwów lub urazu naczyń.
Chociaż klips naczyniowy może być rozważany jako alternatywa dla tymczasowego podwiązywania PPA za pomocą szwów, niesie ze sobą dodatkowe ryzyko. Klipsy mogą nieumyślnie się odłączyć, co prowadzi do ponownego otwarcia jednostki. Co więcej, użycie drugiego klipsa na PPA obok istniejącego na ICA zwiększa prawdopodobieństwo odłączenia klipsa ICA z powodu ograniczonej przestrzeni. Jeśli tak się stanie, spowoduje to znaczne krwotok i bez natychmiastowej interwencji może doprowadzić do wcześniejszego zakończenia eksperymentu. Dlatego zamykanie PPA za pomocą klipsa do naczynia nie jest zalecane.
Obecny protokół wykorzystuje cewnik zamiast strzykawki33 do iniekcji do mikrosfery. To podejście zapewnia lepszą kontrolę nad prędkością i objętością wstrzykiwania oraz umożliwia zdalne wstrzykiwanie mikrosfer (np. wewnątrz metody obrazowania, takiej jak mikroskop czy skaner MRI).
Wybór ECA zamiast CCA jako punktu wejścia pozwala CCA pozostać całkowicie otwartym podczas zabiegu, co pomaga utrzymać bardziej fizjologiczne perfuzję mózgu przez cały zabieg chirurgiczny. Dodatkowo, wstrzykiwanie mikrosfer przez ECA zamiast CCA ma inne zalety:48: i) skrócony czas całkowitej pracy podczas reperfuzji; ii) zmniejszone ryzyko krwawienia podczas wstrzyknięcia i po zakończeniu zabiegu; iii) przy metodzie wejścia CCA po usunięciu igły49 w CCA powstaje niestabilne zwężenie i zakrzepica. Powoduje to zaburzenia przepływu krwi oraz ryzyko powstawania mikrozakrzepa, które mogą trafić do mózgu. Dodatkowo, wejście przez CCA wiązałoby się z dużym ryzykiem trwałego zamknięcia CCA, co może skutkować nieoptymalną reperfuzją mózgową w okresie przeżycia po operacji, pogorszoną przez dużą zmienność kręgu Willisa u myszy50,51
Mimo pełnej optymalizacji, protokół ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, obserwacja, że mikrosfery poruszają się wolniej wzdłuż ścian cewnika i nie są równomiernie rozłożone podczas wstrzykiwania, sugeruje, że do ICA trafia mniej mikrosfer niż się spodziewano. Pomimo stosowania Tween-20 w celu zmniejszenia przyczepności, niektóre mikrosfery nadal przyczepiają się do końcówek pipety, rurki Eppendorfa i cewnika. W konsekwencji rzeczywista liczba wstrzykiwanych mikrosfer prawdopodobnie jest niższa niż obliczone 7,2 x 104 cząstek na mysz. Niemniej jednak, wystarczająca liczba mikrosfer dociera do krążenia mózgowego, aby umożliwić obrazowanie za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Protokół wtrysku i skład mieszaniny są zoptymalizowane dla mikrosfer polistyrenowych o pojemności 10 μm. Jeśli użyte materiały (końcówki, rurki, cewniki) lub rozmiar mikrosfer zostaną zmienione, zarówno procedura roztwórzenia, jak i wstrzykiwania powinny zostać odpowiednio ponownie ocenione. Po drugie, badania dotyczące najlepszej metody zamykania dużych naczyń poprzez wewnątrzluminalne zatykanie MCA wykazały, że wejście do układu naczyniowego przez trwałą ligację ECA prowadzi do niedokrwienia mięśni żucia i połykania52. Może to prowadzić do zmniejszonego spożycia pokarmu przez myszy, a co za tym idzie do nadmiernej utraty masy ciała, upośledzenia funkcji motorycznych oraz zwiększonego deficytu neurologicznego (neurologicznego). Jednak to stwierdzenie zostało obalone przez innych48. W tym badaniu monitorowanie masy ciała wykazało spodziewany spadek wagi po operacji, ale szybkie powrót do wagi przedoperacyjnej w ciągu kilku dni, co wskazuje, że myszy regenerują się i normalnie jedzą oraz piją po stałym podwiązaniu ECA. Chociaż masa zwierząt była monitorowana, jest to jedynie pośredni wskaźnik dobrostanu zwierząt i nie wyklucza całkowicie upośledzeń funkcjonalnych, takich jak miejscowe zaburzenia żucia lub ruchowe. Nie przeprowadzono bezpośrednich ocen funkcjonalnych powrotu do zdrowia, co jest ograniczeniem tego badania. Inne badanie porównywało wejście do układu naczyniowego przez CCA lub ECA i wykazało, że wejście przez CCA może prowadzić do zaburzeń reperfuzji krążenia mózgowego, dochodząc do wniosku, że preferowana jest metoda wejścia do ECA53. Po trzecie, prawidłowe i bezpieczne założenie cewnika bez wprowadzania pęcherzyków powietrza, zakrzepów krwi czy wycieku oraz bez utrudniania przepływu w CCA i ICA wymaga znacznej praktyki. Na koniec, w przeciwieństwie do innych metod mikro-zakrycia, takich jak fotozakrzepica z użyciem zastrzyku Rose-Bengal22, nie da się przewidzieć, gdzie mikrosfery ostatecznie osiadną w krążeniu.
Niniejsze badanie celowo nie obejmuje grup kontrolnych negatywnych (fałszywych) ani pozytywnych (fotozakrzepica), ponieważ nie przyniosłyby one dodatkowej wartości dla głównego celu. Sukces tego modelu definiuje liczba mikrosfer umieszczonych w mikrocyrkulacji mózgowej, szczególnie w obszarze okna czaszki, co umożliwia mikroskopię in vivo o wysokiej rozdzielczości. Zabieg pozorowany z definicji nie dawałby mikrosfer w obszarze docelowym i nie oferowałby istotnego porównania dla końcowego obrazowania in vivo . Podobnie włączenie modelu fotozakrzepicy dotyczyłoby zasadniczo innego mechanizmu patofizjologicznego i dlatego wykraczałoby poza zakres tych prac, które koncentrują się na charakteryzacji modelu mikronaczyniowej embolii zamiast porównywania metodologii. Nie prowadzono szerszych analiz histologicznych zatory i ich potencjalnego wpływu na BBB lub lokalną tkankę neuronalną, ponieważ badanie miało na celu priorytetowe traktowanie wizualizacji 3D in vivo nad walidacją na poziomie tkanek.
Szczegółowy protokół chirurgiczny zarówno dla przygotowania okna czaszkowego, jak i modelu zatoru mikronaczyniowego wspiera wiarygodne i powtarzalne badania zmian mikronaczyniowych związanych z zatorem mikronaczyniowym oraz występowania cichych zawałów mózgu na całej półkuli ipsilateralnej. Optymalizacja przygotowania i wstrzyknięcia mieszaniny mikrosfery dodatkowo wzmacniają spójność i wiarygodność tego podejścia eksperymentalnego.

Udar niedokrwienny spowodowany zatorowością dużej tętnicy mózgowej to ostre i często wyniszczające zdarzenie1. Zatory mogą również występować w naczyniach bardziej odległych. W rezultacie mogą rozwinąć się ciche zawały mózgu (SBI); Jak sama nazwa wskazuje, pozostają bezobjawowe i zazwyczaj są wykrywane przypadkowo podczas obrazowania z niezwiązanych powodów 2,3. SBI są powszechne i należą do najczęściej obserwowanych schorzeń mózgowo-naczyniowych podczas autopsji osób starszych 4,5. Badania epidemiologiczne wykazały 20% częstości występowania u osób bez historii udaru. SBI przyczyniają się do zaburzeń poznawczych i demencji, zwiększają ogólną śmiertelność i są czynnikiem ryzyka przyszłych udarów 6,7,8. Zawały mają zazwyczaj tylko kilka milimetrów średnicy i są związane z zatkaniem tętnic penetrujących o średnicy około 100 μm. Te penetratory tworzą rozległe łoże tętnicowe i naczyniowate. Mały mikrozakrzep przechodzący przez tętnice penetrujące i osiadający w mikrokrążeniu poniżej prawdopodobnie pozostanie niewykrywalny na angiografii9. Jednak wiele mikrozakrzepów może być uwalnianych w przypadku migotania przedsionków, blaszek miażdżycowych oraz z innych źródeł 10,11,12,13,14. Poza mikrozakrzepami, inne mikrocząstki (MP), w tym cząstki tłuszczu, agregaty komórkowe, a nawet mikroplastiki, mogą powodować zatory mikronaczyniowe. Kilka badań wykazuje obecność plastikowego MP we krwi i mózgu większych niż średnica kapilary 5μm 15,16.
Mikronaczyniowe zgryzania pozostają stosunkowo słabo zbadane w porównaniu z ostrym udarem i SBI. Niewiele wiadomo o wskaźniku zdarzeń, długoterminowych konsekwencjach oraz możliwych mechanizmach oczyszczania. Jednak zainteresowanie szybko rośnie po udanym klinicznym wprowadzeniu mechanicznej trombektomii w udarze, gdzie mikronaczyniowe zatory mogą powodować zaburzenia mikronaczyniowej reperfuzji po pozornie udanej reanalizacji dużej tętnicy winowajskiej17. Ponadto obserwuje się wzrost badań nad mikroplastikami, które mogą częściowo wywoływać wpływ na zjawisko mikronaczyniowe 18,19,20.
Mikronaczyniowe okluzje w korze myszy można badać m.in. za pomocą mikroskopii wielofotonowej za pomocą okna czaszki. Najczęściej stosowanymi modelami do badania mikronaczyniowych okluzji mózgu są model fotokrzepowy oraz model mikrosfery. Model fototrombotyczny wykorzystuje barwniki fotoczułe do wywołania zatory w wybranych naczyniach (zazwyczaj naczyniach niekapilarnych) poprzez fotoaktywację. Jednak model ten nie pozwala na badanie zatorowości przez dłuższy czas z powodu aktywacji układu fibrinolitowego, który rozpuszcza zator21,22. Ponadto aktywacja światłoczułego barwnika powoduje uszkodzenia jednolitych form tlenu, powodując uszkodzenia śródbłonka i bariery krew-mózg (BBB)23. W badaniach nad funkcjonowaniem śródbłonka i BBB podczas zatorów mózgowych oraz długoterminowym wpływem na krążenie mózgowe i funkcjonowanie mózgu, preferowany jest model mikrosfery. Model iniekcji mikrosfery wykorzystuje mikrosfery wstrzykiwane do krążenia mózgowego do zatkania mikronaczyniamózgowego 9,24,25,26,27,28,29,30. Potencjalną wadą tego modelu jest fakt, że nie jest możliwe wcześniejsze określenie lokalizacji zatorów, w przeciwieństwie do metody fototrombotycznej31,32. Zaletą jest to, że mikrosfery o dobrze określonych średnicach mogą być wstrzykiwane, co celuje w (mikro-) naczynia o określonych średnicach 33,34,35.
Na przestrzeni lat opracowano wiele metod wstrzykiwania mikrosfer do krążenia mózgowego gryzoni. Protokoły te osiągają konsensus w dostępie do trójkąta szyjnego, składającego się z tętnicy szyjnej (CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) oraz tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) do iniekcji mikrosfery wewnątrztętnicowej. Metoda iniekcji wewnątrztętnicznej do mikrosfery różni się w zależności od protokołu na kilka sposobów. Po pierwsze, badania użyły strzykawki 9,26,27,29,33,34 lub cewnika 25,28,30,36. Po drugie, istnieje znaczna zmienność w liczbie i rozmiarze wstrzykiwanych mikrosfer. Średnice mikrosfer zazwyczaj mieścią się w zakresie od 10 do 50 μm, przy czym wybór zależy od wielkości docelowego naczynia. Zasadniczo im większe mikrosfery, tym niższy należy wstrzyknąć, ponieważ tętniczy jest mniej niż naczyńwłosowatych 25,26,30.
Uzyskanie spójnego intra-arterialnego zastrzyku mikrosfery pozostaje wyzwaniem. W praktyce wstrzykiwanych jest duża liczba mikrosfer, jednak tylko ułamek trafia do krążenia mózgowego. Jest to szczególnie problematyczne przy badaniu efektów osadzonych mikrosfer za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo , ponieważ skuteczność tej techniki zależy od obecności mikrosfer w zewnętrznych warstwach kory myszy w obrębie widoku przez przygotowane okno czaszki. Wybór odpowiednich barwników fluorescencyjnych do mikrosfer jest kluczowy, ponieważ łączenie ich z transgenicznymi myszymi modelami i barwieniem wewnątrznaczyniowym może być trudne ze względu na intensywną fluorescencję mikrosfer i nakładające się widma emisyjne.
Mikronaczyniowe okluzje są badane w modelach gryzoni, a efekty synergiczne wielu mikrosfer zostały wcześniej wykazane w mózgach gryzoni ex vivo 9, a także pozorne ekstravazowanie takich cząstek, proces zwany angiofagią 33,35,37,38. Aby umożliwić badania in vivo, opracowano metody mikroskopii wielofotonowej u myszy z oknami czaszkowymi. Celem obecnego badania jest opracowanie i przedstawienie szczegółowego protokołu intraarterialnego wstrzykiwania mikrosfer u myszy, który optymalizuje badanie ich wpływu na tkankę mózgową i los. Główną zaletą tego protokołu jest poprawa efektywności dostarczania, minimalizacja utraty mikrosfery i zwiększenie prawdopodobieństwa ich obecności w rejonie środkowej tętnicy mózgowej (MCA) w obszarze obrazowania okna czaszki. Optymalizowany protokół iniekcji do mikrosfery jest oceniany za pomocą mikroskopii in vivo dwufotonowej oraz obrazowania 3D in situ pośmiertnego z dedykowanym kriomikrotomem39.

<table><tbody><tr><td>Igła o grubości 27 (0,1x16 mm)</td><td>Terumo</td><td>-</td><td>Igła 27 gauge (Krok 2.1.2.)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Articulus</td><td>-</td><td>-</td><td>Oprogramowanie do analizy 3D (Krok 4.2.2 i 4.3.3)</td></tr><tr><td>Betadina 30 ml (100 mg/ml)</td><td>Mylan</td><td>8712207037612</td><td>Betadyna/jod (krok 1.1.8 i 2.2.10.)</td></tr><tr><td>C& Monomer B</td><td>Sun Medical</td><td>7111</td><td>Składnik super glue (Krok 1.3.1.)</td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej (nr 15)</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td>Ostrze do drapania czaszki (Krok 1.2.4.)</td></tr><tr><td>Karprofen (50 mg/ml)</td><td>Zoetis</td><td>-</td><td>Leki przeciwbólowe (kroki 1.1, 1.6, 2.2 i 2.8)</td></tr><tr><td>Katalizator</td><td>Sun Medical</td><td>7110</td><td>Składnik super glue (Krok 1.3.1.)</td></tr><tr><td>Cewnik (średnica 0,31, przenik, 0,64 mm)</td><td>Freudenberg</td><td>228-0661</td><td>Przezroczysty cewnik (Krok 2.1.1.)</td></tr><tr><td>Haczyk z tkanki wykonany przez Costom</td><td>-</td><td>-</td><td>Haczyk na tkankę (Krok 2.3.4.)</td></tr><tr><td>Końcówki bawełniane</td><td>-</td><td>-</td><td>Bawełniana końcówka (Krok 1.1.8, 1.2.4 i 1.5.1.)</td></tr><tr><td>Szkło okładkowe</td><td>Instrumenty Warnera</td><td>64-0724</td><td>Szkło czaszkowe osłony okiennej (Krok 1.4.2.)</td></tr><tr><td>Na zamówienie szyna główka myszy</td><td>-</td><td>-</td><td>Ramka główka do uchwytu na obrazy (Krok 1.3.2).&nbsp;</td></tr><tr><td>Uchwyt na mysz wykonany na zamówienie &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Uchwyt na mysz obrazującą (Krok 1.4.1 i 3.1.1.)</td></tr><tr><td>Niestandardowa rama stereotaktyczna</td><td>-</td><td>-</td><td>Stereotaktyczna rama (Krok 1.1.7.)</td></tr><tr><td>Płyn dentystyczny</td><td>Kulzer</td><td>64707937</td><td>Składnik cementu dentystycznego (Krok 1.3.3.)</td></tr><tr><td>Proszek do cemementu dentystycznego</td><td>Kulzer</td><td>64707945</td><td>Składnik cementu dentystycznego (Krok 1.3.3.)</td></tr><tr><td>Wiertarka dentystyczna &nbsp;</td><td>Saeshin</td><td>&nbsp; L-206</td><td>Ćwiczenie (Krok 1.4.3.)</td></tr><tr><td>Deksametazon (4 mg/ml)</td><td>Centrafarm</td><td>-</td><td>Przedoperacyjne leki (Krok 1.1.4.)</td></tr><tr><td>Kleszcze do rozcinania</td><td>Braun-Aesculap</td><td>BD023R</td><td>Kleszcze (Krok 1.2.2 i 2.3.2.)</td></tr><tr><td>wiertło z zacięciem PK/100,5 (0,5 mm)</td><td>Nauki fine</td><td>19007-05</td><td>Wiertło (Krok 1.4.3.)</td></tr><tr><td>Durateary (3,5 g)</td><td>Alcon</td><td>-</td><td>Maść do oczu (Krok 1.1.8 i 2.2.7.)</td></tr><tr><td>Klej epoksydowy (1g)</td><td>Pattex</td><td>9H PSMG3X</td><td>Klej epoksydowy (krok 1.5.2 i 2.1.1.)</td></tr><tr><td>Drobne mikrokleszcze proste</td><td>Narzędzia do nauki wysokiej klasy</td><td>Dumont #5</td><td>Drobne mikrokleszcze (Krok 2.6.6.)</td></tr><tr><td>FITC-Dextran (70 KDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70S</td><td>Rozwiązanie FITC-Dextran (Krok 2.5.2.)</td></tr><tr><td>Izofluran (1000 mg/g)</td><td>Laboratoria Karizoo S.A.</td><td>118938</td><td>Znieczulenie (Krok 1.1.6 i 2.2.5.)</td></tr><tr><td>duży trójwymiarowy kriomikrotom do obrazowania fluorescencyjnego;</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>-</td><td>large-3D-FICS (Krok 4.3.3)</td></tr><tr><td>Lidokaina (100 mg/ml)</td><td>Aspen</td><td>-</td><td>Znieczulenie miejscowe (Krok 1.2.3. i 2.2.10)</td></tr><tr><td>Mikronożyczki Vannas 3-3/8 cala</td><td>Braun-Aesculap</td><td>OC498R</td><td>Mikronożyczki (Krok 2.6.2)</td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania mikroszwów z okrągłą rączką</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD280R</td><td>Mikroforeceps (Krok 2.3.3.)</td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania mikroszwów z okrągłą rączką</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD281R</td><td>Mikroforeceps zgięty (Krok 1.5.1 & 2.3.3.)</td></tr><tr><td>Mikronaczyniowy klips</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD562R</td><td>Klip naczynia (Krok 2.6.1.)</td></tr><tr><td>Mikrocewnik (średnica 0,23114 mm, średnica 0,27432 mm)</td><td>Mikrolumen</td><td></td><td>Mikrocewnik (Krok 2.1.1.)</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza myszy i sonda odbytnicza</td><td>Stoelting</td><td>53800R</td><td>Poduszka grzewcza (Krok 1.1.2 i 2.2.2.)</td></tr><tr><td>Myszy NG2-DSRed</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA, nr stockowy 008241</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietylenglikol sorbitan monolauran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Tween20 (Krok 2.5.2.)</td></tr><tr><td>Polistyrenowe FluorKule Niebieskie (365/415)</td><td>Invitrogen</td><td>F8829</td><td>Niebieskie mikrosfery (Krok 2.5.1.)</td></tr><tr><td>FluorKule polistyrenowe czerwone (580/605)</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>Czerwona mikrosfera (Krok 2.5.1.)</td></tr><tr><td>Klatka ratunkowa</td><td>-</td><td>-</td><td>Klatka regeneracyjna (Kroki 1.6.2 i 2.8.2.)</td></tr><tr><td>Odwrotne cięcie igły 3/8 zakrzywionej (12mm) z użyciem szwów</td><td>Bbraun</td><td>0762067</td><td>Szew (Krok 2.7.5)</td></tr><tr><td>ropiwaca&iuml; Ne (2 mg/ml)</td><td>-</td><td>-</td><td>Leki&nbsp; (Krok 1.1.5.)</td></tr><tr><td>mały kriomikrotom do obrazowania fluorescencyjnego 3D&nbsp; &nbsp;</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td>Small-3D-FICS (Krok 4.2.2)</td></tr><tr><td>Spongostan</td><td>Ethicon</td><td>MS0005</td><td>Spongostan (Krok 1.4.6.)</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Euromex Microscopen B.V.</td><td>NZ.1903-B</td><td>Mikroskop do operacji (Krok 1.2. 2.1.1.)</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Braun-Aesculap</td><td>BC303R</td><td>Nożyczki chirurgiczne (Krok 1.2.2 i 2.3.2.)</td></tr><tr><td>Pompka strzykawkowa (do strzykawek 1 ml)</td><td>Aparat Havarda</td><td>70-2208</td><td>1 ml pompki strzykawkowej (Krok 2.5.6.)</td></tr><tr><td>Nić, 100m,&nbsp; 4/0 1,5&nbsp; &nbsp;</td><td>Bbraun</td><td>F1134035</td><td>Wątki 4/0.15 (Krok 2.4.3.)</td></tr><tr><td>Myszy TIE2-GFP</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA, nr aktorowy 003658</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysty miotełka</td><td>Thorlabs</td><td>CA6-EU</td><td>Sprężone powietrze (Krok 1.2.5.)</td></tr><tr><td>Uniwersalny przezroczysty polimer</td><td>Sun Medical</td><td>T058E</td><td>Składnik super glue (Krok 1.3.1.)</td></tr></tbody></table>

model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Microvascular Embolism Mouse Model for In Vivo Two-photon Microscopy Using Fluorescent Polystyrene Microspheres

Mikronaczyniowe zgryzania w mózgu są stosunkowo powszechne, ale pozostają w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Wskaźnik zdarzeń, długoterminowe konsekwencje oraz potencjalne mechanizmy rozliczania są w dużej mierze nieznane. Obecne modele stosowane do badania tych zdarzeń, takie jak fotozakrzepica czy iniekcje mikrozatorówek, mają swoje zalety i ograniczenia. Badanie to opracowało szczegółowy protokół, który łączy przygotowanie przewlekłego okna czaszkowego z indukcją mikronaczyniowych zatorów mózgowych poprzez intraarterialne zastrzyki mikrosfer u myszy. Takie rozwiązanie umożliwia długoterminowe obrazowanie in vivo mikronaczynia oraz mikro-zakrycia za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Mikrosfery są dostarczane przez cewnik umieszczony w zewnętrznej tętnicy szyjnej (ECA), która jest trwale podwiązana. Co ważne, wspólna tętnica szyjna (CCA) i tętnica szyjna wewnętrzna (ICA) pozostają nienaruszone przez cały czas i po zabiegu, minimalizując tym samym zaburzenia przepływu krwi w mózgu. Aby ułatwić natychmiastowe obrazowanie in vivo oraz zapobiec skupianiu się mikrosfer lub przyczepianiu się do końcówek pipet i cewnika, mikrosfery są zawieszone w mieszance FITC-Dektranu i 0,1% Tween 20. Technika wtrysku została zweryfikowana za pomocą obrazowania 3D in situ po śmierci w celu określenia rozkładu mikrosfer. To badanie dodatkowo pokazuje swoją użyteczność na przykładzie mikroskopii dwufotonowej in vivo . Takie podejście zapewnia spójną i solidną metodę indukowania i badania mikronaczyniowych zatorowości, umożliwiając badanie ich wpływu i dynamiki oczyszczania za pomocą obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie in situ po śmierci
Skuteczność operacji mikronaczyniowej zatoru została potwierdzona obrazowaniem in situ całego ciała i całego mózgu 4 dni po operacji mikronaczyniowej (Rysunek 3A). Strzałkowy fragment myszy pokazuje osadzenie mikrosfer w mózgu. Rysunek 3B,C przedstawia przykład pobranego mózgu myszy, 1 dzień po operacji mikronaczyniowej embolii. Mikrosfery znajdowały się głównie w półkuli ipsilateralnej, w obszarze przepływu arterii środkowej i przedniej mózgu. Liczba mikrosfer w plasterkach mózgu została znacząco zwiększona, gdy do mieszaniny dodano Tween20 (rysunek 3E). Monitorowanie masy ciała podczas rekonwalescencji po operacji mikrozatoru pokazuje, że myszy traciły mniej na wadze i szybciej wracały do zdrowia po zabiegu po wstrzyknięciu mieszanki mikrosfery zawierającej Tween20 (rysunek 3F).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68939/68939fig3v2.jpg" /> 
Rysunek 3: Rozmieszczenie mikrosfer u myszy po operacji mikronaczyniowej embolii. Lokalizacja in situ mikroskopów o średnicy 10 μm w myszy zwizualizowana za pomocą oprogramowania Articulus41. (A) Przykład całej myszy z płaszczyzny strzałkowej obrazowanej dużymi 3D-FICS po operacji mikronaczyniowej embolii. (B-D) Reprezentatywne obrazy osiowe, koronalne i strzałkowe mózgu myszy, wykonane za pomocą małych 3D-FICS. (E) Średnia liczba wykrytych mikrosfer na 50 μm przekrojów koronalnych mózgu przy grubości około bregmy ± 0,5 mm dla warunków Control i Tween20. Słupki oznaczają średnią ± odchylenie standardowe. Poszczególne wymiary są pokazane jako kropki. Porównanie statystyczne przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu T; wartość p jest oznaczona na wykresie. Wartości odstające zostały zidentyfikowane i usunięte metodą zakresu interkwartylowego (IQR) (n = 1 dla obu grup), co dało ostateczny rozmiar grupy n = 3 dla kontrolnych i n = 14 dla Tween20. (F) Znormalizowane zmiany masy ciała w czasie po operacji mikronaczyniowej embolii w punkcie 0. Waga została znormalizowana do poziomu wyjściowego każdego zwierzęcia podczas operacji. Linie pokazują średnią ± SD na grupę (kontrola, n = 4; Tween20, n = 5) z Control w niebieskim kolorze, a Tween20 w ciemnopomarańczowym. Istotność statystyczna między grupami w każdym momencie czasowym oceniano za pomocą nieparowanych dwustronnych testów T. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/68939fig3v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Iniekcja do mikrosfery i mikroskopia dwufotonowa in vivo 
Podczas iniekcji do mikrosfer cewniki pokryte 5% BSA wykazały wiele mikrosfer przyczepionych do powierzchni cewnika, a mikrosfery przepływające często były skupione, co mogło potencjalnie powodować większe zatyczki (patrz Wideo uzupełniające 1). Ponadto dodanie 5% BSA do mieszaniny mikrosfery, aby zapobiec adhezji i skupienia, nie jest pożądane ze względu na potencjalną odpowiedź immunologiczną po wstrzyknięciu43,44. Aby temu zapobiec, w mieszance mikrosfer zastosowano roztwór Tween20 o stężeniu 0,1%, co skutkowało widocznie większą liczbą mikrosfer przepływających przez cewnik oraz pożądaną liczbą (> 20) mikrosfer w oknie obrazowania (Rysunek 4 i Wideo uzupełniające 2). Rysunek 4A,B przedstawia przeglądowy obraz kory mózgowej z mikroskopii fluorescencyjnej 0,5 godziny po operacji mikronaczyniowej embolii. Każda biała kropka reprezentuje mikrosferę, która blokuje naczynia włosowate w mikronaczyniach mózgowych. Rysunek 4C,D przedstawia dwufotonowe obrazy z-stack 2D jako przykład. Mikrosfery powodują zatory mikronaczyniowe mózgowe z zaburzeniami przelewania, co wskazuje brak barwnika wewnątrzświetlnego poniżej mikrosfery (Rysunek 4E i Wideo Uzupełniające 3). Dodatkowo te zatory powodują zaburzenia BBB poprzez ekstrawazację barwnika FITC-Dextran (rysunek 4F,G).
Wyniki te są zgodne z niską liczbą mikrosfer przyczepionych do cewnika oraz minimalnym skupieniem mikrosfer, które zaobserwowano w cewniku podczas wstrzykiwania mieszaniny mikrosfery i Tweena. Jednak w ostatnich 20 μL mieszaniny mikrosfer w cewniku skupiło się wiele mikrosfer, które nie powinny być wstrzykiwane, aby zapobiec ewentualnemu wystąpieniu dużego zawału (patrz Wideo uzupełniające 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68939/68939fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Dwufotonowa mikroskopia in vivo ułożonych mikrosfer.Przykłady fluorescencyjnych i dwufotonowych obrazów in vivo mikrosfer uwięzionych w korze myszy. (A) Przegląd fluorescencyjny przez okno czaszkowe mikrosfer lodge. (B) Obraz fluorescencyjny wybranego ROI. (C,D) Dwufotonowe obrazy mikroskopii uwięzionych w mikrocyrkulacji mózgowej z wybranym zwrotem kosztów do szczegółowego obrazowania. Obrazy stosu Z są przedstawiane w 2D poprzez obliczenie odchylenia standardowego intensywności pikseli wzdłuż stosu Z. (E-G) Reprezentatywne obrazy mikroskopii in vivo z dwufotonową mikroskopią pokazującą trzy mikronaczyniowe zatory mózgowe. Czerwone strzałki wskazują obszary ekstravazacji FITC-Dekstern, wskazując na zakłócenia BBB i wyciek barwnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/68939fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Specyfikacja systemu mikroskopu dwufotonowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Ustawienia mikroskopu dwufotonowego do obrazowania FITC-dextran i mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Małe ustawienia systemu kriomikrotomowego do obrazowania 3D do obrazowania mózgu myszy z niebieskimi mikrosferami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 3.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Specyfikacje systemu kriomikrotomowego do obrazowania 3D do obrazowania mózgu myszy z niebieskimi mikrosferami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 4.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 5: Duże 3D obrazowanie fluorescencyjne Ustawienia systemu kriomikrotomu do obrazowania całej myszy z czerwonymi mikrosferami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 5.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 6: Duże 3D fluorescencyjne systemy kriomikrotomowe do obrazowania całej myszy z czerwonymi mikrosferami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary table 6.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Wideo uzupełniające 1: Cewnik pokryty powłoką BSA z powłoką 5% z przyczepnością mikrosfery do ściany cewnika oraz skupiskiem mikrosfery w mieszance mikrosfery FITC-Dextran o stężeniu 25 mg/mL podczas wstrzykiwania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary video 1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 2: Cewnik powlekany Tween20 o powierzchni 0,1% z pewną przyczepnością mikrosfery do ściany cewnika, ale bez skupiska mikrosfer w mieszance 25 mg/mL FITC-Dextran z mieszanką Tween20 0,1% z mikrosferami podczas wstrzykiwania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary video 2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 3: 3D segmentacja mikronaczyniowych zatyczek przez mikrosfery. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary video 3.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo uzupełniające 4: Ostateczna objętość wstrzyku do mikrosfery o wysokim stężeniu mikrosfery w 25 mg/ml FITC-Dextran z mieszaniną Tween20 0,1%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary video 4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Plik uzupełniający 1: Weryfikacja zgodności mikrosfery z końcówkami pipety. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary file 1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Immunohistochemiczna ocena pokrycia CD45 po 1, 7 i 28 dniach po operacji mikroembolii, porównując półkule ipsilateralne i przeciwległe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary file 2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Microvascular occlusions in the brain are relatively common but remain largely understudied. The event rate, long-term consequences, and potential ...

Stosując tę metodę iniekcji do mikrosfery, chcemy rozwikłać krótkoterminowe i długoterminowe skutki zatkania kapilar, aby zbadać potencjalne mechanizmy usuwania zbolu w sieci kapilarnych mózgu. Umożliwia obrazowanie in vivo w czasie rzeczywistym oraz śledzenie cząstek fluorescencjowych w sieci kapilarnej kory. Mikrosfery i lokalne skutki można obserwować przez tygodnie po podaniu.Nasze badania pomagają zrozumieć lokalne uszkodzenia tkanek spowodowane przez mikronaczyniowe zgryzania. Te wyniki mogą prowadzić do nowych strategii leczenia. Możemy teraz codziennie i przez tygodnie badać, jak zatkanie naczyń włosowatych zmienia naczynia, aktywuje komórki, zmienia przepływ krwi i uszkadza barierę krew-mózg.Na początek uszczypnij palec u czoła znieczulonej myszy, aby sprawdzić głębokość znieczulenia. Wykonaj nacięcie środkowe o długości około 0,5 centymetra nad tchawicą poniżej żuchwy, używając nożyczek chirurgicznych i wycięć kleszczy. Rozciąć tkankę łączną powierzchowną od powięzi szyjnej za pomocą kleszczy mikro-szwowych, aby odsłonić leżące mięśnie gnykowe mostka.Teraz oddziel lewy i prawy mięsień gnykowy mostka, delikatnie rozrywając tkankę łączną między nimi. Zwij prawy mięsień omohyoidalny ogonowo-bocznie za pomocą haczyka tkankowego. Upewnij się, że prawy trójkąt szyjny, w tym tętnica szyjną wspólna, tętnica szyjna wewnętrzna i tętnica szyjna zewnętrzna, są wyraźnie widoczne.Następnie usuń pozostałą powięzi i tkankę tłuszczową otaczającą tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie oddziel tętnicę szyjną wspólną od nerwu błędnego. Umieść dwie nici 4/0 o średnicy 1,5 wokół tętnicy szyjnej wspólnej i zwiąż je luźno, aby nie utrudniały przepływu krwi.Usuń powięzi i tkankę tłuszczową z tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz tętnicy ciemieniowej tylnej. Następnie tymczasowo podwiązuj tylną tętnicę ciemieniową oraz wszystkie boczne gałęzie tętnicy szyjnej wewnętrznej, w tym tętnicę potyliczną, poprzez wiązanie węzła nitem 4/0 o grubości 1,5. Usuń powięź i tkankę tłuszczową z tętnicy szyjnej zewnętrznej oraz tętnicy skroniowej.Umieść dwa luźne węzły wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy skroniowej, używając nici 4/0 o rozmiarze 1,5. Umieść najbardziej dalszą nić jak najdalej od rozgałęzienia w kształcie litery Y i użyj jej do trwałego podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy skroniowej. Zostaw proxymalny węzeł rozwiązany.Homogenizuj i sonikuj mikrosfery o średnicy 10 mikrometrów, aby uzyskać równomierną zawiesię pojedynczych cząstek. Dodaj 20 mikrolitrów ujednoliconych mikrosfer do 140 mikrolitrów FITC-Dektranu, aby uzyskać końcową objętość 160 mikrolitrów mieszaniny zawierającej 1,44 razy 10 do potęgi pięciu mikrosfer. Na krótko cofnij strzykawkę podłączoną do cewnika, tworząc śluzę powietrzną.Następnie zanurz końcówkę cewnika w przygotowanej mieszance FITC-Dextran/Tween20/mikrosfera i powoli wyciągaj strzykawkę, aż mieszanka znajdzie się w cewniku. Upewnij się, że w cewniku nie ma pęcherzyków powietrza. Włóż strzykawkę z załadowanym cewnikiem do pompy strzykawkowej.Ustaw pompę na 10 mikrolitrów na minutę i pracuj, aż na końcu cewnika pojawi się mała kropla mieszanki mikrosfery. Teraz załóż klips naczyniowy na tętnicę szyjną wewnętrzną i zaciśnij jeden z wcześniej przygotowanych węzłów bliższych wokół tętnicy szyjnej wspólnej. Za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielkie nacięcie ukośne w tętnicy szyjnej zewnętrznej około 0,5 milimetra dalej od nici ligacyjnej, zapewniając, że rozmiar nacięcia jest nieco mniejszy niż średnica cewnika.Wchłanij krew sterylną ściereczką. Krótko uruchom pompę strzykawkową, aby utworzyć kroplę mieszanki mikrosfery na końcówce cewnika, potwierdzając, że w końcówce nie ma powietrza. Otwórz nacięcie tętnicy szyjnej zewnętrznej i wprowadź cewnik za pomocą drobnych mikrokleszczy.Następnie zabezpiecz cewnik w zewnętrznej tętnicy szyjnej, zaciskając szew bliższy wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej. Stopniowo pompuj z częstotliwością 10 mikrolitrów na minutę, aż tętnica wyraźnie się powiększy, a zielony barwnik FITC wypełni zewnętrzną tętnicę szyjną, potwierdzając skuteczność wstrzyknięcia. Następnie usuń klips naczynia z tętnicy szyjnej wewnętrznej.Następnie zwiększ przepływ pompy strzykawkowej do 20 mikrolitrów na minutę. Potwierdź skuteczność mikrosfery, potwierdzając, że tętnica szna wewnętrzna jest dyskretna od tylnego rozgałęzienia tętnicy ciemieniowej wypełniona barwnikiem FITC. Po pomyślnym wstrzyknięciu usuń nitkę, która wiązała wspólną tętnicę szyjną, aby umożliwić przepływ mieszaniny mikrosfery do tętnicy szyjnej wewnętrznej.Podczas wstrzyknięcia barwnik FITC nadal jest obserwowany w tętnicy szyjnej zewnętrznej. Wyłącz pompę strzykawkową, gdy mieszanka w cewniku osiągnie poziom 80 mikrolitrów, aby zatrzymać wstrzyknięcie. Następnie podwiązuj wspólną tętnicę szyjną, przetnij wewnętrzną tętnicę szyjną i delikatnie wyjmij cewnik, pozostając przy tym nić zabezpieczająca na miejscu.Trwałe podwiązanie zewnętrznej tętnicy szyjnej, zaciskając nitkę, która zabezpieczała cewnik. Usuń klips naczyniowy i przewleki wokół tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz tętnicy ciemieniowej tylnej części ciała, aby przywrócić przepływ krwi. Sukces operacji mikronaczyniowej zatory potwierdzono obrazowaniem in situ na całe ciało i całego mózgu cztery dni po zabiegu.Strzałkowe cięcie mózgu wykazało osadzenie mikrosfer w mózgu. Pobrane mózgi myszy obrazowane dzień po operacji wykazały, że mikrosfery były głównie osadzone w półkuli ipsilateralnej, w terenie przepływu tętnic środkowych i przednich. Liczba mikrosfer w plasterkach mózgu znacznie wzrosła, gdy do mieszanki mikrosfery dodano Tween20.Myszy schudły mniej i szybciej wracały do zdrowia po operacji, gdy wstrzyknięto mieszankę mikrosfery zawierającą Tween20. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kory mózgu wykonane 0,5 godziny po operacji wykazały poszczególne białe kropki, reprezentujące mikrosfery zamykające naczynia włosowate. Dwufotonowe obrazy projekcji stosu z Z-stack pokazały mikrosfery powodujące mikronaczyniowe zatory mózgowe przy zaburzeniu przelewu.Zatorowości powodują także uszkodzenia bariery krew-mózg poprzez widoczny wyciek barwnika z naczyń.

microvascular-embolism-mouse-model-for-vivo-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ten film demonstruje procedurę generowania udaru fotozakrzepowego w modelu mysim poprzez laserowe oświetlenie nienaruszonej czaszki po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru fotozakrzepowego w modelu mysim: technika oświetlenia laserowego przez czaszkę myszy po podaniu barwnika światłoczułego w celu wywołania fotozakrzepicy

Ten film demonstruje technikę mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania powstawania skrzepliny w modelu mysim. Myszowi wstrzykuje się polisacharyd znakowany fluoroforem w celu monitorowania krążenia krwi. Po oświetleniu światłem o dużym natężeniu, fototoksyczna indukcja urazu w mikrokrążeniu ucha prowadzi do powstania skrzepliny, co potwierdza się poprzez wizualizację przeszkody w przepływie krwi.

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna do badania tworzenia się skrzeplin mikronaczyniowych

Źródło: Jongbloets, B. C., et al. Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo. J. Vis. Exp. (2019) Ten film demonstruje procedurę mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej do wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachłanających głowę podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej 

Source: Nishimura, C.  Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego wirusem HIV. J. Vis. Exp. (2016). Ten film pokazuje wizualizację in vivo naczyń włosowatych kory mózgowej myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Przedstawiono w nim etapy wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego znieczulonej myszy z cienkim oknem korowym czaszki, przygotowywania zestawu do obrazowania i uzyskiwania szczegółowych obrazów struktur...

 Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania in vivo mikrokrążenia mózgu myszy 

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Protokół opisuje metodę wstrzykiwania komórek nowotworowych drogą przezskórnego nakłucia do cisterna magna, która silnie indukuje przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, zmniejszając uraz i obciążenie guzem pozaczaszkowym.

Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Poznaj metodę mikronaczyniowej embolii u myszy z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych do mikroskopii dwufotonowej in vivo. Technika umożliwia badanie skutków zablokowania naczyń włosowatych mózgu.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych (Wideo) | JoVE Journal

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Przeglądaj więcej filmów