Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych
21 listopada 2025
Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.
Stosując tę metodę iniekcji do mikrosfery, chcemy rozwikłać krótkoterminowe i długoterminowe skutki zatkania kapilar, aby zbadać potencjalne mechanizmy usuwania zbolu w sieci kapilarnych mózgu. Umożliwia obrazowanie in vivo w czasie rzeczywistym oraz śledzenie cząstek fluorescencjowych w sieci kapilarnej kory. Mikrosfery i lokalne skutki można obserwować przez tygodnie po podaniu.
Nasze badania pomagają zrozumieć lokalne uszkodzenia tkanek spowodowane przez mikronaczyniowe zgryzania. Te wyniki mogą prowadzić do nowych strategii leczenia. Możemy teraz codziennie i przez tygodnie badać, jak zatkanie naczyń włosowatych zmienia naczynia, aktywuje komórki, zmienia przepływ krwi i uszkadza barierę krew-mózg.
Na początek uszczypnij palec u czoła znieczulonej myszy, aby sprawdzić głębokość znieczulenia. Wykonaj nacięcie środkowe o długości około 0,5 centymetra nad tchawicą poniżej żuchwy, używając nożyczek chirurgicznych i wycięć kleszczy. Rozciąć tkankę łączną powierzchowną od powięzi szyjnej za pomocą kleszczy mikro-szwowych, aby odsłonić leżące mięśnie gnykowe mostka.
Teraz oddziel lewy i prawy mięsień gnykowy mostka, delikatnie rozrywając tkankę łączną między nimi. Zwij prawy mięsień omohyoidalny ogonowo-bocznie za pomocą haczyka tkankowego. Upewnij się, że prawy trójkąt szyjny, w tym tętnica szyjną wspólna, tętnica szyjna wewnętrzna i tętnica szyjna zewnętrzna, są wyraźnie widoczne.
Następnie usuń pozostałą powięzi i tkankę tłuszczową otaczającą tętnicę szyjną wspólną. Ostrożnie oddziel tętnicę szyjną wspólną od nerwu błędnego. Umieść dwie nici 4/0 o średnicy 1,5 wokół tętnicy szyjnej wspólnej i zwiąż je luźno, aby nie utrudniały przepływu krwi.
Usuń powięzi i tkankę tłuszczową z tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz tętnicy ciemieniowej tylnej. Następnie tymczasowo podwiązuj tylną tętnicę ciemieniową oraz wszystkie boczne gałęzie tętnicy szyjnej wewnętrznej, w tym tętnicę potyliczną, poprzez wiązanie węzła nitem 4/0 o grubości 1,5. Usuń powięź i tkankę tłuszczową z tętnicy szyjnej zewnętrznej oraz tętnicy skroniowej.
Umieść dwa luźne węzły wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy skroniowej, używając nici 4/0 o rozmiarze 1,5. Umieść najbardziej dalszą nić jak najdalej od rozgałęzienia w kształcie litery Y i użyj jej do trwałego podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej i tętnicy skroniowej. Zostaw proxymalny węzeł rozwiązany.
Homogenizuj i sonikuj mikrosfery o średnicy 10 mikrometrów, aby uzyskać równomierną zawiesię pojedynczych cząstek. Dodaj 20 mikrolitrów ujednoliconych mikrosfer do 140 mikrolitrów FITC-Dektranu, aby uzyskać końcową objętość 160 mikrolitrów mieszaniny zawierającej 1,44 razy 10 do potęgi pięciu mikrosfer. Na krótko cofnij strzykawkę podłączoną do cewnika, tworząc śluzę powietrzną.
Następnie zanurz końcówkę cewnika w przygotowanej mieszance FITC-Dextran/Tween20/mikrosfera i powoli wyciągaj strzykawkę, aż mieszanka znajdzie się w cewniku. Upewnij się, że w cewniku nie ma pęcherzyków powietrza. Włóż strzykawkę z załadowanym cewnikiem do pompy strzykawkowej.
Ustaw pompę na 10 mikrolitrów na minutę i pracuj, aż na końcu cewnika pojawi się mała kropla mieszanki mikrosfery. Teraz załóż klips naczyniowy na tętnicę szyjną wewnętrzną i zaciśnij jeden z wcześniej przygotowanych węzłów bliższych wokół tętnicy szyjnej wspólnej. Za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielkie nacięcie ukośne w tętnicy szyjnej zewnętrznej około 0,5 milimetra dalej od nici ligacyjnej, zapewniając, że rozmiar nacięcia jest nieco mniejszy niż średnica cewnika.
Wchłanij krew sterylną ściereczką. Krótko uruchom pompę strzykawkową, aby utworzyć kroplę mieszanki mikrosfery na końcówce cewnika, potwierdzając, że w końcówce nie ma powietrza. Otwórz nacięcie tętnicy szyjnej zewnętrznej i wprowadź cewnik za pomocą drobnych mikrokleszczy.
Następnie zabezpiecz cewnik w zewnętrznej tętnicy szyjnej, zaciskając szew bliższy wokół tętnicy szyjnej zewnętrznej. Stopniowo pompuj z częstotliwością 10 mikrolitrów na minutę, aż tętnica wyraźnie się powiększy, a zielony barwnik FITC wypełni zewnętrzną tętnicę szyjną, potwierdzając skuteczność wstrzyknięcia. Następnie usuń klips naczynia z tętnicy szyjnej wewnętrznej.
Następnie zwiększ przepływ pompy strzykawkowej do 20 mikrolitrów na minutę. Potwierdź skuteczność mikrosfery, potwierdzając, że tętnica szna wewnętrzna jest dyskretna od tylnego rozgałęzienia tętnicy ciemieniowej wypełniona barwnikiem FITC. Po pomyślnym wstrzyknięciu usuń nitkę, która wiązała wspólną tętnicę szyjną, aby umożliwić przepływ mieszaniny mikrosfery do tętnicy szyjnej wewnętrznej.
Podczas wstrzyknięcia barwnik FITC nadal jest obserwowany w tętnicy szyjnej zewnętrznej. Wyłącz pompę strzykawkową, gdy mieszanka w cewniku osiągnie poziom 80 mikrolitrów, aby zatrzymać wstrzyknięcie. Następnie podwiązuj wspólną tętnicę szyjną, przetnij wewnętrzną tętnicę szyjną i delikatnie wyjmij cewnik, pozostając przy tym nić zabezpieczająca na miejscu.
Trwałe podwiązanie zewnętrznej tętnicy szyjnej, zaciskając nitkę, która zabezpieczała cewnik. Usuń klips naczyniowy i przewleki wokół tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicy szyjnej wewnętrznej oraz tętnicy ciemieniowej tylnej części ciała, aby przywrócić przepływ krwi. Sukces operacji mikronaczyniowej zatory potwierdzono obrazowaniem in situ na całe ciało i całego mózgu cztery dni po zabiegu.
Strzałkowe cięcie mózgu wykazało osadzenie mikrosfer w mózgu. Pobrane mózgi myszy obrazowane dzień po operacji wykazały, że mikrosfery były głównie osadzone w półkuli ipsilateralnej, w terenie przepływu tętnic środkowych i przednich. Liczba mikrosfer w plasterkach mózgu znacznie wzrosła, gdy do mieszanki mikrosfery dodano Tween20.
Myszy schudły mniej i szybciej wracały do zdrowia po operacji, gdy wstrzyknięto mieszankę mikrosfery zawierającą Tween20. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kory mózgu wykonane 0,5 godziny po operacji wykazały poszczególne białe kropki, reprezentujące mikrosfery zamykające naczynia włosowate. Dwufotonowe obrazy projekcji stosu z Z-stack pokazały mikrosfery powodujące mikronaczyniowe zatory mózgowe przy zaburzeniu przelewu.
Zatorowości powodują także uszkodzenia bariery krew-mózg poprzez widoczny wyciek barwnika z naczyń.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szczegółowe, krok po kroku podejście do tworzenia modelu mysiego z chronicznym oknem czaszkowym i zatorowością mikro naczyniową, zoptymalizowanego pod kątem obrazowania za pomocą dwufotonowej mikroskopii in vivo. Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjne polistyrenowe mikrosfery do badania efektów zamykania naczyń włosowatych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania mikronaczyniowe
- Techniki obrazowania in vivo
Wprowadzenie
- Zrozumienie konsekwencji zatorów mikro naczyniowych jest kluczowe dla opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym umożliwia śledzenie cząsteczek fluorescencyjnych w sieci naczyń włosowatych mózgu.
- Poprzednie badania wykazały, że zapychanie naczyń włosowatych może prowadzić do lokalnych uszkodzeń tkanki.
- Celem niniejszych badań jest wyjaśnienie mechanizmów usuwania zatorów w mózgu.
Cel badania
- Zbadanie krótkoterminowych i długoterminowych skutków zatorów w kapilarach.
- Zrozumienie wpływu okluzji mikronaczyniowych na przepływ krwi oraz barierę krew-mózg.
- Analiza potencjalnych strategii terapeutycznych w stanach związanych z uszkodzeniem mikronaczyniowym.
Zastosowane metody
- Utworzenie przewlekłego okna czaszkowego u myszy do obrazowania.
- Wtryskiwanie fluorescencyjnych mikrosfer w celu wywołania zatorowości naczyniowej.
- Wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej do obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Obrazowanie pooperacyjne w celu potwierdzenia zatrzymania się mikrosfer w mózgu.
Główne wyniki
- Mikrosfery osadziły się głównie w półkuli ipsilateralnej.
- Po dodaniu Tween20 zaobserwowano zwiększoną liczbę mikrosfer.
- Myszy, którym wstrzyknięto Tween20, wykazały szybszą rekonwalescencję po operacji.
- Mikroskopia fluorescencyjna ujawniła zatkanie naczyń kapilarnych przez mikrosfery.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie niedrożności mikronaczyniowych in vivo.
- Wyniki mogą dostarczyć nowych informacji na temat strategii leczenia schorzeń mózgowego mikrokrążenia.
- Badanie to pogłębia zrozumienie dynamiki przepływu krwi i uszkodzeń tkanek w mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele zatorowości mikro naczyniowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer oraz dwufotonowej mikroskopii in vivo stanowią niezawodną platformę do analizy mechanizmów i następstw mikrozatorowości mózgu. Podejście to umożliwia wysokorozdzielcze, podłużne śledzenie zdarzeń naczyniowych i odpowiedzi tkankowych, co zwiększa pewność prognostyczną w procesie walidacji celów naczyniowo-neuronalnych we wczesnej fazie. Powtarzalność modelu oraz ilościowe wyniki obrazowania sprawiają, że jest on cennym narzędziem w triage'u portfolio oraz w redukcji ryzyka mechanistycznego podczas poszukiwania leków w obszarze naczyniowo-neuronalnym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących uszkodzeń naczyniowo-nerwowych poprzez kontrolowane indukowanie mikrozakrzepów.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka dzięki wizualizacji odpowiedzi naczyń, komórek i bariery krew-mózg w czasie.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów terapeutycznych poprzez powiązanie zdarzeń zatorowych z wtórnym uszkodzeniem tkanek i dynamiką ich oczyszczania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowej oceny niedrożności mikronaczyniowej i reperfuzji.
- Dostarcza powtarzalne, wysokotreściowe wyniki obrazowania, odpowiednie do standaryzacji analizy i porównań między badaniami.
- Umożliwia przesiewowe badanie potencjalnych interwencji ukierunkowanych na usuwanie zatorów lub neuroprotekcję naczyniową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami uszkodzeń mikro naczyniowych mózgu istotnymi dla danej choroby, co umożliwia translacyjne poszukiwanie biomarkerów.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu podłużnego śledzenia wyników.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację odpowiedzi tkanek i naczyń na mikrookluzyjne zatory.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne, stanowiąc pomost między badaniami mechanisticznymi a badaniami translacyjnymi w dziedzinie biologii naczyniowo-nerwowej.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących uszkodzeń mikro naczyniowych i mechanizmów oczyszczania z wykorzystaniem obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Przesiewy: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki służące do oceny potencjalnych terapeutyków in vivo.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie stopnia zatorowości, uszkodzeń tkanek i powrotu do sprawności w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z punktami końcowymi istotnymi dla choroby oraz opracowywaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do badań naczyniowo-mózgowych i testowania interwencji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów naczyniowo-nerwowych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzacji protokołów obrazowania i iniekcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie ilościowych, podłużnych danych na temat wyników naczyniowych i tkankowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów naczyniowo-nerwowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o solidne dowody in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii, obrazowania in vivo oraz ilościowej analizy zdarzeń naczyniowych.
- Wymaga dostępu do mikroskopii dwufotonowej oraz infrastruktury do obrazowania 3D po śmierci zwierzęcia.
- Konieczna jest standaryzacja mieszanin wstrzykiwanych oraz protokołów obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest dostosowana do różnych modeli mysich, lecz może wymagać optymalizacji dla różnych obszarów naczyniowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność techniczną oraz konieczność podłużnego monitorowania zwierząt.
