W artykule przedstawiono protokół rejestracji in vivo aktywności elektrycznej neuronów peptydergicznych podwzgórza z wykorzystaniem elektrofizjologii całokomórkowych klamer u nienaruszonych larw danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
W artykule przedstawiono protokół rejestracji in vivo aktywności elektrycznej neuronów peptydergicznych podwzgórza z wykorzystaniem elektrofizjologii całokomórkowych klamer u nienaruszonych larw danio pręgowanego.
Podwzgórze to starożytny obszar mózgu, który reguluje różne aspekty fizjologii i zachowania, w tym sen i czuwanie, apetyt, homeostazę energetyczną, lęk, depresję i interakcje społeczne. Określone populacje neuronów w podwzgórzu wywierają swoje działanie poprzez uwalnianie neuroprzekaźników i neuropeptydów. Zapis całokomórkowy jest niezbędnym podejściem do badania roli tych czynników w przekaźnictwie synaptycznym i funkcjonowaniu mózgu. Jednak dostęp do neuronów podwzgórza w celu zapisów elektrofizjologicznych u nienaruszonych ssaków jest trudny ze względu na ich lokalizację głęboko w mózgu. W rezultacie nasza wiedza na temat wewnętrznych właściwości i funkcji fizjologicznych neuronów podwzgórza jest ograniczona. Larwa danio pręgowanego jest użytecznym alternatywnym modelem do badania neuronów podwzgórza ze względu na przezroczysty i mały, ale dobrze zachowany mózg kręgowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół rejestracji in vivo całokomórkowych naszywek na neuronach podwzgórza u nienaruszonych larw danio pręgowanego. Korzystając z tej techniki, możemy nagrywać z neuronów peptydygicznych w podwzgórzu, badać reakcje tych neuronów na bodźce czuciowe i badać ich wpływ na neurony znajdujące się w dalszej części podwzgórza. Ta eksperymentalna technika stanowi zatem użyteczne podejście do badania fizjologicznych funkcji neuronów neuropeptydergicznych podwzgórza u nienaruszonych zwierząt.
Jako popularny model zwierzęcy kręgowców, danio pręgowany (Danio rerio) jest szeroko stosowany w badaniach neurobiologicznych i ma kilka zalet1. Ich zestaw genów i architektura mózgu są wysoce konserwatywne u ssaków i mają bogaty repertuar behawioralny, co czyni je przydatnymi do badania mechanizmów genetycznych i neuronalnych, które leżą u podstaw zachowań, takich jak sen, lęk, depresja i interakcje społeczne 2,3,4,5,6 . Ich niewielkie rozmiary i niskie koszty utrzymania sp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Instytucjonalnego (IACUC) na Uniwersytecie w Szanghaju (protokół na zwierzętach YS 2025-169) oraz IACUC na Uniwersytecie Kalifornijskim (protokół na zwierzętach 1836). Danio pręgowany od 5 do 7 dni po zapłodnieniu (dpf) karmiono wrotkami i wykorzystywano do eksperymentów. Na tym etapie rozwoju płeć nie jest określona. Do hodowli wykorzystano dorosłe osobniki danio pręgowanego na masie perłowej [mitfa(w2/w2)] w tle24 .
1. Roztwory i receptury
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym artykule przedstawiamy udoskonaloną technikę rejestracji metodą patch-clamp z całej komórki in vivo do badania neuronów podwzgórza u nienaruszonego danio pręgowanego, koncentrując się w szczególności na neuronach hipokretynowych (Hcrt).
Jak przedstawiono w Rycina 1nasza metodologia umożliwia bezpośrednie rejestracje elektrofizjologiczne z tych neuronów położonych głęboko w mózgu u nienaruszonego zwierzęcia (Rysunek 1A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisany tutaj protokół umożliwia rejestrację neuronów peptydergicznych w podwzgórzu larwy danio pręgowanego, jednym z najgłębszych i najtrudniejszych technicznie obszarów mózgu. Ze względu na nieodłączną trudność tego przygotowania, udane nagrania patch-clamp wymagają skrupulatnego zwrócenia uwagi na kilka krytycznych parametrów, a mianowicie jakość pipety, technikę podejścia, czystość roztworu i zdrowie tkanek. Czynniki te łącznie decydują o prawdopodobieństwie osiągnięcia i utrzymania stabilnych zapisów giga-seal. Po p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie występują konflikty interesów i nie mają nic do ujawnienia.
Serdecznie dziękujemy dr. Danielowi Wagenaarowi za pomoc w projektowaniu urządzeń do eksperymentów optogenetycznych. Praca ta była wspierana przez granty R35 NS122172 i R34 NS126800 z National Institutes of Health dla D.A.P. oraz Shanghai Overseas Talents Introduction Program dla R.Z.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wzmacniacz | Akson | 700 mld | |
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Sutter | Zobacz materiał BF100-58-10 Zobacz materiał BF100-58-10 | |
| Kamera CCD | Dage-MTI | IR-1000 (wersja IR-1000) | |
| Komputery do zapisów elektrofizjologicznych | Dolina | Precyzja 3660 | |
| Digidata (dane cyfrowe) | Akson | 1440A | |
| Klatka Faradaya | Zamówienie | ||
| Kleszcze | F.S.T. | Dumont #5 | |
| Inkubator | Lonroy powiedział: | GZP-150B | |
| Filtr membranowy | Millipore Sigma | SLGV004SL | |
| Mikro nóż | F.S.T. | 10318-14 | |
| Cel | Olympus | Mplan 5X/0,1; UMPlanFI/IR 60X/0.9W | |
| Pompa perystaltyczna | Dłuższy | Przekaźnik BT100-1L | |
| Uchwyt na pipety | Narishige powiedział: | H-7 | do preparacji |
| Ściągacza | Instrument Suttera | Zobacz materiał P-97 | |
| Mikroskop stereoskopowy do fluorescencyjnych badań przesiewowych i preparacji | Olympus | SZX16 | |
| Stymulator | A.M.P.I | Mistrz8 powiedział: | |
| Mikromanipulator trójwymiarowy | Instrument Suttera | Zobacz materiał MPC-325 | |
| Pionowy mikroskop DIC na podczerwień | Olympus | BX51WI | |
| Stół wibroizolacyjny | TMC (Międzynarodowa Organizacja T | 61-541-06 | |
| Monitor wideo | SŁOŃCE | SP-717 (wersja angielska) | |
| Kąpiel wodna | Yiheng powiedział: | HWS-12 powiedział: | |
| Tłumacz X-Y | Zamówienie |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.