Badania biodegradacji tlenowej materiałów z użyciem naturalnego inokulum morskiego i zamkniętego respirometru

Nasze badania ilościowo określają tempo biodegradacji tlenowej oraz poziom naturalnych materiałów w środowisku morskim, wykorzystując naturalne inokulum wody morskiej do porównania danych. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują ograniczone możliwości testowania oraz brak infrastruktury odpowiadającej rosnącemu zapotrzebowaniu na badania biodegradacji, przy jednoczesnym zapewnieniu jednolitych i przejrzystych metod we wszystkich laboratoriach. Na początek zbierz od 10 do 20 litrów wody morskiej do 20-litrowego balonu wyłukowanego kwasem, używając dużej butelki Niskin.

Przetransportuj wypełniony balon z powrotem do laboratorium. Przelej jeden litr całej wody morskiej z balony do butelki bursztynowej HDPE o pojemności jednego litra z wyłukowaniem kwasem do analizy cząstek węglowych i azotu. Przefiltruj go przez 0,2-mikrometrową, niskoazotową, celulozową membranę octanową.

Teraz napełnij kolbę o pojemności jednego, dwóch lub czterech litrów do połowy wodą morską. Jeśli woda morska zawiera materię organiczną o wysokiej zawartości cząstek, przesij ją przez siatkę o średnicy 20 mikrometrów, aby usunąć duże, niejednorodne cząstki. Następnie pobierz 60 mililitrów filtratu do butelki z polietylenu ługowanej kwasem do analizy rozpuszczonego azotu i fosforu.

Luźno zakryj otwór balona, aby umożliwić warunki aerobowe. Przechowuj w ciemności w temperaturze 30 stopni Celsjusza do siedmiu dni. Następnie umieść 10 do 15 gramów eksperymentalnego podłoża w słoiku do frezowania ze stali nierdzewnej o pojemności 50 mililitrów.

Z kulą ze stali 20 mm. Zanurz słoik do mielenia w ciekłym azocie na 15 minut, aby go złamał. Przymocuj słoik do frezowania w załączniku do młyna kulowego.

Następnie ustaw instrument na 30 herców i dwie minuty i 30 sekund, i naciśnij start. Przeprowadz mielenie cztery razy, z 30 sekundami chłodzenia w ciekłym azocie między cyklami. Przed rozpoczęciem testu zmielić podłoże do jednolitego rozmiaru cząstek od 0,10 do 0,25 milimetra.

Używając precyzyjnej wagi o czułości 0,001 grama, odważ 0,5 grama chlorku amonu na litr i 0,1 grama na litr monozasadowego fosforanu potasu. Dodaj nieorganiczne składniki odżywcze do kolbyki. Zdobądź objętość do znakowania wodą morską.

Następnie wrzuć do środka i mieszać na tacyce, aż wszystkie sole się rozpuszczą. Na wadze analitycznej odważ 20 miligramów podłoża eksperymentalnego lub kontrolnego. Zapisz pełną wagę odczytu i odłóż fiolkę na bok.

Aby ustawić zbiorniki reaktorowe, użyj kwas wyługowanej pipety wolumetrycznej o pojemności 75 mililitrów z mechanicznym kontrolerem pipety i wciągaj wodę morską, aby wydać 75 mililitrów wody morskiej uzupełnionej składnikami odżywczymi do każdego zbiornika reaktora. Usuń około trzech mililitrów wody morskiej z każdego statku. Następnie umieść ją na czystej powierzchni obok naczynia, aby spłukać zmielone podłoże z rozdartej fiolki.

Następnie przenieś zmielone podłoże do odpowiedniego zbiornika reaktora z rozerwanej fiolki. Załóż uszczelkę O na krawędzi naczynia reaktora. Następnie załóż dwukanałową pokrywkę na uszczelkę O-ring i zabezpiecz ją śrubką.

Podłącz każdy zbiornik reaktora do odpowiadających mu linii gazowych lub kondensacyjnej. Mocno włóż przewody gazowe do odpowiednich portów wlotowych i wylotowych pokrywy. Włącz platformę wstrząsającą na 0,05G w trybie ciągłym.

Sprawdź wzrokowo, czy wszystkie naczynia są zabezpieczone, a następnie zamknij drzwi inkubatora. W oprogramowaniu instrumentów przejdź do Eksperyment i kliknij Konfiguracja. Wprowadź numery kanałów startowych i końcowych z rozwijanych menu odpowiadających zajętym kanałom.

Ustaw próg odświeżania na 0,50. Odśwież interwał do NA i odśwież okno na Auto. Następnie zaznacz opcję czujników czyszczenia w Różne konfiguracje.

Upewnij się, że nie wybrano automatycznego pomiaru objętości, dodatniego poboru tlenu oraz trybu otwartego przepływu. Ustaw interwał próbek na 8.00. Następnie ustaw jednostki gazu i czasu według potrzeb.

Jeśli używasz pierwotnej sondy temperatury do korekcji temperatury inkubacji, upewnij się, że nie jest wybrana opcja "Ręcznie wprowadź temperatury komory". Zaznacz opcję Wentylacja i upewnij się, że nie jest wybrany tryb odpływu. Teraz wybierz Chamber Setup i wpisz opisowe etykiety kanałów.

Jeśli wskaże się wyciek, upewnij się, że uszczelka O-ring jest czysta, osadzona i wolna od cząstek czy włókien. Dokręć nakrętkę. Sprawdź połączenia rur na wlocie i wylocie.

Przycinaj zużyte lub zdeformowane końce rur ostrym ostrzem, aby uzyskać czyste cięcia. W menu wybierz Narzędzia, następnie kliknij Menu Serwis i popewnij, że główna sonda temperatury mierzy 30 stopni Celsjusza z dwoma wahaniami stopni i jest stabilna. Kliknij Run, aby rozpocząć eksperyment.

Zapisz plik eksperymentu pod opisową nazwą, wraz z datą, i zapisz nazwę pliku w arkuszu danych. Skumulowana produkcja dwutlenku węgla w ciągu 84 dni potwierdziła oczekiwane wyniki. W ciągu 84 dni celuloza wykazała szybką produkcję dwutlenku węgla po krótkim opóźnieniu i osiągnęła około 700 mikromolów.

PHA wykazało wolniejsze początkowe tempo w ciągu trzech dni. Kontrola wody morskiej pozostała niska, wynosiła 150 mikromolów. Pojedyncze replikacje z negatywną kontrolą wykazały niską zmienność, przy czym wszystkie krzywe pozostawały blisko siebie.

Replikacje z kontrolą celulozową wykazywały konsekwentnie niską zmienność, potwierdzając stabilną wydajność we wszystkich czterech replikacjach. W zbiorze danych z negatywnym wynikiem, replika piąta wykazała anomalny wzrost tempa produkcji dwutlenku węgla, prawdopodobnie spowodowany przez zmienną materię organiczną, ale jego skumulowana produkcja zaczęła się stabilizować przy 100 mikromolach. Repliki jedna na sześć miała niższą skumulowaną produkcję dwutlenku węgla w porównaniu z innymi, co sugeruje potencjalne problemy techniczne.

Standardowy błąd średniej skumulowanej produkcji dwutlenku węgla w kontroli ujemnej wyniósł 2,5%, co wskazuje na niską zmienność między replikacjami. Błąd standardowy dla pozytywnej kontroli celulozy wyniósł 0,83%, co dodatkowo potwierdza wysoką powtarzalność testu biodegradacji. PHA charakteryzuje się wysoką mineralizacją bliską dodatniej kontroli z błędem standardowym porównywalnym do kontroli.

Protokół ten rozwiązuje lukę w ustandaryzowanych, dostępnych metodach monitorowania biodegradowalności materiałów w środowisku morskim dla przemysłu, środowiska akademickiego i organów regulacyjnych. Protokół zapewnia szybszy, ustandaryzowany sposób bezpośredniego pomiaru tej biodegradacji, z krótszym czasem testu podczas jednoczesnej oceny próbki. Protokół umożliwia wysokoprzepustowe standaryzowane testy porównywalności materiałów i laboratoriów dla uczenia maszynowego oraz modelowania predykcyjnego wydajności materiałów.