Name: Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy Ixodidae. Protokół umożliwia badanie lokalizacji patogenów w tkankach wektorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy szczerze doceniają wsparcie finansowe udzielone przez następujące organizacje i agencje: Europejską Radę Badań (ERC) w ramach Europejskiego Programu Badań i Innowacji Horyzont 2020 (umowa grantowa nr 101000365, PREPARE4VBD); Szwedzkiej Agencji Współpracy Międzynarodowej (Sida); Szwajcarskiej Agencji ds. Rozwoju i Współpracy (SDC); Australijskie Centrum Międzynarodowych Badań Rolniczych (ACIAR); rząd Norwegii; Niemieckim Federalnym Ministerstwem Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (BMZ); oraz rząd Republiki Kenii. Rua Khogali z wdzięcznością dziękuje wsparciu Niemieckiej Służby Wymiany Akademickiej (DAAD) poprzez stypendium ARPPIS-DAAD oraz stypendium podyplomowe Uniwersytetu w Pretorii. Poglądy wyrażone w tej publikacji są poglądami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy agencji finansujących.

Badanie to uzyskało etyczną zgodę od Komitetu ds. Etyki Uniwersytetu Pwani (Ref: ERC/EXT/002/2020E) oraz licencję badawczą od Kenijskiej Narodowej Komisji ds. Nauki, Technologii i Innowacji (NACOSTI) (Ref: NACOSTI/P/22/16467). W tym badaniu króliki służyły do utrzymania i wychowu kleszczy w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych w Międzynarodowym Centrum Fizjologii i Ekologii Owadów (icipe). Wszystkie procedury zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) zgodnie ze Standardowymi Procedurami Operacyjnymi (2017). Obsługa zwierząt była prowadzona przez wykwalifikowany personel, zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz przepisami Kenii, aby zapewnić humanitarną opiekę i zminimalizować dyskomfort.
1. Zastosowanie i zakres
<ol>
	<li>Zbieraj ślinę, hemolimfę, gruczoły ślinowe oraz jelito środkowe od częściowo i całkowicie nabrzuszonej samicy lub samca. UWAGA: Protokół ten został zastosowany w icipe do częściowego karmienia samców i samic Hyalomma dromedarii, Hyalomma rufipes, Amblyomma gemma oraz Rhipicephalus pulchellus zebranych z wielbłądów w hrabstwach Laikipia i Marsabit, Kenia13.</li>
	<li>Do analiz molekularnych, w tym do sekwencjonowania metagenomu specyficznego dla tkanek, używaj izolowanych próbek tkanek do separacji kwasów nukleinowych. UWAGA: Wymagane odczynniki i sprzęt są podsumowane w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>
2. Zbieranie śliny
<ol>
	<li>Ostrożnie sterylizuj powierzchnię kleszcza, wycierając go całym ręcznikiem papierowym namoczonym w 1% wybielacza (podchloryn sodu; NaOCl), następnie 70% etanolu przez 30 sekund, a kleszcz wyschnie. UWAGA: Podchloryn sodu jest i uwalnia toksyczne opary. Obchod należy w rękawiczkach i ochronnych okularach w chemicznym kapturze.</li>
	<li>Delikatnie wyczyść części ustne kleszczem, trzymając mały kawałek ręcznika papierowego nasączonego 70% etanolem i pozwól wyschnąć. UWAGA: Ten krok pomoże zminimalizować ryzyko skażenia przez mikroby powierzchniowe kleszczy.</li>
	<li>Umieść kleszcza na czystym szklanym szkiełku pod mikroskopem tak, że brzuszna powierzchnia kleszcza jest skierowana do góry, i mocno trzymaj go między palcem a kciukiem przed wstrzyknięciem kleszcza.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μL mieszaniny składającej się z 2% pilokarpiny HCl i 1× PBS (w proporcji 1:1) bezpośrednio za coxa 4, używając 31 g strzykawki14,15. UWAGA: Uważaj, aby nie wstrzyknąć zbyt głęboko, ponieważ może to uszkodzić ciało kleszcza i wpłynąć na integralność próbki. Alternatywnie, użyj igły pióra o średnicy 4-8 mm, aby kontrolować głębokość wtrysku.</li>
	<li>Obróć kleszcz tak, aby odsłonić grzbietową powierzchnię i przymocuj go na jednym końcu suwaka za pomocą przezroczystej taśmy. UWAGA: Należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas montażu kleszcza na szkiełku, ponieważ może to prowadzić do pęknięć i utraty próbek.</li>
	<li>Na przeciwległym końcu szkiełka umieść mały kawałek nietoksycznej gliny modelarskiej, aby zapewnić stałą powierzchnię wspierającą włożenie 10-μL końcówki nad hipostomą kleszcza. Użycie nietoksycznej gliny modelarskiej jest opcjonalne.</li>
	<li>Włóż końcówkę 0,5-10-μL między palpami, aby upewnić się, że pokrywa hipostomę.</li>
	<li>Poczekaj, aż kleszcz wyprodukuje ślinę lub delikatnie masuj hipostomę, poruszając końcówką do środka i na zewnątrz.</li>
	<li>Wciągnij ślinę do końcówki pipety lub wywierz lekki nacisk przez 5-10 sekund, aby pobudzić jej uwolnienie. Jeśli to nie zadziała, zawsze upewnij się, że 1× PBS jest wstępnie podgrzane do 38 °C; Pipetowanie niewielkiej ilości (1 μL) roztworu wstępnego przed założeniem końcówki na hipostomę i między pedipalpami pomaga w uwalnianiu śliny. UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić hipostomatu, ponieważ spowoduje to dyfuzję hemolimfy do końcówek zamiast śliny.</li>
	<li>Ślina z końcówki należy przenieść się do sterylnej i odpowiednio oznakowanej mikrorurki i przechowywać ją w temperaturze -20°C/-80°C do dalszej analizy. UWAGA: Możliwe jest zebranie do 10 μL śliny od kleszcza. Proces zbierania śliny jest podsumowany na Rysunku 1.</li>
</ol>
3. Kolekcja hemolimf
<ol>
	<li>Kontynuuj stosowanie tego samego kleszcza po zebraniu śliny lub użyj nowego kleszcza po sterylizacji powierzchniowej, jak wspomniano powyżej.</li>
	<li>Umieść kleszcza na nowej, czystej szklanej szkiełce i odetnij jedną z nóg kleszcza skalpelem rozmiaru nr 11.</li>
	<li>Delikatnie naciskaj na ciało, uważając, by nie wywierać zbyt dużego nacisku, ponieważ może to pęknąć kleszcza lub narządy wewnętrzne, i uwalnij zawartość jelita środkowego wraz z krwiolimfą.</li>
	<li>Hemolimfa jest uwalniana jako kropla z nogi, zbiera się ją pipetą, kładąc końcówkę o pojemności 0,5-10 μL na nodze. UWAGA: Wprowadź lekki nacisk pipetą, aby ułatwić uwolnienie krwiolimfy. Alternatywnie, przytnij kilka nóg, aby uzyskać odpowiednią ilość hemolimfy.</li>
	<li>Rozdaj krwiolimfę z czubka do sterylnej, oznakowanej mikrorurki i przechowuj do dalszej analizy. UWAGA: Możliwe jest pobranie do 10 μL hemolimfy od kleszcza. Metoda zbierania hemolimfy została podsumowana na Rysunku 2.</li>
</ol>
4. Sekcja kleszczy i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj następujące dokumenty:<ol>
		<li>Rozpuść wosk parafinowy i wlej go do czystej miski Petriego.</li>
		<li>Sterylizuj powierzchnię kleszcza, płucząc go trzykrotnie w oddzielnych pojemnikach zawierających 1% wybielacza (podchloryn sodu; NaOCl), po czym następuje ostateczne płukanie w wodzie o jakości reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)16.</li>
		<li>Przygotuj osobne szkiełka/szalki Petriego (po jednym dla każdego typu tkanki), dodając do każdego po 50 μL 1× PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej wosk parafinowy lutownicą, aby uzyskać stopioną plamę w szalce Petriego, gdzie zostanie umieszczony kleszcz.</li>
	<li>Umieść kleszcza w roztopionej wnęce wosku, upewniając się, że brzuszna część ciała kleszcza jest zanurzona i mocno utrzymana w wosku.</li>
	<li>Ostrożnie przetnij grzbietową krawędź ciała ostrzem skalpela i usuń grzbietową osłonę ciała kleszcza.</li>
	<li>Usuwaj gruczoły ślinowe, jelita środkowe i inne tkanki za pomocą kleszczy i przenieś je do osobnego szkiełka lub szalki Petriego.</li>
	<li>Za pomocą pipety umieść pięć kropli (50 μL) 1× PBS w osobnych szkiełkach/szalkach Petriego i dokładnie umyj każdy z usuniętych tkanek (gruczoły ślinowe i jelita środkowe) za pomocą kleszczy wielokrotnie.</li>
	<li>Przenieś każdy typ tkanki (gruczoły ślinowe lub śródjelito) do sterylnej, oznakowanej mikrorurki i dodaj 1× PBS (20 μL lub więcej), aż do całkowitego zanurzenia tkanki.</li>
	<li>Przechowuj rurkę zawierającą tkankę do kolejnej ekstrakcji kwasów nukleinowych. UWAGA: Metoda rozwarstwiania i zbierania tkanek przez kleszcze została opisana na Rysunku 3.</li>
</ol>

<ol><li>de la Fuente, J., Villar, M., Cabezas-Cruz, A., Estrada-Peña, A., Ayllón, N., Alberdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host-pathogen+interactions%3A+Conflict+and+cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Tick-host-pathogen interactions: Conflict and cooperation.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005488(2016).</li>
<li>Michalik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+species+in+Ixodes+ticks+%28Acari%3A+Ixodidae%29+associated+with+cave-dwelling+bats+from+Poland+and+Romania%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato species in Ixodes ticks (Acari: Ixodidae) associated with cave-dwelling bats from Poland and Romania.</a> Ticks Tick Borne Dis. 11 (1), 101300(2020).</li>
<li>Lu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+survey+of+vector-borne+pathogens+in+ticks%2C+sheep+keds%2C+and+domestic+animals+from+Ngawa%2C+Southwest+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Molecular survey of vector-borne pathogens in ticks, sheep keds, and domestic animals from Ngawa, Southwest China.</a> Pathogens. 11 (5), 606(2022).</li>
<li>Boulanger, N., Boyer, P., Talagrand-Reboul, E., Hansmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ticks+and+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Mal+Infect%22%5BJournal%5D)">Ticks and tick-borne diseases.</a> Med Mal Infect. 49 (2), 87-97 (2019).</li>
<li>Scholl, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+tick+saliva+on+dermal+cells+exposed+to+Borrelia+burgdorferi%2C+the+agent+of+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of tick saliva on dermal cells exposed to Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme disease.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 394(2016).</li>
<li>Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wonders+of+tick+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Wonders of tick saliva.</a> Ticks Tick Borne Dis. 10 (2), 470-481 (2019).</li>
<li>Lejal, E., Moutailler, S., Šimo, L., Vayssier-Taussat, M., Pollet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+pathogen+detection+in+midgut+and+salivary+glands+of+adult+Ixodes+ricinus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Tick-borne pathogen detection in midgut and salivary glands of adult Ixodes ricinus.</a> Parasit Vectors. 12 (1), 152(2019).</li>
<li>Gudderra, N. P., Sonenshine, D. E., Apperson, C. S., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+and+characterization+of+predominant+hemolymph+carrier+proteins+from+Dermacentor+variabilis+and+Ornithodoros+parkeri%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution and characterization of predominant hemolymph carrier proteins from Dermacentor variabilis and Ornithodoros parkeri.</a> J Insect Physiol. 48 (2), 161-170 (2002).</li>
<li>Liu, L., Yan, F., Zhang, L., Wu, Z. F., Duan, D. Y., Cheng, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+hemolymph+in+Haemaphysalis+flava+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of hemolymph in Haemaphysalis flava ticks.</a> Parasit Vectors. 15 (1), 179(2022).</li>
<li>Moreira, H. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+insight+into+the+whole+transcriptome+of+midguts%2C+ovaries+and+salivary+glands+of+the+Amblyomma+sculptum+tick%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">A deep insight into the whole transcriptome of midguts, ovaries and salivary glands of the Amblyomma sculptum tick.</a> Parasitol Int. 66 (2), 64-73 (2017).</li>
<li>Šimo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+role+of+tick+salivary+glands+and+saliva+in+tick+feeding+and+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission.</a> Front Cell Infect Microbiol. 7, 281(2017).</li>
<li>Khanal, S., Taank, V., Anderson, J. F., Sultana, H., Neelakanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsial+pathogen+perturbs+tick+circadian+gene+to+infect+the+vertebrate+host%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rickettsial pathogen perturbs tick circadian gene to infect the vertebrate host.</a> Int J Mol Sci. 23 (7), 3545(2022).</li>
<li>Khogali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+localization+of+tick-borne+pathogens+in+ticks+collected+from+camels+in+Kenya%3A+Insights+into+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific localization of tick-borne pathogens in ticks collected from camels in Kenya: Insights into vector competence.</a> Front Cell Infect Microbiol. 14, 1382228(2024).</li>
<li>Patton, T. G., Dietrich, G., Brandt, K., Dolan, M. C., Piesman, J., Gilmore, R. D. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%2C+salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> J Vis Exp. (60), e3894(2012).</li>
<li>Tirloni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+from+nymph+and+adult+females+of+Haemaphysalis+longicornis%3A+A+proteomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Saliva from nymph and adult females of Haemaphysalis longicornis: A proteomic study.</a> Parasit Vectors. 8, 338(2015).</li>
<li>Binetruy, F., Dupraz, M., Buysse, M., Duron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sterilization+methods+impact+measures+of+internal+microbial+diversity+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Surface sterilization methods impact measures of internal microbial diversity in ticks.</a> Parasit Vectors. 12 (1), 268(2019).</li>
<li>Oliveira, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+Rhipicephalus+sanguineus+tick+saliva+induced+by+the+secretagogues+pilocarpine+and+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+Tick+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Proteome of Rhipicephalus sanguineus tick saliva induced by the secretagogues pilocarpine and dopamine.</a> Ticks Tick Borne Dis. 4 (6), 469-477 (2013).</li>
<li>Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+internal+morphology+of+the+ixodid+tick%2C+Amblyomma+maculatum+Koch+%28Acari%3A+Ixodidae%29%3A+A+%26%2334%3Bhow-to%26%2334%3B+pictorial+dissection+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Midsouth+Entomol%22%5BJournal%5D)">Examination of the internal morphology of the ixodid tick, Amblyomma maculatum Koch (Acari: Ixodidae): A &#34;how-to&#34; pictorial dissection guide.</a> Midsouth Entomol. 2 (1), 28-39 (2009).</li>
<li>Khogali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+microbiomes+of+camel+ticks+to+infer+vector+competence%3A+Insights+from+tissue-level+symbiont-pathogen+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring the microbiomes of camel ticks to infer vector competence: Insights from tissue-level symbiont-pathogen relationships.</a> Sci Rep. 15 (1), 5574(2025).</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Protokół ten opiera się na wcześniejszych próbach izolacji pojedynczych tkanek kleszczy w celu wykrywania patogenów specyficznych dla tkanek oraz profilowania mikrobiomu. Kluczowe kroki obejmują precyzyjne wstrzykiwanie roztworu 2% pilokarpiny HCl zmieszanego z 1× PBS w stosunku 1:1 za coxa 4, aby stymulować produkcję śliny14,15, ostrożne ustawienie końcówki pipety nad hipostomą oraz utrzymanie sterylnej techniki przez cały czas, aby zminimalizować zanieczyszczen...

Kleszcze to obligatoryjne ektopasożyty krwi, które pełnią rolę wektorów i rezerwuarów dla wielu czynników zakaźnych, takich jak wirusy, bakterie, spirochety, grzyby i helminty, które mają znaczący wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt 1,2,3. Kleszcze przyczepiają się do swoich kręgowców, przebijając skórę hipostomatem i wstrzykując ślinę żywicieli, aby wspomóc karmienie4. Ślina wydzielana przez gruczoły ślinowe zawiera różne bioaktywne cząsteczki kontrolujące odpowiedzi gospodarza 5,6. Obecność patogenu w ślinie jest wskaźnikiem, że patogen po spożyciu skutecznie pokonał kilka barier (fizjologicznych i immunologicznych) w obrębie kleszcza, aby dotrzeć do gruczołów ślinowych; kluczowy wskaźnik kompetencji wektorowej. Gruczoły ślinowe i jelita śródczłonowe kleszczy są głównymi narządami zaangażowanymi w pozyskiwanie i przenoszenie patogenów. Jelita środkowa jest pierwszym narządem napotkanym przez patogeny nabyte podczas karmienia krwią, natomiast gruczoły ślinowe i ich wydzieliny odgrywają ważną rolę w przekazywaniu patogenów na nowych żywicieli7. Rzeczywiście, patogeny przenoszone przez kleszcze (TBP) są przenoszone przez ślinę do żywicieli podczas spożywania krwi. Hemolimfa kleszczy składa się z hemoocytów i osocza8 i służy jako medium do transportu składników odżywczych i metabolitów do i ze wszystkich narządów kleszczy, a także zapewnia ochronę przed patogenami poprzez enzymy zaangażowane w odporność wrodzoną9. Jajniki kleszczy odgrywają kluczową rolę w przekazywaniu patogenów z pokolenia nakolejne 10.
Zmiany w rozmieszczeniu różnych gatunków kleszczy oraz pojawienie się nowych TBP stworzyły pilną potrzebę skuteczniejszych metod kontroli kleszczy i oceny ryzyka oraz rozwikłania trójdzielnych interakcji między konkretnymi gatunkami kleszczy, patogenami, które przenoszą, a ich kręgowcami żywicielami11. Jednak większość badań nadzorczych badających te powiązania uwzględnia homogenity całych kleszczy, które obejmują patogeny pozyskane podczas karmienia krwią, które kleszcz może nie przenosić łatwo. Dlatego ważne jest, aby wyjaśnić rolę gatunku kleszcza w transmisji patogenów oraz rozróżnić status gospodarza bez perspektywy od statusu kompetentnego wektora. Zapewni to, że wysiłki ukierunkowane na ukierunkowane interwencje, takie jak szczepionki blokujące transmisję, będą skuteczne12.
Empiryczne wykazanie kompetencji wektorowej wymaga eksperymentalnych badań infekcji, które są kosztowne, czasochłonne i mogą nie odzwierciedlać dokładnie kombinacji wektor-patogen krążące w terenie. Zamiast tego proponujemy, aby badanie mikrobiomów konkretnych tkanek/płynów kleszczy złapanych w terenie pozwoliło zidentyfikować mikroorganizmy, w tym TBP, które rozmnażają się w obrębie konkretnego gatunku kleszcza i mogą być przekazywane kolejnym żywicielom. Aby to osiągnąć, ustanowiliśmy szczegółowy protokół aseptycznego pobierania czterech tkanek/organów i płynów kleszczy (śliny, hemolimfy, gruczoły ślinowe i jelita środkowego) z poszczególnych kleszczy do sekwencjonowania mikrobiomu. Niniejszy artykuł demonstruje protokół przesiewowego patogenów specyficznych dla tkanek u kleszczy, aby poprawić badania nad kompetencją wektorów.

<table><tbody><tr><td>0,5 i zarytka; 10 & mikro; L pipetka&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>10-&mikro; Wskazówki L</td><td>Biologix</td><td>23-0010A</td><td></td></tr><tr><td>Igła ultracienka BD 1,0 mL 31 G, 12,7 mm</td><td>Becton Dickinson (BD) Biosciences SKU</td><td>328411</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BioRender</td><td>BioRender</td><td>https://biorender.com</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Absolute (AR)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&nbsp;</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Cienka kleszcze w stylu #5</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>T4537</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism 8</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td>JIK Bleach Regular&nbsp;</td><td>Reckitt Benckiser Ltd</td><td>Kikuubo Online</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>CLS294875X25</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>Spektrofotometr UV-Vis mikroobjętościowy</td><td>Spektrofotometr UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis | Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Wosk parafinowy&nbsp;</td><td>LEICA BIOSYSTEMS&nbsp;</td><td>39602004</td><td></td></tr><tr><td>Woda PCR Ambion&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, szkło, 100 mm i ostre; 15 mm</td><td>Duran</td><td>237554608</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>79378</td><td></td></tr><tr><td>Plastelina (nietoksyczna modelarka) &nbsp;</td><td>Magazyn Laboratoryjny&nbsp;</td><td>SE180-45</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpelowe, nr 11</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Sigma Aldrich &nbsp;</td><td>S2896</td><td></td></tr><tr><td>STEREOMIKROSKOP STEMI 2000-C</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>455053-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Taśma transperantna</td><td>Scotch Magic</td><td>Środek 70005189280</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (acari: ixodidae)

Extraction of Saliva, Haemolymph, Salivary Glands, and Midgut from Individual Ticks (Acari: Ixodidae)

Kleszcze to ektopasożyty żywiące się krwią, znane ze zdolności przenoszenia wielu patogenów zakaźnych na ludzi i zwierzęta. Nadzór nad patogenami przenoszonymi przez kleszcze (TBP) zazwyczaj opiera się na wykrywaniu patogenów w homogenatach całych kleszczy, w tym tych nabytych podczas karmienia krwią, które mogą nie być przenoszone przez samego kleszcza. Aby lepiej zrozumieć mechanizm transmisji patogenów, konieczne jest zbadanie rozprzestrzeniania i koncentracji TBP w różnych tkankach kleszczy, co jest istotne dla wyjaśnienia mechanizmów transmisji u kleszczy oraz określenia ich kompetencji wektorowej. To z kolei opiera się na procedurach izolowania śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita pojedynczych kleszczy, aby zbadać lokalizację TBP w tych tkankach i płynach. W niniejszym badaniu opisujemy protokół pobierania tkanek kleszczy, w tym nowatorską procedurę pobierania krwiolimfy. Wyniki potwierdzają, że Rickettsia africae występuje w wyższych stężeniach w hemolimfie Amblyomma gemma, co potwierdza prawdopodobną rolę tego gatunku kleszcza jako kompetentnego wektora R. africae. Dla porównania, Hyalomma dromedarii wykazywała wysokie wskaźniki R. africae w jelicie środkowym, ale bakteria ta nie występowała w hemolimfie. Obecność TBP w krwiolimfie jest zatem cennym wskaźnikiem kompetencji wektorów i opiera się na dostępności metody ułatwiającej pobieranie.

Protokół ten umożliwił pomyślne pobranie próbek kleszczy i tkanek biologicznych niezbędnych do badań przesiewowych i innych dalszych analiz. Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 3 ilustrują zbiór śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz jelita środkowego częściowo i całkowicie nabrzmiałych samic kleszczy Hy. rufipes . Kleszcze te pozyskano z kolonii kleszczy hodowanej w kontrolowanych warunkach na nowozelandzkich królikach w ga...

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Ticks are blood-feeding ectoparasites recognised for their ability to transmit several infectious pathogens to humans and animals. Tick-borne pathogen ...

Aby rozpocząć zbieranie okazów Hyalomma dromedarii, Hyalomma rufipes, Amblyomma gemma oraz Rhipicephalus pulchellus od wielbłądów. Starannie sterylizuj powierzchnię kleszcza, wycierając go całym ręcznikiem papierowym nasączonym wybielaczem i etanolem. Gdy kleszcz wyschnie, delikatnie wyczyść części jamy ustnej kleszczem, trzymając mały kawałek ręcznika papierowego nasączonego 70% etanolem, a następnie ponownie wysusz.Umieść kleszcza na czystym szklanym szkiełku pod mikroskopem, tak że brzuszna powierzchnia kleszcza skierowana jest do góry, i mocno trzymaj go między kciukiem a palcem wskazującym. Wstrzyknij 20 mikrolitrów mieszaniny, składającej się z 2% pilokarpiny chlorowodorku i PBS w proporcji 1:1 bezpośrednio za coxa IV, używając strzykawki 31 gauge. Obróć kleszcza tak, aby odsłonić grzbietową powierzchnię i przymocować go na jednym końcu szkiełka za pomocą przezroczystej taśmy. Na przeciwległym końcu szkiełka umieść mały kawałek nietoksycznej gliny modelarskiej, aby zapewnić stałą powierzchnię do podparcia, poczekaj, aż kleszcz wyprodukuje ślinę.Włóż końcówkę 0,5 do 10 mikrolitrów między palpami, aby upewnić się, że pokrywa hipostom. Wciągnij ślinę do końcówki pipety. Aby zebr

extraction-saliva-haemolymph-salivary-glands-midgut-from-individual

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Środkowy jelito oraz gruczoły ślinowe komara stanowią kluczowe punkty wejścia i wyjścia dla patogenów przenoszonych przez wektory, takich jak Plasmodium falciparum i wirus dengi. Niniejsze wideo prezentuje techniki sekcji służące do usuwania jelita środkowego i gruczołów ślinowych z komarów Aedes aegypti.

Disekcja jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów Ae. aegypti

Badania nad boreliozą często wymagają uzyskania kleszczy zakażonych patogenem Borrelia burgdorferi, co jest procesem trwającym zazwyczaj kilka tygodni. W niniejszym materiale prezentujemy procedurę zakażania kleszczy metodą mikroiniekcji, którą można przeprowadzić w ciągu kilku godzin. Przedstawiamy również metodę immunofluorescencji do lokalizacji in situ B. burgdorferi wewnątrz kleszczy.

Metody szybkiego przenoszenia i lokalizacji patogenów choroby z Lyme w jelicie kleszcza

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Borelioza jest najczęściej zgłaszaną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej.  Czynnik sprawczy, Borrelia burgdorferi, jest bakterią krętkową przenoszoną przez kleszcze Ixodid.  Przenoszenie i wykrywanie infekcji w modelach zwierzęcych jest optymalizowane przez zastosowanie żywienia kleszczy, które opisujemy tutaj.

Karmienie kleszczy zwierząt w celu przeniesienia i ksenodiagnozy w badaniach nad boreliozą

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

Metodologia wirowania o zmodyfikowanej gęstości oparta na gradimencie została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Poznaj metodę izolacji śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy Ixodidae. Protokół umożliwia badanie lokalizacji patogenów w tkankach wektorów.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Przeglądaj więcej filmów