Name: Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj niezawodną metodę modelowania zakażenia litycznego de novo wirusem KSHV przy użyciu komórek HCT116. Ta technika umożliwia badanie wczesnych etapów replikacji herpeswirusa z wysoką powtarzalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Jae U. Jungowi (Cleveland Clinic) za udostępnienie linii komórkowej iSLK-BAC16 produkującej rekombinowany KSHV. Projekt graficzny został stworzony z wykorzystaniem BioRender.com, na który autorzy posiadają licencję. Praca ta została wsparta nagrodami NIH R21 DE028256, R01 CA140964 i R01 CA262631 dla C. Liang (PI), nagroda podoktorska Wistar Science Accelerator dla Q. Zhu.

KSHV jest klasyfikowany jako ludzki patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wszystkie procedury związane z materiałem zakaźnym należy wykonywać w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2. Odkażaj powierzchnie robocze 70% etanolem przed i po każdym zabiegu. Wszystkie odpady należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i wytycznymi WHO BSL-2. Schematyczny przegląd pełnego przepływu pracy znajduje się na rysunku 1. Procedura obejmuje generowanie bezkomórkowego KSHV pochodzącego z BAC16 ze zreaktywowanych komórek iSLK, zakażenie de novo komórek HCT 116, ilościowe oznaczanie miana wirusa za pomocą testu jednostki zakaźnej (IU) oraz analizę qPCR DNA wirusa związanego z wirionem. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Produkcja bezkomórkowego KSHV pochodzącego z BAC16
<ol>
	<li>Zasiać pięć kolb T75 indukowanych przez Dox komórek iSLK zawierających szerokokątny (WT) KSHV BAC 16 (iSLK-BAC16) przy około 80% konfluencji. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO 2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Wywołać reaktywację lityczną, dodając 1 μg/ml Dox i 1 mM maślanu sodu do każdej kolby. Kontynuuj inkubację przez 72-96 godzin.</li>
	<li>Monitoruj komórki codziennie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Zebrać supernatant raz >90% komórek wykazuje zaokrąglenie, oderwanie od powierzchni kolby i/lub widoczną lizę, cechy charakterystyczne efektu cytopatycznego (CPE) wskazujące na silną reakcję lityczną. Po zebraniu supernatantu należy odkazić i wyrzucić indukowane lilitycznie komórki iSLK-BAC16 za pomocą 10% wybielacza.</li>
	<li>Odwirować zebrane supernatanty w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przefiltrować oczyszczony supernatant przez filtr membranowy z polieterosulfonu (PES) o wielkości 0,45 μm bez naruszania osadu.</li>
	<li>Przefiltrowane supernatanty przenieść do probówek ultrawirówek. Osadzać cząstki wirusa przez odwirowanie w temperaturze 25 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą wirnika SW28.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzuć supernatant do 10% wybielacza. Zawiesić osad wirusa w 1 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bez surowicy.</li>
	<li>Zawiesinę wirusa należy rozmieścić w sterylnych, zakręcanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Podwielokrotności przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Określić miana zakaźne stada wirusa za pomocą testów jednostek zakaźnych (IU) opartych na GFP w komórkach SLK (patrz krok 3).</li>
</ol>
2. Zakażenie de novo komórek HCT116
UWAGA: Wysoka wielokrotność infekcji (MOI) ma kluczowe znaczenie dla skutecznego zainicjowania replikacji litycznej w komórkach HCT116 po zakażeniu de novo KSHV. Warunek ten umożliwia silną ekspresję genów wirusa i produktywną replikację bez konieczności stosowania bodźców egzogennych. Reprezentatywny wynik wykazujący zależny od MOI wpływ na produkcję wirionu przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1A.
<ol>
	<li>Wysiew: 1 x 105 komórek HCT116 na basenik w 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO 2 .</li>
	<li>Rozcieńczyć skoncentrowany zapas wirusa we wstępnie ogrzanym, wolnym od surowicy DMEM do końcowej objętości 250 μl, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 10.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Dodać 250 μl rozcieńczonego wirusa bezpośrednio do komórek.</li>
	<li>Odwirować płytkę przy 1 500 x g przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C w celu zsynchronizowania infekcji (spinokulacji). Natychmiast przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C i kontynuować inkubację przez dodatkowy 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać inokulum i przemyć komórki trzykrotnie wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć resztki wirusa. Dodaj 1 ml kompletnego DMEM do każdej studzienki.</li>
	<li>Monitoruj ekspresję GFP w zakażonych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 36 godzinach, 60 godzinach i 96 godzinach po zakażeniu. W każdym punkcie czasowym zbierz 1 ml supernatantu kulturowego z każdej studzienki. UWAGA: Po pobraniu supernatantu komórki HCT116 zakażone KSHV mogą zostać zachowane do dalszych zastosowań, takich jak ekstrakcja RNA, analiza białek, immunofluorescencja lub cytometria przepływowa, w oparciu o cele eksperymentalne.</li>
	<li>Odwirować zebrane supernatanty w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść oczyszczone supernatanty do świeżych probówek. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Test jednostek zakaźnych (test IU)
UWAGA: Komórki SLK są permisywne dla wejścia KSHV i wspierają wczesną ekspresję genów litycznych. Test ten określa ilościowo jednostki zakaźne na podstawie ekspresji GFP w zakażonych komórkach SLK po ekspozycji na seryjnie rozcieńczone supernatanty zawierające wirusa.
<ol>
	<li>Wysiewać 1 x 104 komórki SLK na studzienkę w 96-dołkowej płytce 24 godziny przed zakażeniem. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone i osiągają ~60%-70% konfluencji w dniu infekcji.</li>
	<li>Oznaczyć dziewięć probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń: Probówka 1 (nierozcieńczona, 1:1), Probówka 2 (1:2), Probówka 3 (1:4), Probówka 4 (1:8), Probówka 5 (1:16), Probówka 6 (1:32), Probówka 7 (1:64), Probówka 8 (1:128) i Probówka 9 (1:256).</li>
	<li>Dodać 200 μl supernatantu wirusa do probówki 1. Dodaj 100 μl wstępnie podgrzanego, pozbawionego surowicy DMEM do każdej z probówek od 2 do 9. Aby rozpocząć serię rozcieńczeń, przenieść 100 μl z probówki 1 do probówki 2 i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Następnie przenieść 100 μl z probówki 2 do probówki 3 i powtórzyć ten proces kolejno przez probówkę 9, dokładnie mieszając na każdym etapie. UWAGA: Każda probówka powinna zawierać końcową objętość 100 μl. Wykonać wszystkie rozcieńczenia w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną z komórek SLK. Dodać 100 μl każdego rozcieńczenia wirusa do wyznaczonych studzienek. Użyć w sumie 27 dołków (3 dołki na rozcieńczenie od 1:1 do 1:256).</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę o sile 1 500 x g przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C, aby przyspieszyć adsorpcję fiolki. Przenieść płytkę do inkubatora CO 2 o temperaturze 37 °C na dodatkowe 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń inokulum i delikatnie dodaj 100 μl kompletnego DMEM do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz komórki i przeanalizuj ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Zapisz liczbę komórek GFP-dodatnich w każdym dołku.</li>
	<li>Obliczyć jednostki zakaźne na ml (j.m./ml), korzystając z następującego wzoru13: j.m./ml = [(liczba komórek GFP-dodatnich w basenie)/ objętość inokulum (ml)] x współczynnik rozcieńczenia. Określić końcowe miano wirusa przy użyciu ostatniego rozcieńczenia z wykrywalnymi komórkami GFP-dodatnimi</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja enkapsylowanych genomów wirusowych metodą qPCR
<ol>
	<li>Dodać DNazę I do końcowego stężenia 100 U/ml do 400 μl oczyszczonego supernatantu (patrz krok 1 w celu wyjaśnienia sklarowanego osadu i usunięcia zanieczyszczeń). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu strawienia niekapsułkowanych wirusowych i komórkowych DNA. Reprezentatywny wynik wykazujący swoistość i skuteczność leczenia DNazą przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1B.</li>
	<li>Dodać EDTA do końcowego stężenia 50 mM, aby zatrzymać reakcję DNazy. Inkubować w temperaturze 75 °C przez 15 minut w celu inaktywacji DNazy I.</li>
	<li>Ekstrakcja wirusowego DNA z supernatantu poddanego działaniu DNazy za pomocą zestawu DNA Mini Kit zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Eluować DNA wirusa w 30 μl buforu elucyjnego. Do każdej reakcji qPCR należy użyć 5 μl eluowanego DNA.</li>
	<li>Wzmocnij otwartą ramkę odczytu KSHV 73 (ORF 73) za pomocą następujących starterów: Do przodu: 5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'; Rewers: 5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3.</li>
	<li>Przygotować reakcje qPCR w trzech powtórzeniach przy użyciu SYBR Green Master SuperMix. Ustaw warunki cyklu w następujący sposób: Początkowa denaturacja: 95 °C przez 3 minuty; Wzmocnienie: 40 cykli po 95 °C przez 10 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; Analiza krzywej topnienia: standardowa rampa dla specyficzności amplikonu.</li>
	<li>Wygeneruj krzywą wzorcową, używając 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wirusowego DNA pochodzącego z BAC-16, w zakresie od 109 do 101 kopii na reakcję. Wykreśl wartości Ct w stosunku do logarytmu10 numeru kopii wejściowej, aby ocenić liniowość testu. Reprezentatywną krzywą wzorcową przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1C.</li>
	<li>Określ liczbę kopii genomu wirusa, porównując wartości Ct z krzywą standardową. Normalizuj i raportuj wyniki jako kopie wirusa na ml supernatantu.</li>
</ol>

<ol><li>Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+herpesvirus%2Fhuman+herpesvirus-8+%28KSHV%2FHHV8%29%2C+and+the+oncogenesis+of+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma herpesvirus/human herpesvirus-8 (KSHV/HHV8), and the oncogenesis of Kaposi's sarcoma.</a> Nat Rev Cancer. 10 (10), 707(2010).</li>
<li>Cesarman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaherpesvirus+and+lymphoproliferative+disorders+in+immunocompromised+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients.</a> Cancer Lett. 305 (2), 163-174 (2011).</li>
<li>Golas, G., Alonso, J. D., Toth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+de+novo+lytic+infection+of+dermal+lymphatic+microvascular+endothelial+cells+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of de novo lytic infection of dermal lymphatic microvascular endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> Virology. 536, 27-31 (2019).</li>
<li>Dittmer, D. P., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+immunobiology%2C+oncogenesis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus: immunobiology, oncogenesis, and therapy.</a> J Clin Invest. 126 (9), 3165-3175 (2016).</li>
<li>Chang, H. H., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+herpesviral+transcriptional+program+in+KSHV-infected+lymphatic+endothelial+cells+leads+to+mTORC1+activation+and+rapamycin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A unique herpesviral transcriptional program in KSHV-infected lymphatic endothelial cells leads to mTORC1 activation and rapamycin sensitivity.</a> Cell Host Microbe. 13 (4), 429-440 (2013).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Myoung, J., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+doxycycline-inducible+KSHV+producer+cell+line+of+endothelial+origin%3A+Maintenance+of+tight+latency+with+efficient+reactivation+upon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction.</a> J Virol Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).</li>
<li>Grundhoff, A., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+establishment+of+KSHV+latency+suggests+an+additional+role+for+continued+lytic+replication+in+Kaposi+sarcoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inefficient establishment of KSHV latency suggests an additional role for continued lytic replication in Kaposi sarcoma pathogenesis.</a> J Clin Invest. 113 (1), 124-136 (2004).</li>
<li>Gao, S. J., Deng, J. H., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Productive+lytic+replication+of+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+in+efficient+primary+infection+of+primary+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Productive lytic replication of a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in efficient primary infection of primary human endothelial cells.</a> J Virol. 77 (18), 9738-9749 (2003).</li>
<li>Atyeo, N., Chae, M. Y., Toth, Z., Sharma, A., Papp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+immediate+early+proteins+trigger+FOXQ1+expression+in+oral+epithelial+cells%2C+engaging+in+a+novel+lytic+cycle-sustaining+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus immediate early proteins trigger FOXQ1 expression in oral epithelial cells, engaging in a novel lytic cycle-sustaining positive feedback loop.</a> J Virol. 97 (3), e0169622(2023).</li>
<li>Lagunoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+infection+and+serial+transmission+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+in+cultured+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">De novo infection and serial transmission of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus in cultured endothelial cells.</a> J Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).</li>
<li>ViejoBorbolla, A., Schulz, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and innate immunity.</a> J Gen Virol. 98 (2), 271-284 (2017).</li>
<li>Chandran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+infection+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Early events in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of target cells.</a> J Virol. 84 (5), 2188-2199 (2010).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+induces+mitochondrial+fission+to+evade+host+immune+responses+and+promote+viral+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces mitochondrial fission to evade host immune responses and promote viral production.</a> Nat Microbiol. 10 (6), 1501-1520 (2025).</li>
<li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF-1alpha+promote+lytic+de+novo+KSHV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF-1alpha promote lytic de novo KSHV infection.</a> J Virol. 97 (11), e0097223(2023).</li>
<li>White, I. E., Campbell, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+cell-free+and+cell-associated+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+DNA+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of cell-free and cell-associated Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus DNA by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 38 (5), 1992-1995 (2000).</li>
<li>Bechtel, J., Grundhoff, A., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAs+in+the+virion+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">RNAs in the virion of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 79 (16), 10138-10146 (2005).</li>
<li>Lin, X., Li, X., Liang, D., Lan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+unusual+small+RNAs+discovered+in+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and unusual small RNAs discovered in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus virions.</a> J Virol. 86 (23), 12717-12730 (2012).</li>
<li>Watzinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR+assays+for+detection+and+monitoring+of+pathogenic+human+viruses+in+immunosuppressed+pediatric+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients.</a> J Clin Microbiol. 42 (11), 5189-5198 (2004).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+angelicin+against+gammaherpesviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of angelicin against gammaherpesviruses.</a> Antiviral Res. 100 (1), 75-83 (2013).</li>
<li>Coen, N., Duraffour, S., Snoeck, R., Andrei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+targeted+therapy%3A+An+update+on+inhibitors+of+viral+lytic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">KSHV targeted therapy: An update on inhibitors of viral lytic replication.</a> Viruses. 6 (11), 4731-4759 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Modelowanie de novo litycznego zakażenia KSHV przez długi czas było utrudnione ze względu na silną skłonność wirusa do tworzenia latencji w większości pobłażliwych typów komórek. Chociaż wykazano, że niektóre komórki pierwotne, takie jak komórki śródbłonka i komórki nabłonka jamy ustnej, wspierają replikację lityczną po zakażeniu de novo 9,10, ich ograniczona żywotność, wysoki koszt i trudności techniczne w utrzymaniu hodowli zmniejszają odtwarz...

Herpeswirus związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV) jest ludzkim gammaherpeswirusem etiologicznie związanym z mięsakiem Kaposiego (KS), pierwotnym chłoniakiem wysiękowym (PEL), wieloośrodkową chorobą Castlemana (MCD) i zespołem cytokin zapalnych KSHV 1,2. Podobnie jak wszystkie herpeswirusy, KSHV utrzymuje się w organizmie gospodarza przez całe życie, przechodząc naprzemiennie między fazą utajoną i lityczną. Podczas gdy latencja dominuje w większości zakażonych komórek, podgrupa może wejść w cykl lityczny podczas infekcji pierwotnej (de novo) lub poprzez reaktywację z latencji3. Replikacja lityczna obejmuje uporządkowaną kaskadę ekspresji genów wirusa, której kulminacją jest replikacja genomu, składanie wirionów i uwalnianie potomstwa. Proces ten ma kluczowe znaczenie dla rozprzestrzeniania się wirusa i progresji choroby 4,5. Wczesne badania replikacji litycznej KSHV często opierały się na ektopowej ekspresji poszczególnych genów wirusa w układach heterologicznych. Podejścia te, choć pouczające, nie pozwoliły uchwycić skoordynowanej regulacji genów i interakcji wirus-gospodarz obecnych podczas autentycznej infekcji. Opracowanie BAC-16, rekombinowanego sztucznego chromosomu bakteryjnego (BAC) przenoszącego pełnej długości genom KSHV, umożliwiło produkcję genetycznie modypulowalnych wirusów, które zachowują zdolność do replikacji i zakaźnej produkcji wirionów6. System ten ułatwia ukierunkowaną mutagenezę i analizę funkcjonalną genów wirusa w kontekście całego genomu. Modele reaktywacji wykorzystujące utajone zakażone komórki iSLK lub BCBL-1 z BAC-16 lub KSHV stały się od tego czasu standardem w badaniu replikacji litycznej KSHV. Systemy te umożliwiają zsynchronizowaną indukcję cyklu litycznego przy użyciu środków takich jak doksycyklina (Dox) i 7,8 maślan sodu. Ponieważ jednak modele reaktywacji omijają wczesne etapy infekcji – w tym wnikanie wirusa, transport wewnątrzkomórkowy i początkową decyzję między latencją a replikacją lityczną – nie mogą w pełni podsumować pierwotnej dynamiki infekcji.
Modele zakażeń de novo oferują uzupełniające ramy służące wyeliminowaniu tych luk. Wykazano, że kilka pierwotnych modeli komórkowych, takich jak ludzkie komórki śródbłonka i nabłonka dziąseł, wspiera replikację lityczną po zakażeniu KSHV de novo 3,9,10,11. Jednak ich ograniczona żywotność, wysokie koszty i słaba podatność na manipulacje genetyczne ograniczają ich odtwarzalność i skalowalność w badaniach mechanistycznych. W tym protokole opisujemy wykonalny i skalowalny model zakażenia de novo litycznego KSHV przy użyciu linii komórkowej ludzkiego raka jelita grubego HCT 116. Chociaż komórki HCT116 nie są naturalnym celem KSHV, wykazują dużą podatność na infekcje i stanowią stabilną i opłacalną platformę odpowiednią do badań mechanistycznych i zastosowań o wysokiej przepustowości. Biorąc pod uwagę ograniczoną zdolność KSHV do tworzenia płytek miażdżycowych w hodowli, wykorzystujemy system BAC16 zawierający reporter GFP do generowania bezkomórkowego wirusa do infekcji. Umożliwia to bezpośrednią wizualizację zakażonych komórek i ilościowe określenie miana zakaźnego za pomocą testów jednostki zakaźnej (IU) opartych na GFP12. Aby to uzupełnić, DNA związane z wirionem mierzy się za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) po leczeniu DNazą, oferując czułą metodę wykrywania zamkniętych w kapsułkach genomów wirusa. Łącznie testy te pozwalają na czasową, ilościową analizę dynamiki replikacji litycznej podczas pierwotnej infekcji.
Protokół ten zapewnia niezawodną i elastyczną platformę do modelowania zakażenia de novo litycznego KSHV in vitro, ułatwiając analizę wczesnych zdarzeń w cyklu życiowym wirusa, umożliwiając ocenę funkcji genów i aktywności przeciwwirusowej.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; m filtr polieterosiulfonowy (PES)&nbsp;</td><td>Firma VWR</td><td>76479-020</td><td></td></tr><tr><td>Tynk biologiczny</td><td>Tynk biologiczny</td><td>N/A</td><td>Projekt graficzny został wykonany przy użyciu BioRender.com, na który autorzy posiadają licencję</td></tr><tr><td>CFX Opus 96 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>184-5072</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny DMEM</td><td></td><td></td><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle'a firmy Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich) uzupełniony 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS; Gibco), 2 mM L-glutaminy (Gibco) i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny (Pen-Strep; GenClone).</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>Zobacz materiał M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał D9891</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR II 18</td><td>BD Bioscience</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green Master SuperMix</td><td>Quantabio powiedział:</td><td>95054-02K</td><td></td></tr><tr><td>Mini zestaw QIAamp DNA</td><td>Qiagen powiedział:</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>maślan sodu (NaB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał B5887 TGL</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Rybak termiczny</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem kaposiego

Establishment and Quantification of De Novo Lytic Infection by Cell-free Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus

Herpeswirus związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV), gammaherpeswirus zamieszany w wiele nowotworów złośliwych u ludzi, może ulegać replikacji litycznej podczas pierwotnej infekcji, procesu, który przyczynia się do rozprzestrzeniania się wirusa, unikania odporności i patogenezy choroby. Jednak brak solidnych systemów in vitro do wykrywania zakażeń de novo litycznych ma ograniczony wgląd w wczesne przypadki infekcji. Tutaj przedstawiamy praktyczny protokół, który wykorzystuje ludzkie komórki HCT 116 raka jelita grubego jako cele infekcji bezkomórkowymi wirionami pochodzącymi z komórek wytwarzających iSLK reaktywowanych przez bakteryjny sztuczny chromosom 16 (BAC16) KSHV. Model ten podsumowuje kluczowe etapy pierwotnej infekcji, w tym wnikanie wirusa, dostarczanie genomu, ekspresję genów litycznych i produkcję potomstwa. Zakażenie jest synchronizowane poprzez spinokulację i monitorowane tymczasowo. Produkcja wirusa jest określana ilościowo za pomocą systemu podwójnego odczytu obejmującego testy jednostki zakaźnej (IU) oparte na białku zielonej fluorescencji (GFP) i qPCR enkapspolimeryzowanego wirusowego DNA. Podejścia te umożliwiają szczegółową analizę kinetyki replikacji wirusa. Podczas gdy obecny protokół koncentruje się na wykrywaniu zdarzeń w późnym stadium, system można dostosować do badania wczesnych faz infekcji poprzez zmodyfikowane punkty czasowe pobierania próbek. Oferując powtarzalną, skalowalną platformę do produktywnych infekcji de novo , system ten wypełnia lukę metodologiczną w badaniach nad KSHV i wspiera badania mechanistyczne interakcji wirusa opryszczki od gospodarza i strategii przeciwwirusowych.

W celu ilościowego oznaczenia miana wirusa zakaźnego, nadnadbudowy zebrane 72 h po litycznej reaktywacji komórek iSLK-BAC16 poddano dwukrotnym rozcieńczeniom seryjnym i wykorzystano do zakażania komórek SLK. Liczba komórek SLK wykazujących ekspresję GFP dla każdego rozcieńczenia przedstawiona jest na Rysunku 2A, a odpowiadające im jednostki zakaźne (IU) na mL zostały obliczone i zaprezentowane na Rysunku 2B. Aby ocenić wydajność ...

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), a gammaherpesvirus implicated in multiple human malignancies, can undergo lytic replication during primary ...

Liczba dostępnych i powtarzalnych systemów do modelowania pierwotnej infekcji litycznej KSHV jest ograniczona. Opracowaliśmy niezawodną i solidną platformę in vitro do modelowania litycznej infekcji de novo KSHV. Modelowanie infekcji litycznej KSHV jest trudne ze względu na silną tendencję wirusa do latencji, a nieliczne komórki pierwotne umożliwiające jej przebieg są delikatne i mają ograniczony czas życia, co znacząco ogranicza powtarzalność i skalowalność badań. Opracowaliśmy dostępny i powtarzalny model w komórkach HCT116, który pozwala na efektywną lityczną replikację KSHV podczas pierwotnej infekcji, stanowiąc unikalną platformę do badania wczesnych etapów replikacji wirusów herpes.W pierwszej kolejności należy zasiać w pięciu kolbach T75 indukowalne doksycykliną komórki iSLK zawierające KSHV BAC16 typu dzikiego, osiągając konfluencję na poziomie około 80%. Kolby należy inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% dwutlenku węgla. Do każdej kolby należy dodać 1 µg/mL doksycykliny oraz 1 mM maślanu sodu w celu indukcji reaktywacji litycznej. Komórki należy monitorować codziennie za pomocą mikroskopii kontrastowej). Zebrać supernatant, gdy ponad 90% komórek wykaże zaokrąglenie, odczepienie się od powierzchni kolby lub widoczną lizę. Następnie odwirować zebrane supernatanty przy 1 500g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć szczątki komórkowe. Przefiltrować otrzymany supernatant przez filtr membranowy z polietersulfonu o rozmiarze porów 0,45 mikrometra, nie naruszając osadu.Przenieść przefiltrowane nadsączniki do probórek do ultrawirowania. Wirować probóki przy 25, 000g przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając rotora SW28, abyt utworzyć pellet cząsteczek wirusa. Ostrożnie odlać nadsącznik do naczynia z 10% wybielaczem. Resuspendować pellet wirusowy w jednym mililitrze DMEM pozbawionego surowicy.Wysiać 1 × 10⁵ komórek HCT116 na każdą studnijkę w 12-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Rozcień stężony stok wirusa w uprzednio ogrzanym, bezzserowym medium DMEM do objętości końcowej 250 µL, aby uzyskać wielokrotność infekcji, czyli MOI wynoszącą 10. Odessij pożywkę hodowlaną z każdej studzienki i dodaj 250 µL rozcieńczonego wirusa bezpośrednio na komórki. Wirowarkuj płytkę z prędkością 1 500g przez jedną godzinę w temperaturze 30 °C w celu synchronizacji infekcji.Niezwłocznie przenieś płytkę do inkubatora ustawionego na 37 °C i kontynuuj inkubację przez jedną godzinę. Odessij inokulum wirusowe z każdej studni. Przemyj komórki trzy razy uprzednio ogrzanym PBS, aby usunąć pozostałości wirusa.Do każdej studzienki dodaj 1 ml kompletnego DMEM. Następnie pobierz 1 ml supernatantu hodowli z każdej studzienki. Na 24 godziny przed infekcją wysiej 1×10⁴ komórek SLK na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej. Oznacz dziewięć probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla szeregu dwukrotnych rozcieńczeń. Do pierwszej probówki dodaj 200 µl supernatantu wirusowego. Do pozostałych probówek, od drugiej do dziewiątej, dodaj po 100 µl podgrzanego DMEM bez dodatku surowicy.Rozpocznij rozcieńczanie seryjne, przenosząc 100 µL z probówki pierwszej do probówki drugiej i mieszając dokładnie poprzez pipetowanie. Następnie odessaj pożywkę hodowlaną z komórek SLK. Dodaj 100 µL każdego rozcieńczenia wirusa do wyznaczonych studzienek, wykorzystując łącznie 27 studzienek.Wiruj płytkę 96-dołkową z prędkością 1 500g przez jedną godzinę w temperaturze 30°C, aby wspomóc absorpcję wirusa. Przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37°C z 5% CO2 i inkubuj przez kolejną godzinę. Usuń inokulum z każdego dołka.Następnie należy delikatnie dodać 100 µL kompletnego DMEM do każdej studni. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przeanalizować komórki GFP-dodatnie.Dwukrotne rozcieńczenie seryjne zapasu wirusa pochodzącego z BAC16 wykazało stopniowy spadek liczby komórek SLK dodatnich pod kątem GFP, co potwierdza mierzalny i wrażliwy na rozcieńczenie miano zakaźne. Obliczone miano zakaźne zapasu wirusa pochodzącego z BAC16 wynosiło około 1,3 miliona jednostek zakaźnych na mililitr. Ekspresja GFP w komórkach HCT116 wzrastała w czasie po infekcji de novo, przy czym najintensywniejszy sygnał zaobserwowano w 60. godzinie po infekcji, co wskazuje na intensywną replikację wirusa w tym punkcie czasowym.Analiza cytometryczna potwierdziła wystąpienie szczytu w liczbie komórek SLK dodatnich pod kątem GFP w 60. godzinie po infekcji, osiągając 74,4% pozytywnych wyników, po czym nastąpił spadek do 62,7% w 96. godzinie. Ilościowa PCR DNA wirusowego w supernatantach wykazała gwałtowny wzrost liczby kopii genomu wirusa, z szczytem w 60. godzinie po infekcji i późniejszym spadkiem.

establishment-quantification-de-novo-lytic-infection-cell-free-kaposi

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ustalenie i ilościowa ocena de novo zakażenia lizygennego przez wirusa związanego z mięsakiem Kaposiego, swobodnego od komórek

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film opisuje test płytki wirusowej zakaźnego wirusa opryszczki pospolitej lub HSV. Rozcieńczone cząsteczki wirusa są inokulowane do monowarstwy komórek nabłonka. Podczas inkubacji wirus tworzy blaszki i jest liczony wizualnie w celu określenia miana wirusa zakaźnego.

Test płytki wirusowej: technika pomiaru zakaźnego wirusa opryszczki pospolitej poprzez ilościowe oznaczanie blaszek utworzonych w jednej warstwie komórek zakażonych wirusem

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

Poznaj niezawodną metodę modelowania zakażenia litycznego de novo wirusem KSHV przy użyciu komórek HCT116. Ta technika umożliwia badanie wczesnych etapów replikacji herpeswirusa z wysoką powtarzalnością.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Przeglądaj więcej filmów