Name: Test kosedymentacji aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Naucz się testu kosedymentacji aktyny do analizy wiązania białek z F-aktyną in vitro. Ta metoda pozwala badać dynamikę cytoszkieletu aktynowego i specyficzność białek wiążących aktynę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla dr. Praveena Kumara z laboratorium Wittmana na UCSF za film przedstawiający aktynę w komórkach HaCAT.

1. Przygotowanie aktyny
Źródłem aktyny użytej w tym teście były ludzkie płytki krwi pozamyśniowe (β-actin) otrzymane z firmy Cytoskeleton Inc. Alikwoty zapasu w stężeniu 10 mg/ml są przechowywane w zamrażarce w temperaturze -70ºC. Do analizy aktynę rozcieńcza się do stężenia 0,4 mg/ml w buforze zawierającym 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP oraz 0,5 mM DTT, a następnie wiruje przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4ºC. Nadosad, stanowiący aktynę monomerową, jest gotowy do polimeryzacji. Polimeryzację aktyny indukuje dodanie 50 mM KCl, 1 mM ATP i 2 mM MgCl2. Polimeryzacja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
2. Przygotowanie białka
W tym teście wykorzystujemy koniec C-końcowy taliny, który został oczyszczony jako białko z tagiem GST. Białko przeznaczone do analizy poddaje się wirowaniu przy wysokiej prędkości w celu usunięcia agregatów przed inkubacją z F-aktyną. Białko wirowano przy 100,000g w ultrawirowarce Beckman przez 20 mins w temperaturze 22ºC.
3. Inkubacja białka z aktyną
Ilość aktyny i białka w teście może się różnić. W tym przykładzie stosujemy nadmiar aktyny. Zazwyczaj oblicza się stosunek molowy, np. stosunek molowy aktyny do białka 4:1. W poniższym teście końcowa objętość reakcji wynosi 150 µl. Bufor, w którym inkubuje się białko i F-aktynę, zależy od badanego białka oraz wymaganych warunków. W tym przykładzie stosujemy bufor zawierający 10 mM Tris pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl2 oraz 2 mM MgCl2. Białko i F-aktynę inkubuje się w buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Sedymentacja F-aktyny
Po inkubacji próbki są wirowane z prędkością 100,000g w temperaturze 22ºC. W filmie wykorzystujemy ultrawirówkę Beckman. Rotor jest ostrożnie wyjmowany, aby nie naruszyć osadów.
5. Analiza współsedymentacji białka z F-aktyną
Nadnadatopie są ostrożnie usuwane za pomocą pipety do probówki typu Eppendorf, a następnie dodaje się 5 X bufor do próbek Laemmli SDS-PAGE. Do pozostałych osadów dodaje się odpowiednią objętość 1 X buforu do próbek Laemmli SDS-PAGE, miesza poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenosi do nowych probówek typu Eppendorf. Względne ilości białek w osadach i nadnadatopach analizuje się po ich rozdziale metodą SDS-PAGE i barwieniu żelu błękitem Coomassie lub metodą Western blotting.
W celu określenia swoistości oddziaływania białka z aktyną można przeprowadzić współsedymentacje zależne od stężenia aktyny. W tego rodzaju eksperymentach inkubuje się stałą ilość białka z serią zwiększających się ilości aktyny, a analizę przeprowadza się zgodnie z powyższym opisem.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Współwytrącanie aktyny jest prostym testem in vitro służącym do analizy wiązania specyficznych białek z F-aktyną. W tym filmie prezentujemy przykład przeprowadzenia prostego współwytrącania aktyny. Pokazujemy, jak przygotować F-aktynę, jak przygotować białko do badania oraz opisujemy procedurę współwytrącania aktyny. Podczas przeprowadzania testów współwytrącania aktyny należy wziąć pod uwagę szereg kwestii. Na przykład składniki buforu do inkubacji mogą się różnić w zależności od badanego białka, a pH, temperatura i stę...

test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z f-aktyną

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Cytoškielet aktynowy wewnątrz komórki to sieć filamentów aktynowych, która umożliwia ruch komórek oraz procesy komórkowe, a także generuje napięcie i pomaga utrzymać kształt komórki. Choć cytoškielet aktynowy jest strukturą sztywną, pozostaje on strukturą dynamiczną, która nieustannie ulega przebudowie. Liczne białka mogą wiązać się z cytoškieletem aktynowym. Wiązanie konkretnego białka z aktyną F jest często pożądane w celu wsparcia obserwacji biologii komórki lub lepszego zrozumienia procesów dynamicznych wynikających z przebudowy cytoškieletu aktynowego. Test kosedymentacji aktyny jest metodą in vitro rutynowo stosowaną do analizy wiązania specyficznych białek lub domen białkowych z aktyną F. Podstawowe zasady tego testu obejmują inkubację badanego białka (pełnej długości lub jego domeny) z aktyną F, etap ultrawirowania w celu osadzenia aktyny F oraz analizę białka kosedymentującego z aktyną F. Testy kosedymentacji aktyny mogą być odpowiednio zaprojektowane w celu pomiaru powinowactwa wiązania aktyny oraz w testach konkurencji.

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Cytoškielet aktynowy wewnątrz komórki to sieć filamentów aktynowych, która umożliwia ruch komórek oraz procesy komórkowe i generuje ...

W komórce. Cytoszkielet aktynowy jest strukturą dynamiczną, a jego przebudowa odgrywa istotną rolę w wielu procesach, takich jak podział komórki, migracja komórek oraz transport fizyczny. Szeroka gama białek może wiązać się z cytoszkieletem aktynowym poprzez odrębne moduły wiążące aktynę.W tym filmie prezentujemy procedurę współosadzania z aktyną, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen białek wiążących aktynę filamentową. Witam, jestem Jody Var z laboratorium dr Diane Barber z Katedry Biologii Komórki i Tkanek na UCSF. W tym filmie pokażę Państwu procedurę przeprowadzania testu współosadzania z aktyną.Niniejsza procedura stanowi jedną z metod analizy białek specyficznie wiążących się z aktyną filamentową i może być wykorzystywana do pomiaru powinowactw wiązania. Procedura ta obejmuje następujące etapy: tworzenie filamentów aktyny oraz przygotowanie białka do badania. Inkubację białka docelowego z aktyną filamentową (w skrócie f-aktyną), wirowanie f-aktyny w ultrawirówce przy 100 000 ×g, a następnie elektroforezę SDS-PAGE i barwienie Coomassie w celu wizualizacji frakcji nadosadu i osadu.I na koniec analiza białka współosadzającego się z f aktyną w frakcji osadu. Zatem zacznijmy. Aby przygotować filamenty aktynowe, dobrą praktyką jest upewnienie się, że aktyna, z którą pracujemy, znajduje się w formie monomeru.Roztwór zapasowy aktyny o stężeniu 10 mg/ml zostaje wyjęty z zamrażarki w temperaturze -80°C, a następnie przygotowuje się rozcieńczenie robocze o stężeniu 2,4 mg/ml w buforze zawierającym Tris, chlorek wapnia, ATP w celu stabilizacji monomerów oraz DTT. Rozcieńczenie robocze umieszcza się w lodzie na jedną godzinę. Po godzinnej inkubacji w lodzie roztwór aktyny wiruje się przy 14 000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4°C.Otrzymany nadosad będzie stanowił monomericzną aktynę. Obecnie, z tych oczyszczonych monomerów aktyny, można wygenerować aktynę filamentową poprzez dodanie chlorku potasu, chlorku magnezu oraz TP na jedną godzinę. W temperaturze pokojowej filamentowa aktyna jest gotowa do inkubacji z białkiem lub domeną białkową, która nas interesuje, co zaprezentujemy w następnym kroku.Aby przystąpić do badania kosedymentacji aktyny, należy przygotować białko do analizy. Dzisiaj wykorzystuję białko clan, które zostało oczyszczone jako białko fuzyjne GST. Białko zostało uprzednio oczyszczone z agregatów poprzez ultrawirowanie, a otrzymany nadsącz jest teraz gotowy do użycia w badaniu.Aby przetestować wiązanie białka z aktyną, aktyna musi znajdować się w nadmiarze. W tym przypadku 10 µg aktyny inkubuje się z 5 µg białka w buforze zawierającym Tris, ATP, BTME, kaptoetanol, EGTA oraz chlorek wapnia, aby uzyskać całkowitą objętość 150 µL. Inkubację białka z aktyną prowadzi się bezpośrednio w probówkach do ultrawirówki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Probówki jeden i dwa stanowią kontrole. Probówka jeden zawiera wyłącznie aktynę w buforze.Próbka dwa zawiera wyłącznie białko w probówce z buforem. Próbka trzy zawiera zarówno aktynę, jak i CNU taliny w buforze dwa. Próbka cztery stanowi dodatkową kontrolę nieswoistego wiązania i zawiera wyłącznie aktynę oraz białko GST. Po godzinnej inkubacji próbki są ostrożnie umieszczane w wirówce Beckman.Następnie ustawiamy ultrawirówkę na 100 000 ×g i wirujemy próbki przez 20 minut w temperaturze 22 °C. Po tym wirowaniu mogliśmy przygotować próbki do analizy metodą SDS-PAGE. Po 20-minutowym wirowaniu próbki są ostrożnie wyjmowane z rotora, aby nie zakłócić osadu. Na ściance probówki nanosi się oznaczenie w miejscu, w którym znajduje się pellet.Należy ostrożnie przenieść nadsącz do probówek Eppendorf, do których dodano 5 µL buforu do próbek XSCS. Do osadu pozostałego w probówkach do ultrawirówki dodaje się 1 µL buforu do próbek XSCS. Po pipetowaniu w górę i w dół, resuspendowany osad przenosi się do nowej probówki Eppendorf.Następnie próbki gotuje się w bloku grzewczym przez maksymalnie 10 minut. Po gotowaniu próbki nanosi się na żel do elektroforezy SDS-PAGE. W tym przypadku używam wcześniej przygotowanego żelu 10%.Próbki są ostrożnie nakładane do studzienek w odpowiedniej kolejności. Żel jest poddawany elektroforezie przy stałym napięciu przez około jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu przebiegu żelu barwimy go błękitem Coomassie, aby wizualizować białka.Roztwory błękitu Kumasi powinny całkowicie pokrywać żel. Żel pozostawia się w wytrząsarce przez co najmniej 20 minut. Następnie usuwa się roztwór błękitu ESI i zanurza żel w roztworze odbarwiającym.Żel pozostawia się na około jedną godzinę na wytrząsarce, aż do pojawienia się prążków w żelu. Po barwieniu kumasy żel można przeanalizować w celu określenia względnej ilości białka w frakcjach nadosadu i osadu. Analizując żel w ścieżkach pierwszej i drugiej, możemy zaobserwować frakcje nadosadu i osadu samego aktyny.W ścieżkach trzeciej i czwartej naniesiono frakcje nadkładu i osadu samego białka ogona C. W ścieżkach piątej i szóstej naniesiono frakcje nadkładu i osadu z inkubacji aktyny i białka ogona C. W ścieżkach siódmej i ósmiej naniesiono frakcje nadkładu i osadu z inkubacji aktyny i białka GST.Jak widać, CT ogona jest widoczne tylko w frakcji podniebienia w ścieżce szóstej. Wyniki tego żelu wskazują na specyficzne wiązanie końca C, czyli ogona, z aktyną. W tym filmie zapoznali się Państwo ze sposobem przeprowadzenia testu kosedymentacji aktyny.Testy kosedymentacji aktyny są metodą in vitro służącą do analizy białek wiążących aktynę. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o następujących kwestiach: należy przeprowadzić wstępne oczyszczanie badanego białka oraz uwzględnić negatywną kontrolę z samym białkiem dla każdej inkubacji białka z aktyną.Kontrola ta wykaże, czy którekolwiek z uprzednio oczyszczonych białek osadza się samoistnie, gdyż wiązanie do f wywoływane przez niektóre białka może być wrażliwe na pH, temperaturę lub stężenie soli w buforze. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test kosedymentacji aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Stosujemy analizę oddziaływań białkowych bez użycia znaczników z wykorzystaniem systemu Biacore X100 do analizy struktura-funkcja wiązania kilku mutantów cystatyny B z papainą poprzez charakterystykę kinetyczną. Analiza stężenia bez kalibracji (CFCA) pozwala zmierzyć stężenie białka zachowującego aktywność wiązania bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. Wykazujemy, że potwierdzenie stężeń za pomocą CFCA zwiększa wiarygodność analizy kinetycznej oraz że stałe kinetyczne można rzetelnie...

Znaczenie prawidłowego stężenia białka dla wyznaczania kinetyki i powinowactwa w analizie zależności struktura-funkcja

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

Polimeryzacja FtsZ jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. W tym raporcie szczegółowo opisujemy proste protokoły monitorowania aktywności polimeryzacji FtsZ i omawiamy wpływ składu buforu. Protokoły mogą być wykorzystywane do badania interakcji FtsZ z białkami regulatorowymi lub lekami przeciwbakteryjnymi, które wpływają na polimeryzację FtsZ.

Testy polimeryzacji FtsZ: proste protokoły i rozważania

Ten protokół opisuje metodę testowania zdolności białka do współosadzania z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i, jeśli zaobserwowano wiązanie, do pomiaru powinowactwa interakcji.

Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Ta metoda opisuje test sedymentacji in vitro oparty na lektynie, który pozwala określić ilościowo powinowactwo wiązania fosfatazy glukanowej i amylopektyny. Ten test kosedymentacji jest niezawodny w pomiarze wiązania substratu fosfatazy glukanowej i może być stosowany do różnych rozpuszczonych substratów glukanu.

Test sedymentacyjny na bazie konkanawaliny A do pomiaru wiązania substratów fosfataz glukanu

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

Naucz się testu kosedymentacji aktyny do analizy wiązania białek z F-aktyną in vitro. Ta metoda pozwala badać dynamikę cytoszkieletu aktynowego i specyficzność białek wiążących aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Przeglądaj więcej filmów