Name: Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test żywy/martwy z cytometrią przepływową do ilościowego oznaczania przeżycia komórek drożdży po stresie oksydacyjnym. Metoda wykorzystuje barwniki fluorescencyjne SYTO 9 i jodek propidyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Michaelowi Daileyowi oraz Carver Center for Imaging za ich szkolenia i wsparcie w zakresie mikroskopii. Chcielibyśmy podziękować byłym i obecnym członkom Gene Regulatory Lab za bezcenne opinie dotyczące protokołu. Prace te są wspierane przez NIH R35GM137831 to BZH.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Zastosowanie stresu nadtlenku wodoru
<ol>
	<li>Co najmniej dzień przed eksperymentem należy otoczyć nocną hodowlę C. glabrata z pojedynczej kolonii na świeżo posypanej płycie do 3 mL podłoża syntetycznego kompletnego (SC) (1,7 g/L zasad azotu drożdżowego, kompletna mieszanka aminokwasów, 2% glukozy w/v, woda), a następnie hodować, umieszczając szklaną rurkę w bębnie rolkowym i uprawiać w temperaturze 30 °C. Alternatywnie, Orbitalny shaker można zastosować, umieszczając szklaną rurkę pod kątem i potrząsając hodowlą z prędkością 200 obr./min.<ol>
		<li>Następnego ranka zmierz gęstość optyczną (OD600) nocnej hodowli i rozcieńcz ją świeżym medium SC do OD600 ~0,2 w całkowitej objętości 10 mL. Pozwól mu rosnąć przez dwa podwójne podwojenia, co zajmuje około 4 godzin, aby osiągnąć fazę środkową (OD600 ~1). 
		PRZYKŁAD: Jeśli hodowla nocna ma OD600 = 10, dodaj 200 μL tej kultury do nośnika SC o pojemności 9,8 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na 30 minut przed zabiegiem stresowym przygotuj medium stresowe z nadtlenkiem wodoru. Seryjnie rozcieńczaj nadtlenek wodoru z 30% materiału (9,798 M) do medium Synthetic Complete (SC) do pożądanego stężenia. Uwzględnić zabieg próbny (SC bez dodatku nadtlenku wodoru) oraz dawkę śmiertelną (1 M jest odpowiednia dla C. glabrata). 
	PRZYKŁAD: Aby uzyskać medium stresujące nadtlenek wodoru o objętości 100 mM, dodaj 10,3 μL z zapasu nadtlenku wodoru o pojemności 9,798 M do 1 mL SC. Delikatnie pipetuj do wymieszania. Aby uzyskać medium stresowe z nadtlenkiem wodoru o objętości 10 mM, rozcieńcz 500 μL z 100 mM medium stresowego nadtlenku wodoru do 4,5 mL warstwy SC.</li>
	<li>Zmierz OD600 kultury mid-log i standaryzuje go np. doOD 600 = 1, dodając media SC. 
	PRZYKŁAD: Kultura środkowego logu jest naOD 600 = 1,2. Dodaj 0,2 mL medium SC na 1 mL kultury.</li>
	<li>Przelej 600 μL kultury w trakcie jednego dziennika na każdą próbę do płyty głębokiej o pojemności 96 μL. Ogniwa na pellety przez wirowanie w 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń supernatant przez aspirację, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Dodaj 600 μL podłoża z udawanym lub nadtlenkiem wodoru przygotowanego w kroku 1,2 do każdego dołku i delikatnie pipetuj, aby ponownie zawiesować komórki.</li>
	<li>Inkubuj płytkę przez 120 minut w temperaturze 30 °C, potrząsając przy 300 obr./min. UWAGA: Czas inkubacji zależy od interesującego zagadnienia biologicznego.</li>
</ol>
2. Nakładanie barwnika SYTO 9/PI
<ol>
	<li>Przed eksperymentem przygotuj co najmniej 10 mL buforu soli fizjologicznej 0,85%. UWAGA: Stwierdziliśmy, że bufor soli fizjologicznej 0,85% powoduje minimalne artefakty barwienia, czyli komórki niebarwione i martwe w próbkach poddawanych zabiegom, w porównaniu z wodą dejonizowaną lub medium wzrostu16.</li>
	<li>Przygotuj działający roztwór zapasowy PI o stężeniu 0,2 mM przy użyciu sterylnej, dejonizowanej wody. UWAGA: Ten zapas roboczego PI można przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bezpośrednio przed eksperymentem przygotować działający roztwór SYTO 9 w stężeniu 33,4 μM z sterylną, dejonizowaną wodą. UWAGA: Przygotuj gotowy zapas roboczy SYTO 9 świeży do każdego eksperymentu. Nie przechowuj i nie używaj ponownie.</li>
	<li>Delikatnie pipetuj, aby wymieszać komórki w każdej jamce z płytki leczniczej. Zmierz OD600 każdego stanu leczenia i oblicz ilość buforu potrzebnego do ponownego zawieszenia komórek do OD600 równej 1. UWAGA: Pipety wielokanałowe mogą być używane do efektywnego i równomiernego mieszania. Unikaj nadmiernego mieszania próbek.</li>
	<li>Zbierz komórki drożdży po zabiegu próbnym lub stresowym poprzez wirowanie w dawce 3000 x g przez 5 minut. Ostrożnie usuwaj supernatant przez aspirację. Ponownie zawiesz komórki w sterylnym buforze soli fizjologicznej 0,85% do OD600 = 1 (obliczane w kroku 2,4). UWAGA: Użyj pipety wielokanałowej do ponownego zawieszenia komórek. Traktuj wszystkie kultury po leczeniu z ostrożnością i unikaj nadmiernego mieszania.</li>
	<li>Zarezerwuj 50 μL każdej próbki jako kontrolę barwienia bez barwienia i pojedynczego barwnika. UWAGA: Minimalna autofluorescencja została stwierdzona dla dzikiego typu C. glabrata w obu kanałach dla SYTO 9 i PI. Jednak zawsze sprawdzaj niebarwione próbki pod kątem autofluorescencji i wykonuj odpowiednie odejmowanie tła lub używaj medium wzrostu o niskiej autofluorescencji.</li>
	<li>Aliquot 16 μL próbki po leczeniu zawieszono w buforze soli fizjologicznej 0,85% do probówki PCR o pojemności 50 μL. Dodaj 2 μL z 0,2 mM roboczego zapasu PI do zawiesiny ogniwa. Następnie dodaj 2 μL z 33,4 μM roboczego zapasu SYTO 9 do tej samej rurki, co daje końcową objętość 20 μL.<ol>
		<li>Końcowe stężenia PI i SYTO 9 wynoszą odpowiednio 20 μM i 3,34 μM. Delikatnie pipetować, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut w ciemności (można użyć czarnego pudełka) w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja i kalibracja cytometru przepływowego
UWAGA: Powinno się to stosować przy każdym nowym przyrządzie, a także przy nowych zastosowaniach barwienia SYTO 9/PI, w tym dla innego gatunku/szczepu, nowego czynnika stresoru lub protokołu wzrostu itp. Poniższe ustawienia zostały opracowane na cytometrze przepływowym Attune NxT. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji obsługi używanego instrumentu.
<ol>
	<li>Do wyboru odpowiednich kanałów/filtrów fluorescencyjnych dla cytometru przepływowego: do zbierania sygnałów w kanałach zielonym (SYTO 9) i czerwonym (PI i SYTO 9) użyto filtra pasmowego 530 nm ± 30 nm (BL1) oraz filtra długprzepustowego 600 nm (> 600 nm, BL3). Obaj byli podekscytowani laserem niebieskim o średnicy 488 nm.</li>
	<li>Ustaw przepływ na 200 μL/min i zatrzymaj się, gdy zostanie zebranych co najmniej 30 000 zdarzeń. UWAGA: Liczbę zdarzeń na próbę można dostosować w celu uzyskania solidnych szacunków procentów. Próbki z zbyt małą liczbą zdarzeń (komórek) powinny być wykluczone. Kolejnym krokiem jest regulacja napięć na kanałach FSC i SSC podczas początkowej konfiguracji.</li>
	<li>Rozcieńcz próbkę 16 μL poddawaną próbce bez barwienia na 200 μL sterylnej soli fizjologicznej o pojemności 0,85%. Delikatnie pipetuj, aby wymieszać tuż przed cytometrią przepływową. Przeprowadź tę próbkę i dostosuj napięcia kanałów FSC i SSC tak, aby populacja była w centrum FSC w porównaniu do Wykres gęstości SSC. UWAGA: Dla FSC i SSC zastosowano napięcie 345 mV i 399 mV. Kolejne kroki to regulacja napięć na kanałach zbiorczych (BL1 i BL3) podczas początkowej konfiguracji.</li>
	<li>Wymieszaj próbkę 24 μL poddawaną efektowi poddawaną 24 μL 1000 mM impregnowanej nadtlenkiem wodoru lub zabijaną termicznie.</li>
	<li>Podziel mieszaną próbkę żywej i martwej komórki na trzy probówki po 16 μL każda. Barw trzy rurki wodą (1) 2 μL SYTO 9 i 2 μL przez 30 minut; (2) 2 μL PI i 2 μL wody przez 30 minut; (3) 2 μL SYTO 9 i 2 μL PI przez 30 minut. Stosuj się do protokołu barwienia z poprzedniej sekcji.<ol>
		<li>Po inkubacji do każdej probówki dodaj 200 μL bezpłodnego buforu soli fizjologicznej 0,85%. Są już gotowe do cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rurka (1) reguluje napięcie kanału zielonej fluorescencji (BL1); następnie przeprowadzić lampę (2), aby regulować napięcie czerwonej fluorescencji (BL3). Celem jest, aby tryb rozkładu intensywności każdego kanału wynosił ~104-10 5 , aby wykorzystać pełny zakres dynamiki instrumentu. UWAGA: Prosimy o stosowanie się do instrukcji specyficznego cytometru przepływowego podczas regulacji napięcia. Niektóre cytometry przepływowe mają stałe napięcia i ten krok jest pomijany.</li>
	<li>Przełącz rurkę (3), aby sprawdzić, czy populacje żywych i martwych komórek są dobrze rozdzielone. W razie potrzeby dostosuj napięcia kanałów BL1 lub BL3. UWAGA: Napięcie 200 mV było używane zarówno dla kanałów BL1, jak i BL3 na Attune NxT.</li>
	<li>Próbkę poddawaną zabiegowi bez barwienia przeprowadzić pod ustalone ustawienia napięcia, aby upewnić się, że próbka ma minimalną autofluorescencję w interesujących kanałach (<102).</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek na cytometrze przepływowym
<ol>
	<li>Należy zastosować ustawienia cytometru przepływowego ustalone powyżej i najpierw przeprowadź próbkę bez barwienia, aby upewnić się, że sygnały autofluorescencji są poniżej 102 zarówno w kanałach BL1, jak i BL3.</li>
	<li>Dodaj 200 μL buforu soli fizjologicznej 0,85% do każdej zabarwionej próbki i przesłuchaj ją na cytometrze przepływowym. UWAGA: Jeśli pobierane są próbki wielokrotnie, należy stopniowo rozłożyć etap barwienia tak, aby każda próbka była barwiona przez 30 minut przed przeprowadzeniem na cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Eksport wyników cytometrii przepływowej jako pliki .fcs (standard FCS 3.0 lub 3.1).</li>
</ol>
5. Analiza danych w R
UWAGA: Przykładowy skrypt analizy jest udostępniony jako Plik Uzupełniający 1. Przykładowe strategie bramkowe są przedstawione w sekcji Reprezentatywne Rezultaty.
<ol>
	<li>Zainstaluj i załaduj wymagane pakiety: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.</li>
	<li>Importuj pliki .fcs do obecnego środowiska R.</li>
	<li>Dostosuj nazwy plików i określ warunki leczenia.</li>
	<li>Zrób 2D wykres gęstości dla wszystkich zdarzeń na FSC. H wobec SSC.H. Użyj bramki wielokątnej, aby wykluczyć zdarzenia niekomórkowe. Nazwijmy tę bramę "komórkami". UWAGA: Na niektórych cytometrach przepływowych zalecany jest parametr Powierzchni zamiast Wysokości. Sprawdź zalecenia specyficzne dla instrumentów.</li>
	<li>Dla populacji "komórek" z bramkami zrób 2D wykres gęstości na FSC. H wobec FSC.W. Zazwyczaj widoczne są dwa skupiska o podobnych zakresach FSC. H, ale inna FSC.W. Klaster o niższej średniej FSC. Poziom W zawiera pojedyncze komórki ("singlety"). Narysuj bramę wielokątną, aby je wybrać i nazwać bramę "singlety".</li>
	<li>Dla populacji "singletów" z bramkami zrób 2D wykres gęstości na BL1. H przeciwko BL3.H. Narysuj bramki wielokątne dla żywych, uszkodzonych i martwych populacji na podstawie kontroli żywych i martwych komórek. Przykład przedstawiono w sekcji Reprezentatywne Rezultaty.</li>
	<li>Określ przeżywalność, używając procentów każdej populacji i eksportuj statystyki.</li>
</ol>

<ol><li>Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+survival+of+a+probiotic+yeast+in+dairy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products.</a> Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).</li>
<li>Qiu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+tolerance+phenotype+of+industrial+yeast%3A+industrial+cases%2C+cellular+changes%2C+and+improvement+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).</li>
<li>Welsh, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+persistence%2C+and+isolation+of+the+emerging+multidrugresistant+pathogenic+yeast+Candida+auris+on+a+plastic+health+care+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface.</a> J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).</li>
<li>Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+FUN1+family+of+fluorescent+probes+for+vacuole+labeling+and+viability+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts.</a> Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).</li>
<li>WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+cell+death+and+methods+of+their+detection+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).</li>
<li>Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIVE%2FDEAD+BacLight%3A+Application+of+a+new+rapid+staining+method+for+direct+enumeration+of+viable+and+total+bacteria+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water.</a> J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).</li>
<li>Zhang, T., Fang, H. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Saccharomyces+cerevisiae+viability+using+BacLight%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight.</a> Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%2C+BacLight%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.</a> Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).</li>
<li>Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+profiles+of+regulatory+kinases+differ+between+environmental+conditions+and+cellular+states%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states.</a> Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allicin+shows+antifungal+efficacy+against+Cryptococcus+neoformans+by+blocking+the+fungal+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane.</a> Front Microbiol. 13, 1012516(2022).</li>
<li>Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+new+probes+and+stains+for+improved+assessment+of+cell+viability+and+extracellular+polymeric+substances+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms.</a> Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).</li>
<li>Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+biofilm+tolerance+towards+systemic+antifungals+depends+on+growth+phase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase.</a> BMC Microbiol. 14, 305(2014).</li>
<li>Ryan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+potent+and+selective+host+defense+peptide+mimetics+in+mouse+models+of+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).</li>
<li>Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+antibiotic+amphotericin+B+effect+on+Candida+albicans+plasma+membrane+permeability+and+cell+viability+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J.+%28EBJ%29%22%5BJournal%5D)">A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions.</a> Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).</li>
<li>Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+and+antibiofilm+activity+of+the+first+cryptic+antimicrobial+peptide+from+an+archaeal+protein+against+Candida+spp.+clinical+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates.</a> Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).</li>
<li>Tang, H., Liang, J., He, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+LIVE%2FDEAD+assay+using+flow+cytometry+to+quantify+poststress+and+antifungaltreatment+survival+in+diverse+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRiv%22%5BJournal%5D)">An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts.</a> BioRiv. , (2025).</li>
<li>Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).</li>
<li>Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+yeast+regulated+cell+death%3A+Trespassing+the+point+of+no+return+to+loss+of+plasma+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity.</a> Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).</li>
<li>CarmonaGutierrez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+recommendations+on+yeast+cell+death+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature.</a> Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).</li>
<li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+colony+size+to+measure+fitness+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów.

Protokół ten opisuje test ŻYWY/MARTWY z użyciem dwóch fluorescencyjnych barwników, SYTO 9 i PI, oraz wykorzystując cytometrię przepływową do ilościowego określenia przeżycia drożdży po stresie. Chociaż te dwa barwniki zostały zastosowane w literaturze do oceny przeżywalności różnych gatunków drożdży i są dostępne jako zestaw komercyjny, ani instrukcja producenta, ani literatura nie dostarczają wystarczających szczegółów dotyczących protokołu barwienia ani ustawień cytometrii przepływowej7. Przedst...

Podfilum drożdży pączkujących zawiera wiele ważnych modeli biologicznych i biotechnologicznych. Powszechnym i kluczowym zadaniem w badaniach nad drożdżami jest ilościowe określenie wpływu zaburzeń genetycznych lub środowiskowych, w tym tych ostatnich – leczenia stresowego lub farmakologicznym. Na przykład w fermentacji przemysłowej producenci muszą monitorować żywotność hodowli drożdży, aby zapewnić efektywność i jakość procesu fermentacji 1,2. Podczas badania patogennych gatunków drożdży pomiar ich przeżywalności po leczeniu stresowym lub przeciwgrzybiczym jest kluczowy dla zrozumienia genetycznych i mechanistycznych podstaw cech związanych z infekcją, takich jak oporność przeciwgrzybicza. Pomiar przeżywalności na cewnikach i powierzchniach jest również ważnym zadaniem w warunkach klinicznych3. Te różnorodne scenariusze wymagają podejść ilościowych, które mogą szybko i dokładnie mierzyć efekty leczenia farmakologicznego i leczenia stresowego.
Istniejące metody osiągania powyższego celu dzielą się na trzy główne kategorie w zależności od tego, co mierzą. Pierwsza kategoria mierzy klonogeniczność, czyli zdolność poszczególnych komórek drożdży do tworzenia jednej kolonii po stresie. Reprezentatywną metodą w tej kategorii jest test Colony Forming Unit (CFU). Druga kategoria mierzy witalność, która opiera się na wykrywaniu aktywności enzymatycznej w komórkach żywych. Przykładami są sondy chemiczne, takie jak barwnik FUN-14. Trzecia kategoria metod mierzy integralność błony plazmatycznej – nieodwracalna utrata integralności błony plazmatycznej jest uznawana za "punkt bez powrotu" dla śmierci komórki5. Przykładami tej kategorii są barwniki fluorescencyjne, takie jak jodek propidiu (PI).
Praca ta przedstawia zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową, aby osiągnąć szybkie i skalowalne określenie przeżycia drożdży po leczeniu stresowym. Ten test oparty na przepuszczalności błony jest szybszy niż CFU, ponieważ trwa 15-30 minut barwienia w porównaniu do 24-48 godzin inkubacji, aby utworzyć się kolonie. Ponadto próbki barwione barwieniem ŻYWYM/MARTWYM można łatwo badać za pomocą cytometrii przepływowej oprócz mikroskopii, która mierzy dziesiątki tysięcy komórek w ciągu kilku sekund i umożliwia łatwe przetwarzanie próbek 96-dołkowych do testów o wysokiej przepustowości. W rezultacie ten test jest szybki, ilościowy i skalowalny. W tym protokole stosuje się dwuskładnikowy barwnik LIVE/DEAD składający się z SYTO 9 i PI, aby uzyskać zwiększoną rozdzielczość. SYTO 9 oznacza wszystkie komórki, żywe lub martwe, natomiast PI wchodzi do komórek z uszkodzonymi błonami plazmocznymi 6,7. Dlatego żywe komórki gromadzą tylko SYTO 9, podczas gdy martwe komórki gromadzą zarówno SYTO 9, jak i PI. Ponieważ PI ma wyższe powinowactwo niż SYTO 9 do kwasu nukleinowego, konkurencyjnie wyklucza ten ostatni w komórce8. Ponadto oba barwniki tworzą parę Förstera Rezonansu Energii Transferowej (FRET), gdzie emisja SYTO 9 jest pochłaniana przez PI jako wzbudzenie. W rezultacie martwe komórki wykazują stonowaną zieleń i silną czerwoną fluorescencję. Dla porównania, żywe komórki wykazują jasnozieloną fluorescencję8. Ta różnica umożliwia lepsze rozróżnienie między żywymi a martwymi komórkami w obecności zmienności intensywności fluorescencji w każdej grupie.
Od czasu pierwszego raportu dotyczącego zastosowania SYTO 9/PI w badaniach drożdży w 2004 roku stosowanie SYTO 9/PI było nieregularne i w dużej mierze ograniczone do ocen jakościowych z użyciem mikroskopii 7,9,10,11,12,13,14,15 . Głównym ograniczeniem jego zastosowania jako ilościowego testu przeżywalności drożdży jest brak systematycznej charakterystyki i porównania z szeroko stosowanymi metodami, takimi jak CFU. Protokół ten opisuje standaryzowany test obejmujący bufor barwienia, stężenie barwnika, czas barwienia oraz ustawienia cytometrii przepływowej, które minimalizują artefakty i dają powtarzalne wyniki stosowane do C. glabrata oraz dwóch innych drożdży16. Ponieważ barwienie SYTO 9/PI ujawnia pośrednią "uszkodzoną" populację komórek, które różnią się wzorcem barwienia zarówno od żywych, jak i martwych, może uzupełnić CFU, ujawniając bardziej szczegółowe informacje o wpływie leczenia stresu na komórki drożdży, co potencjalnie umożliwia nowe zastosowania.

<table><tbody><tr><td>Płytka z 96 studniami głębokimi studni</td><td>Thermo Fisher</td><td>278606</td><td>NUNC 96</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Attune NxT z czytnikiem płytowym</td><td>Thermo Fisher A24858</td><td>A24858</td><td>Autosampler (A42901)</td></tr><tr><td>Candida glabrata</td><td></td><td></td><td>CG99, szczep laboratoryjny pochodzący z izolatu klinicznego (Cormack & In. Falkow, 1999)</td></tr><tr><td>Zestaw FungaLight Yeast LIVE/DEAD</td><td>Thermo Fisher A24858</td><td>L34952</td><td>Zawiera SYTO 9 (3,34 mM) oraz jodek propidium (20 mM). Te dwa komponenty można również kupić osobno u różnych dostawców.</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Leica Confocal SP8</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 X</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>Używany do produkcji sterylnego roztworu NaCl 0,85%</td></tr><tr><td>Zasada azotu drożdży bez aminokwasów</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Wykorzystywane do produkcji Synthetic Complete medium z mieszanką glukozy i aminokwasów 2%</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany test Żywy/martwy połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

An Optimized LIVE/DEAD Assay Coupled with Flow Cytometry for Quantifying Post-Stress Survival in Yeast Cells

Ilościowe określenie przeżywalności jest powszechnym i kluczowym zadaniem w badaniach nad drożdżami. Barwienia LIVE/DEAD oparte na integralności błony plazmatycznej zapewniają szybkie i wysokoprzepustowe badanie przeżywalności drożdży w połączeniu z cytometrią przepływową. Jednak zmiany w buforze barwniowym, stężeniu barwnika, czasie inkubacji oraz ustawieniach cytometrii przepływowej mogą wpływać na jakość danych i powtarzalność. Protokół ten przedstawia standaryzowany test LIVE/DEAD do ilościowej analizy przeżycia po stresie u drożdży z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Po leczeniu Candida glabrata, oportunistycznego patogenu drożdży, różnymi dawkami nadtlenku wodoru, próbki po stresie zostały zabarwione dwuskładnikowym barwieniem LIVE/DEAD składającym się z SYTO 9 i jodku propidium (PI). Cytometria przepływowa została wykorzystana do rozróżnienia populacji żywych, uszkodzonych i martwych komórek oraz ilościowego określenia ich procentowej wartości w każdej próbce. Szacunki przeżywalności oparte na statystyce procentu żywych porównano z wynikiem Colony Forming Unit (CFU) na tej samej próbie. Obie metody dały spójne wyniki dla próbek poddanych dawce atrapyjnej i śmiertelnej (1 M, H, 2O2). Przy dawce subletalnej 100 mM H2O2, SYTO 9/PI oszacował wyższy wskaźnik przeżycia niż CFU, co odzwierciedla kluczową różnicę między nimi, gdzie przedstawiony tutaj protokół ocenia przeżywalność komórek bezpośrednio po stresie, podczas gdy CFU ilościowo określa procent komórek zdolnych do regeneracji i rozmnażania się. Dlatego protokół ten mierzy żywotność na wcześniejszym etapie procesu śmierci komórki. Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi szybką i skalowalną alternatywę dla CFU do ilościowej analizy przetrwania po stresie u drożdży. Wyniki dostarczają uzupełniających informacji CFU poprzez ocenę przeżycia na wcześniejszym etapie i rozróżnienie między martwymi a uszkodzonymi komórkami.

Barwienie SYTO 9/PI odróżnia żywe komórki drożdżowe od martwych na podstawie ich sygnałów fluorescencyjnych w zielonym (500 nm-560 nm) i czerwonym (>600 nm) kanale. Żywe komórki, które gromadzą tylko SYTO 9, fluorescencją silnie w zielonym kanale, z minimalnymi sygnałami czerwonymi. Martwe komórki gromadzą zarówno SYTO 9, jak i PI i oczekuje się, że będą silnie fluorescencyjne w kanale czerwonym, z niższymi sygnałami zielonej fluorescencji w porównaniu do komórek żywych ze względu na konk...

Przedstawiamy tutaj protokół mającycy mierzenie przeżycia po stresie w próbkach drożdży. Test wykorzystuje dwa barwniki fluorescencyjne, SYTO 9 i jodek propidiu (PI), do ilościowego określenia integralności błony plazmatycznej. Wykorzystuje cytometrię przepływową do dostarczania ilościowych i powtarzalnych szacunków ułamków żywych, martwych i uszkodzonych komórek dla próbek po stresie utlencyjnym.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Quantifying survival is a common and critical task in yeast research. LIVE/DEAD stains based on plasma membrane integrity provide a rapid and ...

an-optimized-livedead-assay-coupled-with-flow-cytometry-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Źródło: Chapman, I. J. i wsp., Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia metodę rozróżniania żywych i martwych komórek Microcystis aeruginosa poprzez połączenie znakowania sondą fluorescencyjną z analizą autofluorescencji fikocyjaniny i sygnałem sondy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza żywotności Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Badanie metabolizmu staje się coraz bardziej istotne dla badań immunologicznych. W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru glikolizy i oddychania mitochondrialnego w mysich splenocytach oraz limfocytach T i B.

Zoptymalizowany protokół analizy glikolizy i oddychania mitochondrialnego w limfocytach

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj zoptymalizowany test żywy/martwy z cytometrią przepływową do ilościowego oznaczania przeżycia komórek drożdży po stresie oksydacyjnym. Metoda wykorzystuje barwniki fluorescencyjne SYTO 9 i jodek propidyny.

Zoptymalizowany test ŻYWY/MARTWY połączony z cytometrią przepływową do ilościowego przeżycia po stresie w komórkach drożdży

Przeglądaj więcej filmów