Name: Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas komórek włóknistych. Protokół umożliwia analizę transkryptomów i identyfikację różnic ekspresji genów między typami komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu R01 EY032056 (do CC) z National Eye Institute.

<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
<li>Bassnett, S., Winzenburger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+fibre+cell+growth+in+the+developing+chicken+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens.</a> Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).</li>
<li>Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+proliferating+activity+in+lens+epithelium+and+the+identification+of+tissue-type+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells.</a> Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+organelle+degradation+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+the+Golgi+apparatus+and+the+endoplasmic+reticulum+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).</li>
<li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+organelle+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Lens organelle degradation.</a> Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).</li>
<li>Bassnett, S., Beebe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincident+loss+of+mitochondria+and+nuclei+during+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation.</a> Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).</li>
<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+glass%3A+Structural+determinants+of+eye+lens+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li>
<li>Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+breakdown+during+terminal+differentiation+of+primary+lens+fibres+in+mice%3A+A+transmission+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study.</a> Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).</li>
<li>Counis, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nuclear+degradation+during+lens+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation.</a> Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).</li>
<li>Piatigorsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+differentiation+in+vertebrates.+A+review+of+cellular+and+molecular+features%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features.</a> Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).</li>
<li>Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+compaction+of+lens+fibers+affects+the+structure+and+optical+properties+of+rabbit+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses.</a> BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Report+on+Vision%22">World Report on Vision</a>. , World Health Organization. Geneva. (2019).</li>
<li>Hashemi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+prevalence+of+age-related+cataract%3A+A+comprehensive+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis.</a> Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Cheng, C., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+roles+of+eph%2Fephrin+signaling+in+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens.</a> PLoS One. 6 (11), e28147(2011).</li>
<li>Ibaraki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brighter+future+for+cataract+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A brighter future for cataract surgery.</a> Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).</li>
<li>Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+autoradiographic+studies+of+the+lens+epithelium.+Normal+and+x-irradiated+rat+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes.</a> Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).</li>
<li>Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+cutoff+value+for+real-time+polymerase+chain+reaction+results+to+fit+a+diagnostic+purpose%3A+Analytical+and+epidemiologic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Diagn+Invest%22%5BJournal%5D)">Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches.</a> J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).</li>
<li>60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf</a> (2009).</li>
<li>Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+directed+against+connexin43+peptides+react+with+a+43-kd+protein+localized+to+gap+junctions+in+myocardium+and+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues.</a> J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).</li>
<li>Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+in+lens+development+and+cataractogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexins in lens development and cataractogenesis.</a> J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).</li>
<li>Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+n-cadherin+linked+c-src+and+fyn+kinases+in+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development.</a> Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).</li>
<li>Leonard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+n-cadherin+junctions+and+their+role+as+epicenters+of+differentiation-specific+actin+regulation+in+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens.</a> Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).</li>
<li>Logan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+regulates+signaling+mechanisms+required+for+lens+fiber+cell+elongation+and+lens+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis.</a> Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).</li>
<li>Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+gtpase+is+required+for+mouse+lens+epithelial+maintenance+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis.</a> Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).</li>
<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).</li>
<li>Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin46%2C+a+novel+lens+gap+junction+protein%2C+induces+voltage-gated+currents+in+nonjunctional+plasma+membrane+of+xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes.</a> J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).</li>
<li>Rong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+gja8+%28alpha8+connexin%29+in+mice+leads+to+microphthalmia+associated+with+retardation+of+lens+growth+and+lens+fiber+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation.</a> Development. 129 (1), 167-174 (2002).</li>
<li>Terrell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+mouse+lens+epithelial+cell+lines+and+their+suitability+to+study+RNA+granules+and+cataract+associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes.</a> Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).</li>
<li>White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cx50%2C+a+functional+member+of+the+connexin+family+of+gap+junction+proteins%2C+is+the+lens+fiber+protein+mp70%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).</li>
<li>Xia, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cell+clusters+and+upregulated+Aqp1+in+connexin+50+knockout+lens+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).</li>
<li>Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43%3A+A+protein+from+rat+heart+homologous+to+a+gap+junction+protein+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver.</a> J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).</li>
<li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Alpha3+connexin+gene+leads+to+proteolysis+and+cataractogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice.</a> Cell. 91 (6), 833-843 (1997).</li>
<li>Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+E-%2C+N-+and+P-cadherin+expression+in+mouse+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development.</a> Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).</li>
<li>Nishina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6+expression+in+the+developing+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Pax6 expression in the developing human eye.</a> Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).</li>
<li>Wistow, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamman-crystallin+and+the+evolution+of+the+betagamma-crystallin+superfamily+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates.</a> FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).</li>
<li>Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cellular%2C+and+molecular+level+determinants+for+eye+lens+stiffness+and+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ophthalmol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity.</a> Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).</li>
<li>Huynh, P. N., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+comparison+of+eph%2Fephrin+gene+expression+in+ocular+lenses+from+aging+and+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ophthalmol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice.</a> Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).</li>
<li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> J Vis Exp. (31), e1519(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj kroki pokazują zdolność do izolowania RNA z oddzielnych przedziałów soczewki, które można z powodzeniem odwrócić transkrypcję na cDNA w metodach biologii molekularnej. Ze względu na wrażliwy charakter metod analizy, ważne jest, aby soczewka była oczyszczona z przyczepionych tkanek na etapie sekcji. Może to wymagać kilku iteracji toczenia soczewki na Kimwipe, aby uzyskać odpowiednią czystość. Należy zachować ostrożność, aby nie wnikać zbyt głęboko w soczewkę podczas oddzielania torebki kolagenowej od w...

Soczewka oczna to przezroczysty narząd, który precyzyjnie skupia światło na siatkówce, aby uzyskać wyraźny obraz. Soczewka składa się z dwóch głównych typów komórek: monowarstwy komórek nabłonkowych pokrywających przednią półkulę i komórek włóknistych, które tworzą masę masową tkanki (ryc. 1). Soczewka jest otoczona kolagenową błoną podstawną znaną jako torebka soczewki, do której ściśle przylegają komórki nabłonka. W miarę wzrostu soczewki komórki nabłonkowe na równiku proliferują i różnicują się w powstające powłoki komórek włóknistych, które są nakładane na soczewkę w sposób koncentryczny 1,2,3. Wzrost soczewki przez całe życie zależy od ciągłej proliferacji tej niewielkiej populacji komórek nabłonka równikowego, które tworzą strefę kiełkowania4. W miarę dojrzewania komórek włóknistych wszystkie organelle komórkowe ulegają degradacji w celu wyeliminowania obiektów rozpraszających światło 5,6,7,8,9,10,11 i utrzymania przezroczystości tkanek, a najbardziej wewnętrzne komórki włókniste są ostatecznie zagęszczane, co skutkuje sztywnym środkiem soczewki 9,12. Ze względu na otaczającą torebkę soczewki nie zachodzi obrót komórek w soczewce, a włókna nasienne pozostają w środku soczewki przez całe życie, ponieważ nowe włókna są dodawane na obrzeżach tkanki lub kory. Komórki światłowodowe soczewki mają różne właściwości optyczne w zależności od ich wieku i mogą zapewnić czasowy obraz różnych cech biologicznych na każdym danym etapie13.
Pomimo dostępnych opcji chirurgicznych, zaćma, definiowana jako każde zmętnienie normalnie przezroczystej soczewki, pozostaje główną przyczyną ślepoty na świecie14. Zaćma może objawiać się w nabłonku soczewki, korze lub jądrze o różnych patofizjologiach15. Jednak komórkowe i molekularne mechanizmy powstawania zaćmy pozostają niejasne16,17. Aby lepiej zrozumieć, jak zapobiegać tym różnym typom zaćmy i opracować alternatywy dla operacji, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób te różne typy komórek utrzymują homeostazę w soczewce.
Komórki nabłonkowe i włókniste odgrywają różne role fizjologiczne w soczewce. Na przykład proliferacja komórek jest ograniczona do nabłonka soczewki18. Tymczasem włókna soczewki stanowią masę masową soczewki, nadając jej strukturę i właściwości refrakcyjne9. Aby uzyskać bardziej zniuansowaną perspektywę procesów biologicznych zachodzących w różnych przedziałach soczewki, komórki nabłonkowe i włókniste muszą być badane oddzielnie. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolowania nabłonka od masy masowej komórki włóknistej, ekstrakcji mRNA z każdej frakcji i analizy tych transkryptów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69079/69079fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Diagram anatomii obiektywu. Soczewka składa się z dwóch typów komórek, jednowarstwowych komórek nabłonkowych (niebieskich i pomarańczowych) pokrywających przednią półkulę oraz masowej masy włókien soczewki (białych). Tkanka jest otoczona cienką błoną kolagenową, znaną jako torebka soczewki (tan). Komórki nabłonka przedniego (niebieskie) są w stanie spoczynku, podczas gdy komórki nabłonka równikowego (pomarańczowe) namnażają się, różnicują i wydłużają, stając się nowymi warstwami komórek włóknistych (białymi) na obrzeżach soczewki. Nowe generacje komórek światłowodowych są nakładane na poprzednie generacje włókien w koncentrycznych powłokach. Najstarsze komórki włókien soczewki są zagęszczone w środku tkanki. Rysunek ten został zmodyfikowany z Cheng (2024)38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69079/69079fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Wirówka i wirnik</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14285554po południu</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, klasa HPLC</td><td>Alfa Aesar</td><td>22920</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (190 proof)</td><td>Laboratoria Decon</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Odczynniki biologiczne Fisher</td><td>Zobacz materiał BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tłuczek do pelletu</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze, zakrzywione; Pęseta studencka #7</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze, proste; Dumont #5</td><td>Narzędzia naukowe</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze, proste; Pęseta studencka #4</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki kimowe, małe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Delikatne czyszczenie zadań</td></tr><tr><td>Aplikator folii samoprzylepnej MicroAmp</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Optyczna 96-dołkowa, szybka, przezroczysta płytka reakcyjna z kodem kreskowym</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4483485</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>&nbsp; 01-671-120</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, sekcja</td><td>Carl Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta osłona optyczna MiniAmp</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cykler termiczny MiniAmp</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>A37834 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>MixMate Mieszalnik płytowy Vortex</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej</td><td>Fisher Naukowy</td><td>BP28191</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS Nanodrop One Microvolume</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-JEDEN-W</td><td></td></tr><tr><td>Minitacki Nunc MicroWell</td><td>Fisher Naukowy</td><td>12-565-154</td><td>Taca preparcyjna</td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Firma VWR</td><td>201007-012</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Naukowy</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x Dulbecco's</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 10 i mikro; L Z podziałką</td><td>USA Naukowe</td><td>1161-3700</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1250 i mikro; L XL z podziałką</td><td>USA Naukowe</td><td>1161-1720</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, 200 i mikro; Profil L z podziałką</td><td>USA Naukowe</td><td>1163-1700</td><td></td></tr><tr><td>System QuantStudio 3 do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>Nr kat. A28567</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza, SuperScript IV VILO&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>Wysoce procesyjna i termostabilna odwrotna transkryptaza</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA 5</td><td>Zymo powiedział:</td><td>Zobacz materiał ZR1013</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Odczynniki biologiczne Fisher</td><td>Zobacz materiał BP2819</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap powiedział:</td><td>Sigma</td><td>Czynnik chłodniczy 2020</td><td>Roztwór do dekontaminacji RNazy</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek SealRite 1,5 ml</td><td>USA Naukowe</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Vanny SuperFine 8 cm</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>501778</td><td>Nożyczki</td></tr><tr><td>TaqMan FAST Advanced Master Mix do qPCR</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>Test ekspresji genów TaqMan (FAM) Sonda (MTO)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>4448892</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Roztwór kwasowo-guanidynowo-fenolowy</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880017</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja rna z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

Soczewka jest wyspecjalizowaną, przezroczystą tkanką w przedniej komorze oka, która składa się z dwóch głównych typów komórek, komórek nabłonkowych i komórek włóknistych. Monowarstwa komórek nabłonka soczewki pokrywa przednią półkulę soczewki, podczas gdy większość soczewki składa się z masy komórek włókien soczewki. Kolagenowa błona podstawna, znana jako kapsułka, otacza i otacza całą tkankę. Komórki nabłonka soczewki są silnie przylegające do torebki soczewki i można je łatwo oddzielić od masy włókien poprzez oderwanie kapsułki od tkanki. Trudności z uzyskaniem wystarczającego stężenia RNA z powodu małej liczby komórek nabłonkowych w monowarstwie soczewki wcześniej utrudniały badanie transkryptomów komórek nabłonkowych w porównaniu z komórkami włóknistymi. Protokół ten przedstawia metodę czystego oddzielania i izolowania przedziałów komórek nabłonkowych i włóknistych oraz etapów koncentracji RNA, aby umożliwić późniejsze eksperymenty transkryptomiczne na próbkach komórek nabłonka z jednej pary soczewek myszy. Możliwość indywidualnego badania głównych typów komórek soczewki pomaga w badaniu biologicznych mechanizmów utrzymania i rozregulowania soczewki, umożliwiając scharakteryzowanie specyficznych dla typu komórek zakłóceń odpowiedzialnych za patologie soczewki związane z wiekiem.

Nabłonek i włókna soczewki wyizolowano od 6- do 7-tygodniowych myszy typu dzikiego. Do tych eksperymentów wykorzystano trzy myszy, a 2 kapsułki soczewkowe lub 2 masy komórek włóknistych od każdej myszy połączono w jedną replikę biologiczną. Jak opisano w protokole, RNA wyekstrahowano za pomocą separacji faz odczynnika TRIzol. Średnio para mas nabłonka soczewki i włókien dała odpowiednio 0,8 μg (SD ± 0,2) i 9,7 μg (±SD 2,3) RNA. Średnie stężenie w 15 μl elucji wynosiło 55,4 ng/μl (SD ± 16,3) i 650,0 ng/μl (SD ± 152,2) odp...

Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

The lens is a specialized, transparent tissue in the anterior chamber of the eye that is comprised of two major cell types, epithelial cells and fiber ...

Nasze badania koncentrują się na soczewce, specjalistycznej przezroczystej tkance w przedniej komorze oka. Soczewka składa się z dwóch typów komórek, komórek nabłonkowych i komórek włóknistych, które mają różne funkcje i różne transkryptomy. Istnieją trudności w ekstrakcji wystarczającego stężenia RNA z komórek nabłonka w monowarstwie soczewki, co utrudnia badanie transkryptomów w komórce nabłonkowej w porównaniu z komórką włóknistą.Zdolność do czystego oddzielenia głównych typów komórek soczewki pozwala na dokładniejsze badanie konserwacji i rozregulowania soczewki. Umożliwia to scharakteryzowanie zaburzeń specyficznych dla typu komórki, które prowadzą do patologii soczewek związanych z wiekiem. Na początek przeprowadź mikrodyekcję soczewki ze świeżo wyłuszczonych oczu myszy poddanej eutanazji.Delikatnie przetocz soczewkę po czystej, delikatnej chusteczce za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby usunąć pozostałą przylegającą tkankę soczewkowatą. Za pomocą cienkich prostych kleszczyków płytko przebij torebkę soczewki w pobliżu równika, a następnie delikatnie oderwij kapsułkę soczewki od masy objętościowej włókna, pozostawiając komórki nabłonka soczewki przyczepione do kapsułki. Usuń z kapsułki wszelkie duże kawałki włókien, które mogły odpaść podczas dekapsulacji.Teraz delikatnie chwyć kapsułkę cienkimi, prostymi kleszkami i zakręć nią w PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe włókna. Odpipetować 400 mikrolitrów zimnego odczynnika TRIzol do czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej na próbkę. Umieść dwie kapsułki soczewki lub dwie masy objętościowe włókien w każdej odpowiedniej tubie.Szczelnie zakryj rurki. Delikatnie homogenizuj masy objętościowe włókien soczewki w probówkach za pomocą czystego plastikowego tłuczka, a następnie inkubuj. W dygestoriach dodać 200 mikrolitrów chloroformu na 400 mikrolitrów odczynnika TRIzol do każdej probówki.Zamknij szczelnie probówki i energicznie potrząsaj ręką przez 15 sekund, trzymając kciuk na dnie tubki, a palec wskazujący na nasadce. Po inkubacji próbek w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut w celu umożliwienia separacji faz, odwirować próbki w temperaturze 14 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dygestorii ostrożnie przenieś przezroczystą górną fazę wodną do czystej 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej i zanotuj objętość.Następnie dodaj 200 proof etanolu do fazy wodnej w stosunku objętościowym jeden do jednego. Teraz delikatnie wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając rurkę. Przenieść zmieszany roztwór do kolumny wirowej RNA za pomocą pipetry.Odwirować kolumny wirowe o sile 16 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odrzucić przepływ i odpipetować 400 mikrolitrów buforu przygotowawczego RNA do kolumny wirowej. Po ponownym odwirowaniu kolumn wyrzuć przepływ.Dodać 700 mikrolitrów buforu do płukania RNA do kolumny wirowej. Po zakończeniu końcowego płukania i odrzuceniu przepływu, należy ponownie odwirować w temperaturze 16 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby upewnić się, że kolumna wirowa jest sucha. Przenieś wysuszoną kolumnę wirową do nowej, czystej i oznaczonej mikrorurki wirówkowej o pojemności 1.5 mililitra.Następnie odpipetować 15 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio na filtr membranowy i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę wirową po raz ostatni w temperaturze 16 000 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wymyć oczyszczony RNA. Teraz usuń i odrzuć kolumny obrotowe.Oczyszczone RNA będzie obecne w cieczy zebranej w mikroprobówkach wirówkowych. Inkubuj próbki RNA w temperaturze od 55 do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby przyspieszyć rozpuszczanie. Natychmiast umieścić próbki na lodzie po zakończeniu ogrzewania.Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zaobserwowano zróżnicowaną ekspresję genów między izolowanym nabłonkiem a masą masową komórek włóknistych. Gen Gja1, znany również jako koneksyna 43, ulegał ekspresji głównie w komórkach nabłonkowych.Natomiast gen Gja3, który koduje koneksynę 46, miał wyższą ekspresję w komórkach włóknistych. Gja8, czyli koneksyna 50, ulegała ekspresji zarówno w komórkach nabłonkowych, jak i włóknistych. Ekspresja Cdh1 kodującego E-kadherynę była wysoka w komórkach nabłonkowych, podczas gdy ekspresję Cdh2, kodującego N-kadherynę, wykryto zarówno w komórkach nabłonkowych, jak i komórkach włóknistych.Ekspresja Pax6 była silnie wzbogacona w komórkach nabłonkowych i prawie nieobecna w komórkach włóknistych. W przeciwieństwie do tego, gen Crygs kodujący krystaliczne białko gamma S wykazywał znacznie podwyższoną ekspresję w komórkach włóknistych w porównaniu z komórkami nabłonkowymi.

rna-isolation-from-mouse-ocular-lens-epithelium-fiber-cell-bulk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Ten protokół opisuje metody przygotowania obwodowych, dojrzałych i jądrowych komórek włókien kryształka oka do barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania złożonych wnikania komórki w komórkę oraz architekturę błony.

Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wideo do hodowli komórek nabłonka soczewki pierwotnej (LEC), mający na celu poprawę odtwarzalności i pomoc w badaniach nad zaćmą i zmętnieniem torebki tylnej (PCO). Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące rozwarstwiania soczewek, izolacji LEC i walidacji, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w tej dziedzinie.

Optymalizacja hodowli komórek nabłonka soczewek pierwotnych myszy: kompleksowy przewodnik po trypsynizacji

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj metodę izolacji RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas komórek włóknistych. Protokół umożliwia analizę transkryptomów i identyfikację różnic ekspresji genów między typami komórek.

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

Przeglądaj więcej filmów