Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Badamy, jak nanocząstki oddziałują z krwią, aby ujawnić wczesne objawy nowotworu, dążąc do prostego, powtarzalnego i głównie nieinwazyjnego testu diagnostycznego. Na początek rozcieńcz roztwór bazowy czterech miligramów na mililitr nano-arkuszy tlenku grafenu w ultraczystej wodzie do pożądanego stężenia. Sonikować rozcieńczony roztwór przez dwie minuty z amplitudą 28%, z ustawieniem impulsu na osiem sekund włączonych i sześć sekund wyłączone, aby zapewnić równomierną dyspersję.

Ilościowo określ stężenie roztworu rozproszonego za pomocą widzialnej spektroskopii ultrafioletowej. Następnie zmierz rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta roztworu, używając dynamicznego rozpraszania światła za pomocą 633-nanometrowego lasera helowego neonu. Rozcieńcz próbkę w ultraczystej wodzie zgodnie z limitami detekcji QVet.

Następnie rozcieńcz komercyjną liofilizowaną ludzką plazmę ultraczystą wodą w razie potrzeby. Wiruj odtworzoną plazmę w stężeniu 18 620 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz supernatant i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Teraz ilościowo określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego do korekty rozcieńczenia osocza i określenia optymalnego stosunku nanocząstek do osocza. Wymieszaj wybraną objętość nanocząstek z plazmą, aby uzyskać docelowy stosunek między nimi. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Aby wyizolować koronę białkową, wiruj próbki plazmy nanocząsteczek w temperaturze 18 620 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Opłucz powstały pellet 200 mikrolitrami ultraczystej wody. Następnie ponownie zawiesić i ponownie wirować.

Po końcowym płukaniu potwierdz obecność zwartego pelletu jako dowód izolacji kompleksu białek nanocząsteczkowych. Następnie wymieszaj środek redukujący, bufor obciążający i wodę, aby uzyskać obliczoną objętość bufora obciążeniowego. Ponownie zawiesić śrut w przygotowanym buforze ładowania.

Następnie gotuj zawiesinę w 100 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wiruj gotowaną próbkę w temperaturze 18 620 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Zbierz supernatant do nowej rurki.

Teraz przygotuj drabinę białkową, rozcieńczając standard masy cząsteczkowej w buforze niebarwionym buforem za pomocą buforu barwionego przez barwy. Rozcieńcz 10 x Tris-Glycine-SDS bufora do stężenia 1 x stężenia. Złóż komorę elektroforezy za pomocą żelu o gradientzie od 4 do 20% barwników.

Następnie wlewaj bufor do pracy, aż osiągnie zalecany poziom producenta. Załaduj 10 mikrolitrów próbki do każdego dołku. Następnie pipetuję siedem mikrolitrów drabinki do każdego dołka.

Żel uciekaj na 150 woltów przez około 90 minut w temperaturze pokojowej. Zapisz obraz żelowy jako plik tiff w tym samym folderze co skrypty. Potem otwarte wytwórstwo żelowe.

m w MATLAB. Wpisz nazwę obrazu żelowego jako nazwę obrazu. Następnie wpisz indeks jednej drabiny jako znacznik indeksowy.

Uruchom scenariusz. Zakończenie kroków zostanie pokazane w oknie poleceń, a na ekranie pojawią się cztery okna. Teraz otwórz rysunek pierwszy z oryginalnym obrazkiem żelowym na górze i jego korektą dla efektu skośnego pasa na dole.

Zmodyfikuj wartości korekty lewej i prawej, aby dostroić parametry korekcji. Otwórz Figurę Dwa. Zawiera obraz skorygowany pod kątem efektu skośnego pasa u góry oraz zdjęcie usunięte tło na dole.

Dostosuj wartość BKG par X w skrypcie, aby dostroić usuwanie tła. Zwróć uwagę, że wszystkie zidentyfikowane pasy są oznaczone pionowymi białymi liniami na Rysunku Drugim. Teraz otwórz Rysunek 3 zawierający profil intensywności pasa markera z wykrytymi szczytami po lewej i nieliniowym dopasowaniem z wartością R kwadratową po prawej.

Sprawdź podwójnie, czy liczba oczekiwanych pasm na drabinowym pasie odpowiada liczbie wykrytych szczytów użytych do procedury dopasowania. Następnie otwórz Rysunek Cztery zawierający znormalizowane profile intensywności dla wszystkich wykrytych ścieżek w żelu. Ustaw parametr eksportu na jeden, aby eksportować profile intensywności jako funkcje mas cząsteczkowych w pliku Excel.

Uruchom scenariusz. Po zakończeniu wygenerowany jest arkusz Excel w pliku roboczym zawierający profile absolutne i znormalizowane jako funkcje masy cząsteczkowej w pierwszej kolumnie. Następnie otwórz plik gel profiles pro m i uruchom skrypt.

Na ekranie pojawią się cztery okna. Otwórz Rysunek Pięć, zawierający bezwzględne profile intensywności u góry oraz odpowiadające im całkowite intensywności na dole dla każdego pasa. I Rysunek Sześć zawierający znormalizowane profile intensywności dla każdego pasa.

Oś masy cząsteczkowej podzielona jest według zakresów określonych jako reg w skrypcie. Ustaw dane eksportu na jeden, aby eksportować obszary absolutne i znormalizowane całkowite. Uruchom scenariusz.

Po zakończeniu wygenerowany zostanie arkusz kalkulacyjny w roboczym folderze zawierającym eksportowane obszary absolutne i znormalizowane w określonych zakresach masy cząsteczkowej. Na koniec otwarte Figure Seven i Eight. Zawierają histogram obszarów absolutnych i znormalizowanych dla każdego pasa, pogrupowany odpowiednio według pasa i obszaru.

Przedstawiony tutaj protokół ustanawia ustandaryzowany i powtarzalny sposób pracy izolowania i charakteryzowania korona białkowej utworzonej na nanocząstkach po inkubacji z osoczem. Ta metoda daje wysoce spójne profile stron SDS, które pozwalają uchwycić biologicznie istotne i diagnostycznie istotne cechy każdej spersonalizowanej korony. Profile stron SDS uzyskane we wszystkich schorzeniach były wysoce powtarzalne.

Zwiększone stężenia w osoczu z 5% do 50% skutkowały silniejszymi natężeniami sygnału w obszarze 30–80 kilodalton profili stron SDS. Zautomatyzowany proces pipetowania dał niemal identyczne profile elektroforetyczne. Tlenek grafenu konsekwentnie generował dobrze rozdzielone stabilne profile korony, co wynika z jego dużej powierzchni i właściwości naładowanych.

Rozkłady wielkości małych, średnich i dużych próbek tlenku grafenu były wąskie, nienakładające się i skupiały się odpowiednio na 100, 300 i 750 nanometrach. Profile stron SDS białka Coronas utworzone na tlenku grafenu były podobne w różnych rozmiarach. Chociaż zaobserwowano wyraźne różnice między różnymi rozcieńczeniami, niższe stężenia w osoczu powodowały bardziej intensywne pasma w określonych zakresach mas cząsteczkowych, co wskazuje na selektywne wzbogacenie białek.

Podczas pośrednich rozcieńczeń osocza profile metryki gęstości wykazały różnice specyficzne dla choroby, zwłaszcza w rejonie 20 do 30 kilodaltonów, gdzie próbki PDAC wykazywały niższą intensywność sygnału. Sam model profilowania SDS oparty na stronach prawidłowo zidentyfikował zarówno próbki PDAC, jak i kontrolne z dokładnością 83% oraz zrównoważoną czułością i specyficznością. Połączony model diagnostyczny obejmujący profile korony strony SDS oraz CA 19 do dziewięciu poziomów osiąga najwyższą dokładność, czułość i swoistość w klasyfikacji pacjentów z PDAC.

Korzystamy z zautomatyzowanych procesów pracy, technik nieopartych na technologii oraz narzędzi opartych na AI, aby rozwijać badania diagnostyczne nad nowotworami. Nasz protokół jest szybki, przyjazny dla użytkownika, zgodny z WHO, zapewniając standaryzowane, powtarzalne odciski palców białka korona o silnym znaczeniu diagnostycznym.