Name: Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół SDS-PAGE do profilowania korony białkowej nanocząstek w diagnostyce raka trzustki. Metoda oferuje odtwarzalne, niskokosztowe i zgodne z kryteriami REASSURED narzędzie do wczesnego wykrywania nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były częściowo finansowane przez MUR, Krajowy Plan Inwestycji Uzupełniających do NRRP, finansowany przez Unię Europejską-NextGenerationEU, projekt "D3 4 HEALTH-Digital Driven Diagnostics, prognostics and thepharmacoutics for sustainable healthcare health". PNC0000001, Spoke 3 Linea tematica 2, missione 4, componente 2 CUP: B53C22006120001. Prace te były również wspierane przez Fundację AIRC w ramach projektu IG 2020-ID. 24521, P.I. Pozzi Daniela.

Protokół ten zapewnia szczegółowy i ustandaryzowany workflow przygotowania, inkubacji z ludzkim osoczem (HP), izolacji oraz analizy PC utworzonego na różnych typach NP. Rysunek 2 przedstawia graficzny obraz całego protokołu, przedstawiający kolejne kroki eksperymentalne od syntezy NP do wielowariantowej analizy SDS-PAGE profili białek. Co ważne, metodologia została ustandaryzowana przez naszą grupę, co pokazano w poprzednich pracach18,26, zapewniając powtarzalność i wiarygodność wyników. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie i charakterystyka NP
<ol>
	<li>GO nanoarkusze<ol>
		<li>Rozcieńcz roztwór buljowy 4 mg/mL w wodzie ultraczystej do pożądanego stężenia. Sonikować przez 2 minuty z amplitudą 28% (puls: 0,8/0,6 s), aby zapewnić prawidłową dyspersję.</li>
		<li>Ilościowe stężenie za pomocą spektroskopii UV-Vis</li>
		<li>Zmierz rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) za pomocą lasera He-Ne o średnicy 633 nm. Przygotowuj próbki przez rozcieńczenie w ultraczystej wodzie zgodnie z limitami wykrywania cuwette (np. rozcieńczenie 1:100 dla 1 mL cuwettes). Zapisz średnią ± odchylenia standardowego (SD) z trzech replikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złote NP<ol>
		<li>Stosuj cytrynianowo stabilizowane 100 nm NP złota (stężenie z magazynu: 3,8E+9 cząstek/mL) bez dalszych modyfikacji.</li>
		<li>Zmierz rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) za pomocą lasera He-Ne o średnicy 633 nm. Przygotowuj próbki przez rozcieńczenie w ultraczystej wodzie zgodnie z limitami wykrywania cuwette (np. rozcieńczenie 1:100 dla 1 mL cuwettes). Rekord ± SD z trzech replik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liposomy DOTAP<ol>
		<li>Rozpuszczać proszek 1,2-dioleoyl-3-trimetyloammonium-propan (DOTAP) w chloroformie wewnątrz certyfikowanego chemicznego okapu wyparowego, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, gogle). Odparuj pod próżnią przez 2 godziny, ponownie zawiesij warstwę lipidową z ultraczystą wodą, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/mL, i nawadnij przez noc w temperaturze 4 °C. Na koniec wytłaczaj roztwór liposomu 20 razy przez filtr poliwęglanowy o pojemności 0,1 μm.</li>
		<li>Zmierz rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) za pomocą lasera He-Ne o średnicy 633 nm. Przygotowuj próbki przez rozcieńczenie w ultraczystej wodzie zgodnie z limitami wykrywania cuwette (np. rozcieńczenie 1:100 dla 1 mL cuwettes). Rekord ± SD z trzech replik. UWAGA: Obchodz się chloroformem w okapie z pełnym wyposażeniem ochrony osobistej. Utylizacja organicznych odpadów rozpuszczalników zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa chemicznego. UWAGA: Dla GO z rozkładem wielkości około 300 nm, sonitraktowanie przez 10 minut przy 125 W, wirówka 7 700 x g przez 30 minut w 4 °C, zebranie supernatantu, ponowne wirowanie przy 18 620 x g przez 30 minut i ponowna zawiesina granulek. Dla GO z rozkładem wielkości około 100 nm, sonikować 3 × 180 minut w 4 °C, wirować w 10 000 x g przez 30 minut, po każdej rundzie w 4 °C, i pobrać ostatni supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkiej plazmy
<ol>
	<li>Komercyjna plazma ludzka (HP)<ol>
		<li>Rozcieńczaj komercyjną liofilizowaną plazmę ultraczystą wodą w razie potrzeby.</li>
		<li>Wiruj zrekonstytuowane osocze w 18620 x g przez 15 minut w 4 °C, zbieraj supernatant i przechowuj w temperaturze -80 °C do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pacjent wywodzony z HP<ol>
		<li>Pobierać próbki krwi w wirówce w stężeniu 1216 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i pobierać supernatant do rozdzielania osocza.</li>
		<li>Zawiera próbki osocza 450 μL w probówkach o niskim wiązaniu białka o pojemności 0,5 mL i przechowywa w temperaturze -80 °C do czasu użycia. UWAGA: Wszystkie próbki osocza ludzkiego są pobierane zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucji, a świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich uczestników. UWAGA: Ludzkie osocze jest niebezpieczne biologicznie. Obchodzić się wewnątrz szafki zabezpieczeń biologicznych (BSC) za pomocą rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Utylizacja wszystkich materiałów zawierających plazmę zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa i utylizacji odpadów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Powstanie PC
<ol>
	<li>Ręczna obsługa cieczy<ol>
		<li>Określ optymalny stosunek NP:osocza poprzez ilościowe określenie stężenia białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA), aby dostosować rozcieńczenie osocza.</li>
		<li>Dodaj 100 μL zawiesiny NP do 100 μL plazmy, aby osiągnąć pożądane stężenia w osoczu.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. UWAGA: W badaniu BCA wymieszaj odczynniki A i B (50:1), przygotuj standardowe rozcieńczenia BSA, dodaj 10-25 μL próbki/standardowego + 200 μL odczynnika, inkubuj 30 minut w 37 °C i mierz absorpcję w 562 nm. Stężenia w osoczu są zazwyczaj dostosowywane między 0,5% a 50% v/v w zależności od objętości NP, w zależności od typu NP. Dla GO stosuj niższe stężenia (od 0,5% do 5% zalecane); dla DOTAP/GOLD NP stosuj wyższe stężenia (do 50%). Używaj białkowych rurek o niskim wiązaniu 1,5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Automatyczny protokół inkubacji<ol>
		<li>Załaduj protokół oprogramowania do obsługi cieczy na zautomatyzowaną platformę pipetowania (głowice 20 μL + 200 μL)</li>
		<li>Podawaj 100 μL każdego typu NP do niskowiązanych probówek o pojemności 1,5 mL.</li>
		<li>Dodaj zrekonstytuowane osocze przygotowane zgodnie z wersjami 2.1 i 2.2, zgodnie z następującym wzorem: gdzie VNP to objętość zawieszenia NP. Dla 100 μL NP: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/69090/69090eq1.jpg" /> 5%: 5,3 μL HP 20%: 25 μL HP 50%: 100 μL HP</li>
		<li>Dodaj wodę ultraczystą, aby osiągnąć 200 μL: 5%: 94,7 μL 20%: 75 μL 50%: brak</li>
		<li>Próbki mieszania: 5%: cykle 15 μL 20%: cykle 50 μL 50%: cykle 100 μL 3.2.6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę UWAGA: Dodatkowy Rysunek 1 ilustruje graficzny interfejs automatycznego zestawu używanego do przygotowania mieszanin NP-HP przy trzech końcowych stężeniach w osoczu (5%, 20% i 50% v/v), każde w trzech egzemplarzach. Układ pokładu obejmuje stojaki na wysypy, zbiornik na odpady oraz rurowy stojak 3× 4 niskowiązające, zawierający zawiesiny NP (GO, złote nanosfery i liposomy DOTAP) (NP), HP oraz wodę ultraczystą (H2O). Używaj rurek o niskim wiązaniu białkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza PC według SDS-PAGE
<ol>
	<li>Izolacja PC<ol>
		<li>Wirówka próbek NP-HP w stężeniu 18 620 x g, 4 °C, przez 15 minut. Na dnie rurki powinien znajdować się widoczny opel. Ostrożnie odrzuć supernatant, który powinien wyglądać na przezroczysty przed dalszym krokiem (patrz Rysunek Uzupełniający 2).</li>
		<li>Przemyj pellet wodą ultraczystą 200 μL, ponownie zawiesij i ponownie wiruję. Powtórz ten krok dwa razy. Po końcowym płukaniu powinien być widoczny zwarty pellet, potwierdzający skuteczną izolację kompleksów NP-białkowych (patrz Rysunek Uzupełniający 2).</li>
		<li>Przygotuj bufor obciążenia (LB):</li>
		<li>Oblicz całkowitą objętość LB na podstawie warunków plazmy i środka redukującego mieszankę (1:10), białek denaturujących próbek SDS (1:2) oraz wody.</li>
		<li>Ponownie zawiesij pellet w odpowiedniej objętości 1x LB i gotuj w 100 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Wirówka w 18 620 x g, 4 °C, przez 15 minut. Zbierz supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE ładowanie próbek<ol>
		<li>Przygotuj drabinę, rozcieńczając standard masy molowej (MW) za pomocą bufora obciążenia.</li>
		<li>Rozcieńcz 10x Tris/glycine/SDS uruchamia bufor do 1x.</li>
		<li>Złóż komorę elektroforezy z żelem gradientowym wolnym od barwienia 4%-20% i dodaj bufor do osiągnięcia zalecanego przez producenta poziomu.</li>
		<li>Do każdego odwiertu załaduj próbki 10 μL i 7 μL ladder. Uruchom żel na 150 V przez ~90 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Objętość LB powinna być obliczana na podstawie wybranego stężenia w osoczu w 3.1.1, aby zapewnić optymalną wizualizację białek w obrazie żelu (zazwyczaj 10 μg białek w 20 μL LB). UWAGA: Dla optymalnej powtarzalności przeprowadź analizę SDS-PAGE na świeżo przygotowanych próbkach NP-plazmy. Przechowywanie wypłukanych pelletów w temperaturze -80 °C przez 24 godziny skutkowało wykrywalnymi zmianami zarówno właściwości fizykochemicznych (po ponownej zawieszeniu i pomiarach potencjału DLS/zeta), jak i odcisków palców korona białek (gdy granulki były przetwarzane od etapu 4.3.1 protokołu; patrz Rysunek Uzupełniający 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza wzorców białek
<ol>
	<li>Przetwarzanie obrazu<ol>
		<li>Żele obrazowe za pomocą obrazowania chemiluminescencji.</li>
		<li>Przetwarzaj obraz żelowy w następujący sposób:<ol>
			<li>Importuj obraz żelowy i zapisz go jako plik TIFF, poprawiając go pod kątem niepożądanych efektów, np. zniekształceń ukośnych pasów, które szczególnie wpływają na pasy peryferyjne. Wykryj wszystkie tory żelowe. Odejmij sygnał tła od obrazu.</li>
			<li>Skalibruj pionowe przemieszczenia poprzez przeliczanie jednostek pikseli na jednostki masy cząsteczkowej, na podstawie podwójnego wykładniczego dopasowania ścieżki markera. Generuj graficzne wyjścia do wizualizacji profili intensywności i rozkładów sygnałów specyficznych dla poszczególnych pasów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Eksportuj przetworzone dane, czyli obliczone profile jednowymiarowe.</li>
		<li>Oblicz rozkłady masy cząsteczkowej poprzez normalizację profili i oblicz całkowite obszary w pożądanych zakresach MW dla każdego tora.</li>
		<li>Eksportuj dane wyjściowe, czyli całkowite obszary w określonych zakresach mas cząsteczkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wielozmienna do diagnostyki<ol>
		<li>Stosuj liniową analizę dyskryminacyjną (LDA) lub inne metody wielowymiarowe do analizy klasyfikacyjnej.</li>
		<li>Oblicz dokładność, czułość, swoistość i przeprowadź analizę ROC. UWAGA: Stosowane skrypty do przetwarzania obrazu, normalizacji profilu, dopasowywania i klasyfikacji są dostępne w27, gdzie dostępny jest również odpowiedni podręcznik użytkownika. UWAGA: Przestrzegaj protokołów bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z ludzkim osoczem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cai, R., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crown+and+the+scepter%3A+Roles+of+the+protein+corona+in+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">The crown and the scepter: Roles of the protein corona in nanomedicine.</a> Adv Mater. 31 (45), 1805740(2019).</li>
<li>Caputo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+oncology%3A+A+perspective+on+the+role+of+the+personalized+nanoparticle-protein+corona+in+the+development+of+technologies+for+pancreatic+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets oncology: A perspective on the role of the personalized nanoparticle-protein corona in the development of technologies for pancreatic cancer detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10591(2022).</li>
<li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles%3A+A+test+study%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The evolution of the protein corona around nanoparticles: A test study.</a> ACS Nano. 5 (9), 7503-7509 (2011).</li>
<li>Hajipour, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+protein+coronas%3A+A+%26%2334%3Bkey%26%2334%3B+factor+at+the+nanobiointerface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Personalized protein coronas: A &#34;key&#34; factor at the nanobiointerface.</a> Biomater Sci. 2 (9), 1210-1221 (2014).</li>
<li>Quagliarini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona-enabled+serological+tests+for+early-stage+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Int%22%5BJournal%5D)">Protein corona-enabled serological tests for early-stage cancer detection.</a> Sens Int. 1, 100025(2020).</li>
<li>Caracciolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+charge+of+nanoparticles+following+incubation+with+human+plasma+of+healthy+and+pancreatic+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Size and charge of nanoparticles following incubation with human plasma of healthy and pancreatic cancer patients.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 123, 673-678 (2014).</li>
<li>Barrán-Berdón, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+evolution+of+nanoparticle-protein+corona+in+human+plasma%3A+Relevance+for+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: Relevance for targeted drug delivery.</a> Langmuir. 29 (21), 6485-6494 (2013).</li>
<li>Yu, Y., Luan, Y., Dai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+process%2C+mechanisms%2C+influencing+factors%2C+and+study+methods+of+protein+corona+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Dynamic process, mechanisms, influencing factors, and study methods of protein corona formation.</a> Int J Biol Macromol. 205, 731-739 (2022).</li>
<li>Hadjidemetriou, M., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+nanoparticle+corona%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolution of the nanoparticle corona.</a> Nat Nanotechnol. 12 (4), 288-290 (2017).</li>
<li>Caputo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+corona-enabled+blood+test+for+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">A protein corona-enabled blood test for early cancer detection.</a> Nanoscale. 9 (1), 349-354 (2017).</li>
<li>Pozzi, D., Caracciolo, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPozzi%2C+D+%22Exploiting+differences+in+personal+nanoparticle+corona+profiles+for+cancer+diagnostics%22">Exploiting differences in personal nanoparticle corona profiles for cancer diagnostics</a>. , Taylor & Francis. 431-433 (2025).</li>
<li>Vence, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+the+personalized%2C+disease-specific+protein+corona+on+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of the personalized, disease-specific protein corona on nanoparticles.</a> Clin Chim Acta. 501, 102-111 (2020).</li>
<li>Di Domenico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-biomolecular+corona%3A+A+new+approach+for+the+early+detection+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-biomolecular corona: A new approach for the early detection of non-small-cell lung cancer.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 9378-9386 (2019).</li>
<li>Papi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+nanoparticle-protein+interactions+for+early+disease+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Exploitation of nanoparticle-protein interactions for early disease detection.</a> Appl Phys Lett. 114 (16), 163702(2019).</li>
<li>Di Santo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona+profile+of+graphene+oxide+allows+detection+of+glioblastoma+multiforme+using+a+simple+one-dimensional+gel+electrophoresis+technique%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein corona profile of graphene oxide allows detection of glioblastoma multiforme using a simple one-dimensional gel electrophoresis technique: A proof-of-concept study.</a> Biomater Sci. 9 (13), 4671-4678 (2021).</li>
<li>Caputo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+analysis+of+protein+corona+and+haemoglobin+levels+detects+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Synergistic analysis of protein corona and haemoglobin levels detects pancreatic cancer.</a> Cancers. 13 (1), 93(2020).</li>
<li>Colapicchioni, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+liposome-protein+corona+in+the+blood+of+breast%2C+gastric+and+pancreatic+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Personalized liposome-protein corona in the blood of breast, gastric and pancreatic cancer patients.</a> Int J Biochem Cell Biol. 75, 180-187 (2016).</li>
<li>Di Santo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+graphene+oxide-protein+corona+in+the+human+plasma+of+pancreatic+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Personalized graphene oxide-protein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 491(2020).</li>
<li>Digiacomo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+pancreatic+cancer+detection+through+personalized+protein+corona+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Efficient pancreatic cancer detection through personalized protein corona of gold nanoparticles.</a> Biointerphases. 16 (1), 011010(2021).</li>
<li>Caputo, D., Caracciolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-enabled+blood+tests+for+early+detection+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Lett. 470, 191-196 (2020).</li>
<li>Caracciolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+molecular+diagnostic+research+in+cancer+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Challenges in molecular diagnostic research in cancer nanotechnology.</a> Nano Today. 27, 6-10 (2019).</li>
<li>Ashkarran, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+heterogeneity+in+proteomics+analysis+of+the+nanoparticle+protein+corona+across+core+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Measurements of heterogeneity in proteomics analysis of the nanoparticle protein corona across core facilities.</a> Nat Commun. 13 (1), 6610(2022).</li>
<li>Pederzoli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona+and+nanoparticles%3A+How+can+we+investigate+on%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Nanomed+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein corona and nanoparticles: How can we investigate on.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 9 (6), e1467(2017).</li>
<li>Otoo, J. A., Schlappi, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REASSURED+multiplex+diagnostics%3A+A+critical+review+and+forecast%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">REASSURED multiplex diagnostics: A critical review and forecast.</a> Biosensors. 12 (2), 124(2022).</li>
<li>Papi, M., Caracciolo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis+of+personalized+biomolecular+corona+data+for+early+disease+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis of personalized biomolecular corona data for early disease detection.</a> Nano Today. 21, 14-17 (2018).</li>
<li>Giulimondi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+biomolecular+corona+experiments%3A+A+primer+for+reliable+results%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Part+Syst+Charact%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of biomolecular corona experiments: A primer for reliable results.</a> Part Part Syst Charact. 40 (2), 2200169(2023).</li>
<li>Renzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structuring+lipid+nanoparticles%2C+DNA%2C+and+protein+corona+into+stealth+bionanoarchitectures+for+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structuring lipid nanoparticles, DNA, and protein corona into stealth bionanoarchitectures for in vivo gene delivery.</a> Nat Commun. 15 (1), 9119(2024).</li>
<li>Van Dorpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+automated+liquid+handling+in+the+separation+workflow+of+extracellular+vesicles+enhances+specificity+and+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating automated liquid handling in the separation workflow of extracellular vesicles enhances specificity and reproducibility.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 157(2023).</li>
<li>Quagliarini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+protein+corona+on+graphene+oxide%3A+Implications+for+biomedical+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The influence of protein corona on graphene oxide: Implications for biomedical theranostics.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 267(2023).</li>
<li>Jiříčková, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+applications+of+graphene+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and applications of graphene oxide.</a> Materials. 15 (3), 920(2022).</li>
<li>Saorin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redefined+protocol+for+protein+corona+analysis+on+graphene+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanosci+Au%22%5BJournal%5D)">A redefined protocol for protein corona analysis on graphene oxide.</a> ACS Nanosci Au. , (2025).</li>
<li>Digiacomo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-protein+corona+enhances+accuracy+of+Ca-19.9-based+pancreatic+cancer+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-protein corona enhances accuracy of Ca-19.9-based pancreatic cancer classification.</a> Nanoscale. 17 (12), 7066-7075 (2025).</li>
<li>Caputo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+accuracy+of+pancreatic+cancer+clinical+staging+by+exploitation+of+nanoparticle-blood+interactions%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Improving the accuracy of pancreatic cancer clinical staging by exploitation of nanoparticle-blood interactions: A pilot study.</a> Pancreatology. 18 (6), 661-665 (2018).</li>
<li>Quagliarini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+the+liposome-protein+corona%3A+Lessons+learned+and+future+breakthroughs+in+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics.</a> Nano Today. 47, 101657(2022).</li>
<li>Wu, S. Y., An, S. S. A., Hulme, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+graphene+oxide+in+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Current applications of graphene oxide in nanomedicine.</a> Int J Nanomedicine. 10 Suppl 1, 9-24 (2015).</li>
<li>Caputo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+detection+of+pancreatic+cancer+by+combining+a+nanoparticle-enabled+blood+test+and+plasma+levels+of+acute-phase+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Multiplexed detection of pancreatic cancer by combining a nanoparticle-enabled blood test and plasma levels of acute-phase proteins.</a> Cancers. 14 (19), 4658(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Wszechstronność i powtarzalność metody w różnych typach NP
Przedstawiony tutaj protokół zapewnia ustandaryzowany i powtarzalny workflow izolujący i charakteryzujący PC utworzony na NP podczas inkubacji z HP. Jak wykazano w poprzednich i obecnych badaniach33, metoda ta umożliwia generowanie molekularnych odcisków palców opartych na SDS-PAGE, które rejestrują biologicznie i diagnostycznie istotne cechy spersonalizowanego komputera. Zaobserwowana spójność ...

Korona białka nanocząsteczkowego (NP-PC)
Charakterystyka PC, która tworzy się na powierzchni NP po ekspozycji na płyny biologiczne, stała się potężną strategią diagnostyki chorób i medycyny spersonalizowanej1. Ta warstwa adsorbowanych białek, dynamiczna i specyficzna dla choroby, przekształca syntetyczną tożsamość NP i napędza ich biologiczne interakcje2. Skład PC nie jest losowy, lecz silnie zależy zarówno od właściwości fizykochemicznych NP, jak i od środowiska biologicznego, w którym są wprowadzane3. Czynniki takie jak rozmiar, kształt, ładunek powierzchniowy i skład NP mogą znacząco wpływać na powinowactwo, kinetykę i układ strukturalny adsorbowanych białek. Podobnie płyn biologiczny, jego źródło, złożoność i stan choroby odgrywają kluczową rolę w określaniu ostatecznego składu korony 4,5,6.
Dynamiczny charakter korony dodatkowo komplikuje analizę, ponieważ jej struktura ewoluuje z czasem od miękkiej, luźno związanej warstwy zewnętrznej do bardziej stabilnego i ściśle adsorbowanego wewnętrznego rdzenia 7,8. Ta ewoluująca architektura, wynikająca z konkurencyjnych zdarzeń adsorpcji białek, wymaga podejścia rozdzielonych w czasie i standaryzowanych metod, aby być istotnie scharakteryzowana9. Pomimo tej złożoności, obecnie powszechnie uznaje się, że PC nie jest jedynie artefaktem, lecz biologicznie informacyjną warstwą zdolną uchwycić zmiany chorobowe w sposób nieinwazyjny. Celem opisanej w tym artykule jest standaryzacja użycia SDS-PAGE do solidnego, powtarzalnego i dostępnego profilowania spersonalizowanego komputera, szczególnie dla wczesnego wykrywania nowotworów za pomocą biopsji płynnej10.
Spersonalizowany komputer i jego znaczenie w wykrywaniu raka
Naukowa podstawa tej metody leży w koncepcji spersonalizowanego komputera. Podczas inkubacji z osoczem pacjenta, NP adsorbują unikalny odcisk białka, który odzwierciedla stan fizjologiczny lub patologiczny danej osoby11,12. Koncepcja ta została potwierdzona badaniami wykazującymi istotne zmiany w składzie PC w obecności chorób, w tym gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC), raka płuc13, opony14 oraz glejaka wieloformowego15. Konkretnie, w PDAC PC pochodzące z osocza pacjenta znacznie różnią się od tych zdrowych dawców. Te różnice zostały wykorzystane w modelach klasyfikatorów, które osiągają do 90% dokładności diagnostycznej. PC służy więc jako nanoskalowy koncentrator sygnałów specyficznych dla choroby16.
Najnowsze badania wykazały, że PCs pacjentów onkologicznych są wzbogacone w białka zaangażowane w stan zapalny, krzepnięcie, aktywację dopełnienia oraz transport pęcherzyków zewnętrznych, czyli szlaki biologiczne znane z zaburzenia regulacji w nowotworze17. Te wzorce białkowe są wysoce powtarzalne w poszczególnych klasach pacjentów, a jednocześnie wyraźnie różnią się między różnymi stanami chorobowymi, co sugeruje, że korona może pełnić funkcję nie tylko ogólnego czujnika choroby, ale także klasyfikatora specyficznego dla choroby. W kontekście PDAC, jednego z najgroźniejszych i najbardziej podstępnych nowotworów, nasz zespół był pionierem testów krwi NP-enabled (NEB) opartych na charakteryzacji PC18, 19, 20. To minimalnie inwazyjne podejście wykorzystuje zdolność NP do selektywnego wzbogacania białek osocza o niskiej ilości i zmienionych chorobą, czyniąc je wykrywalnymi za pomocą prostej, laboratoryjnej separacji elektroforetycznej.
Zalety w porównaniu z konwencjonalnymi technikami proteomicznymi
Uzasadnienie opracowania tego podejścia wynika z ograniczeń konwencjonalnych technik proteomicznych, takich jak spektrometria mas (MS), które choć oferują głębokie pokrycie proteomem, są kosztowne, czasochłonne i nieodpowiednie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych lub diagnostyki w miejscu opieki21. Kolejnym kluczowym wyzwaniem jest złożoność MS, gdzie różnice w przygotowaniu próbki, kalibracji instrumentów, parametrach akwizycji i przepływach pracy danych przyczyniają się do istotnych różnic między laboratoriami w raportowanym składzie PC22. Natomiast analiza SDS-PAGE PC oferuje szybki i opłacalny sposób na wychwycenie wzorców proteomicznych związanych z chorobą. Co istotne, odczyt SDS-PAGE nie opiera się na absolutnej identyfikacji poszczególnych biomarkerów, lecz na wykrywaniu systematycznych zmian w globalnym profilu białka, które można analizować za pomocą densytometrii i statystyk wielowariantowych.
W przeciwieństwie do testów opartych na przeciwciałach, które są ograniczone do znanych celów i podatne na reakcje krzyżowe, SDS-PAGE oferuje obiektywny obraz krajobrazu białek, zachowując integralność oryginalnej próbki i umożliwiając dalszą integrację z komplementarnymi platformami, takimi jak LC-MS/MS, do identyfikacji białek. Ponadto, ponieważ SDS-PAGE nie wymaga frakcjonowania próbek ani etapów redukcji wyczerpania próbek, jest szczególnie odpowiedni do analizy próbek biologicznych o niskiej objętości, co jest kluczową cechą w zastosowaniach związanych z wczesną diagnozą lub przesiewem populacji delikatnych23. Z tych wszystkich powodów protokół ten jest zgodny z kilkoma kryteriami REASSURED WHO (łączność w czasie rzeczywistym, łatwość pobrania próbek, przystępność cenową, wrażliwość, specyficzność, przyjazność dla użytkownika, solidność, brak sprzętu oraz dostarczalność), co czyni go praktycznym narzędziem do skalowalnej diagnostyki24. Na podstawie tych dowodów założono hipotezę, że NP inkubowane z osociem pacjenta adsorbują powtarzalny, specyficzny dla choroby PC, który można systematycznie profilować za pomocą SDS-PAGE. Proponujemy również, że standaryzowana analiza elektroforetyczna tych spersonalizowanych koron może odróżnić pacjentów onkologicznych od zdrowych, zapewniając tym samym solidne i klinicznie przekładalne narzędzie diagnostyczne.
Przepływ pracy i zastosowanie kliniczne
Protokół profilowania korony oparty na SDS-PAGE systematyzuje każdy etap: od przygotowania NP i inkubacji z rozcieńczonym osoczem, przez izolację korony, elektroforezę żelową aż po ilościową analizę densytometryczną (Rysunek 1). Kluczowe parametry, takie jak czas inkubacji, rozcieńczenie osocza i typ NP25 , są precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić optymalne wychwytywanie białek i rozdzielczość obrazu żelowego. Protokół uwzględnia również praktyczne kwestie, takie jak przepustowość próbek, stabilność pamięci oraz spójność między partiami26. Ponadto, ponieważ jest to technika nieniszcząca, SDS-PAGE można płynnie łączyć z komplementarnymi podejściami proteomicznymi, takimi jak MS, aby zidentyfikować skład molekularny poszczególnych pasm białkowych15. Workflow został zoptymalizowany pod kątem wysokiej powtarzalności między operatorami, w tym kompatybilności z ręcznymi i zautomatyzowanymi platformami pipetowania, a także jest odporny na różne chemie NP i stężenia plazmy. Te cechy gwarantują, że metoda może być stosowana w różnych środowiskach laboratoryjnych, dzięki czemu nadaje się zarówno do scentralizowanych centrów diagnostycznych, jak i zdecentralizowanych laboratoriów badawczych. Dlatego ta technika jest szczególnie dobrze dopasowana do badaczy i klinicystów zaangażowanych w wczesną diagnostykę, odkrywanie biomarkerów oraz nanomedycynę translacyjną. Jest stosowalny do szerokiego zakresu patologii i przystosowujący się do różnorodnych płynów biologicznych poza osoczem, w tym śliny czy moczu. Elastyczność i odporność tego protokołu czynią go silnym kandydatem do integracji z pipeline'ami walidacji klinicznej, szeroko zakrojonymi badaniami przesiewowymi oraz platformami punktu opieki zdrowotnej.

<table><tbody><tr><td>1,5ML białkowa rurka LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/glycine/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Labortechnik</td><td>Z 216 MK Hermle</td><td>Używany przy 18 620 RCF przez 20 minut przy 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>System obrazowania ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>12003153</td><td>Wykorzystywane do akwizycji obrazu żelowego</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td>Rozpuszczalnik dla DOTAP</td></tr><tr><td>Corning 1-200 & micro; L Universal Fit Bulk Packed Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4845</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele Criterion TGX bez barw</td><td>Biorad</td><td>5678095</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana 6 x 1L</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetyloammon-propan)</td><td>Awantyczne lipidy polarne</td><td>890890P-200mg</td><td>Wykorzystywane do przygotowywania liposomów kationowych; rozpuszczony w chloroformie, odparowany, nawodniony i wytłaczony</td></tr><tr><td>Zasilacz Enduro 300V&nbsp;</td><td>Labnet &nbsp;</td><td>E0303-230V</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt GloMax Discover</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki złota (stabilizowane cytrynianem)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>742031-25ML</td><td>Wykorzystywane jako nanomateriał; Używane bez dalszego oczyszczania</td></tr><tr><td>Żel gradientowy poliakrylamidowy (4&ndash; 20% TGX)</td><td>Bio-Rad</td><td>5678095</td><td>Używane do SDS&ndash; PAGE</td></tr><tr><td>Grant Instrument&nbsp; Termowstrząs HC24N (24 mikrorurki o pojemności 1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PHMT-PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tlenku grafenu (GO)</td><td>Graphenea</td><td>GO-4-1000</td><td>Wykorzystywane jako nanomateriał; rozcieńczony do 0,25 mg/mL i poddany sonikacji</td></tr><tr><td>Ludzka Plazma (HP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9523-5ML</td><td>Wykorzystywane do inkubacji nanocząstek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageLab</td><td>Bio-Rad. Wersja 6.1.0.07</td><td>/</td><td>Używane do eksportu obrazów żelowych jako plików tiff</td></tr><tr><td>Laemmli bufor ładowania 2x</td><td>Biorad</td><td>1610737</td><td>Używany do ponownego zawieszenia pelletów</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks. Wersja R2022a</td><td>/</td><td>Wykorzystywane do przetwarzania obrazów, analizy danych i obliczania profili</td></tr><tr><td>Mini-Ekstruder</td><td>Awantyczne lipidy polarne</td><td>610020</td><td>Wykorzystywany do przygotowania liposomów</td></tr><tr><td>NuPAGE Preparat Redukujący Próbki (10X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP004</td><td></td></tr><tr><td>Bufor soli fosforanowej</td><td>Corning &nbsp;</td><td>21-031 cm</td><td>Wykorzystywane do próbek DOTAP-HP</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Astest Kit, 1 zestaw (1 L)</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki pipet 0,5-10 ul przezroczyste</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN L P10L, 0,5-10 & mikro; L, metalowy wyrzutnik</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN P20, 2-20 & mikro; L, metalowy wyrzutnik</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN P200, 20-200 &; L, metalowy wyrzutnik</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system pipetmaxu pipetmaxa</td><td>Gilson</td><td>GSYS0021</td><td>Wykorzystywane do automatycznego przetwarzania próbek</td></tr><tr><td>Filtr poliwęglanowy (0,1 & mikro; m)</td><td>Awantyczne lipidy polarne</td><td>610005-1EA</td><td>Wykorzystywane do wytłaczania liposomów</td></tr><tr><td>Standardy białka Precision Plus Protein All Blue Prestained</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Standardy Precision Plus Protein Niebarwione&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>1610363EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator z komórkami wibricznymi VC505</td><td>Sonics and Materials inc.</td><td>VC505</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern</td><td>ZS90</td><td>Wykorzystywany do pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i mikroelektroforezy (ME)</td></tr></tbody></table>

standaryzowany przepływ sds-page do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Standardized SDS-PAGE Workflow for Personalized Protein Corona Profiling in Early Cancer Detection

Tworzenie spersonalizowanej korony białkowej (PC) na nanocząstkach (NP) po ekspozycji na płyny biologiczne stało się obiecującą, minimalnie inwazyjną strategią wczesnego wykrywania nowotworów. Niniejsze badanie wprowadza standaryzowany protokół profilowania korony białkowej z użyciem elektroforezy z poliakrylamidowym siarczanem sodu (SDS-PAGE), zoptymalizowany w celu zapewnienia odporności, powtarzalności i automatyzacji. Metoda została rygorystycznie zweryfikowana na różnych platformach nanocząstek (NP), źródłach plazmy oraz warunkach eksperymentalnych, wykazując konsekwentnie powtarzalne profile z minimalną zmiennością zależną od operatora. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami proteomiki, to podejście oferuje szybsze, bardziej opłacalne rozwiązanie, spełniające kryteria diagnostyki REASSURED Światowej Organizacji Zdrowia. W przypadku gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC), wysoce agresywnego nowotworu o ograniczonych wczesnych biomarkerach, ten proces osiągał dokładność klasyfikacji sięgającą nawet 90%, nawet u pacjentów we wczesnym stadium. Ta standaryzowana platforma oznacza znaczący postęp w kierunku skalowalnych, klinicznie tłumaczalnych i przystępnych cenowo narzędzi diagnostycznych w badaniach przesiewowych raka.

Jednym z głównych wyzwań standaryzacji eksperymentów PC jest minimalizowanie zmienności technicznej i zależnej od operatora, co wcześniej podkreślono w tym badaniu26. Wciąż pozostają otwarte pytania dotyczące wpływu zmiennych eksperymentalnych, takich jak błąd operatora oraz wpływ narzędzi automatycznych na powtarzalność18,28.
Po pierwsze, badanie...

Protokół ten standaryzuje analizę SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania korona białek na nanocząstkach, umożliwiając powtarzalne, skalowalne i niskokosztowe wykrywanie sygnatur specyficznych dla raka. Zaprojektowany do wczesnej diagnozy gruczolakoraka przewodowego trzustki, oferuje praktyczną, PEWNĄ alternatywę dla złożonych metod proteomicznych zarówno w badaniach, jak i klinicznych.

Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

The formation of a personalized protein corona (PC) on nanoparticles (NPs) upon exposure to biological fluids has emerged as a promising, minimally ...

Badamy, jak nanocząstki oddziałują z krwią, aby ujawnić wczesne objawy nowotworu, dążąc do prostego, powtarzalnego i głównie nieinwazyjnego testu diagnostycznego. Na początek rozcieńcz roztwór bazowy czterech miligramów na mililitr nano-arkuszy tlenku grafenu w ultraczystej wodzie do pożądanego stężenia. Sonikować rozcieńczony roztwór przez dwie minuty z amplitudą 28%, z ustawieniem impulsu na osiem sekund włączonych i sześć sekund wyłączone, aby zapewnić równomierną dyspersję.Ilościowo określ stężenie roztworu rozproszonego za pomocą widzialnej spektroskopii ultrafioletowej. Następnie zmierz rozmiar hydrodynamiczny i potencjał zeta roztworu, używając dynamicznego rozpraszania światła za pomocą 633-nanometrowego lasera helowego neonu. Rozcieńcz próbkę w ultraczystej wodzie zgodnie z limitami detekcji QVet.Następnie rozcieńcz komercyjną liofilizowaną ludzką plazmę ultraczystą wodą w razie potrzeby. Wiruj odtworzoną plazmę w stężeniu 18 620 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz supernatant i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.Teraz ilościowo określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego do korekty rozcieńczenia osocza i określenia optymalnego stosunku nanocząstek do osocza. Wymieszaj wybraną objętość nanocząstek z plazmą, aby uzyskać docelowy stosunek między nimi. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Aby wyizolować koronę białkową, wiruj próbki plazmy nanocząsteczek w temperaturze 18 620 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Opłucz powstały pellet 200 mikrolitrami ultraczystej wody. Następnie ponownie zawiesić i ponownie wirować.Po końcowym płukaniu potwierdz obecność zwartego pelletu jako dowód izolacji kompleksu białek nanocząsteczkowych. Następnie wymieszaj środek redukujący, bufor obciążający i wodę, aby uzyskać obliczoną objętość bufora obciążeniowego. Ponownie zawiesić śrut w przygotowanym buforze ładowania.Następnie gotuj zawiesinę w 100 stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wiruj gotowaną próbkę w temperaturze 18 620 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Zbierz supernatant do nowej rurki.Teraz przygotuj drabinę białkową, rozcieńczając standard masy cząsteczkowej w buforze niebarwionym buforem za pomocą buforu barwionego przez barwy. Rozcieńcz 10 x Tris-Glycine-SDS bufora do stężenia 1 x stężenia. Złóż komorę elektroforezy za pomocą żelu o gradientzie od 4 do 20% barwników.Następnie wlewaj bufor do pracy, aż osiągnie zalecany poziom producenta. Załaduj 10 mikrolitrów próbki do każdego dołku. Następnie pipetuję siedem mikrolitrów drabinki do każdego dołka.Żel uciekaj na 150 woltów przez około 90 minut w temperaturze pokojowej. Zapisz obraz żelowy jako plik tiff w tym samym folderze co skrypty. Potem otwarte wytwórstwo żelowe.m w MATLAB. Wpisz nazwę obrazu żelowego jako nazwę obrazu. Następnie wpisz indeks jednej drabiny jako znacznik indeksowy.Uruchom scenariusz. Zakończenie kroków zostanie pokazane w oknie poleceń, a na ekranie pojawią się cztery okna. Teraz otwórz rysunek pierwszy z oryginalnym obrazkiem żelowym na górze i jego korektą dla efektu skośnego pasa na dole.Zmodyfikuj wartości korekty lewej i prawej, aby dostroić parametry korekcji. Otwórz Figurę Dwa. Zawiera obraz skorygowany pod kątem efektu skośnego pasa u góry oraz zdjęcie usunięte tło na dole.Dostosuj wartość BKG par X w skrypcie, aby dostroić usuwanie tła. Zwróć uwagę, że wszystkie zidentyfikowane pasy są oznaczone pionowymi białymi liniami na Rysunku Drugim. Teraz otwórz Rysunek 3 zawierający profil intensywności pasa markera z wykrytymi szczytami po lewej i nieliniowym dopasowaniem z wartością R kwadratową po prawej.Sprawdź podwójnie, czy liczba oczekiwanych pasm na drabinowym pasie odpowiada liczbie wykrytych szczytów użytych do procedury dopasowania. Następnie otwórz Rysunek Cztery zawierający znormalizowane profile intensywności dla wszystkich wykrytych ścieżek w żelu. Ustaw parametr eksportu na jeden, aby eksportować profile intensywności jako funkcje mas cząsteczkowych w pliku Excel.Uruchom scenariusz. Po zakończeniu wygenerowany jest arkusz Excel w pliku roboczym zawierający profile absolutne i znormalizowane jako funkcje masy cząsteczkowej w pierwszej kolumnie. Następnie otwórz plik gel profiles pro m i uruchom skrypt.Na ekranie pojawią się cztery okna. Otwórz Rysunek Pięć, zawierający bezwzględne profile intensywności u góry oraz odpowiadające im całkowite intensywności na dole dla każdego pasa. I Rysunek Sześć zawierający znormalizowane profile intensywności dla każdego pasa.Oś masy cząsteczkowej podzielona jest według zakresów określonych jako reg w skrypcie. Ustaw dane eksportu na jeden, aby eksportować obszary absolutne i znormalizowane całkowite. Uruchom scenariusz.Po zakończeniu wygenerowany zostanie arkusz kalkulacyjny w roboczym folderze zawierającym eksportowane obszary absolutne i znormalizowane w określonych zakresach masy cząsteczkowej. Na koniec otwarte Figure Seven i Eight. Zawierają histogram obszarów absolutnych i znormalizowanych dla każdego pasa, pogrupowany odpowiednio według pasa i obszaru.Przedstawiony tutaj protokół ustanawia ustandaryzowany i powtarzalny sposób pracy izolowania i charakteryzowania korona białkowej utworzonej na nanocząstkach po inkubacji z osoczem. Ta metoda daje wysoce spójne profile stron SDS, które pozwalają uchwycić biologicznie istotne i diagnostycznie istotne cechy każdej spersonalizowanej korony. Profile stron SDS uzyskane we wszystkich schorzeniach były wysoce powtarzalne.Zwiększone stężenia w osoczu z 5% do 50% skutkowały silniejszymi natężeniami sygnału w obszarze 30–80 kilodalton profili stron SDS. Zautomatyzowany proces pipetowania dał niemal identyczne profile elektroforetyczne. Tlenek grafenu konsekwentnie generował dobrze rozdzielone stabilne profile korony, co wynika z jego dużej powierzchni i właściwości naładowanych.Rozkłady wielkości małych, średnich i dużych próbek tlenku grafenu były wąskie, nienakładające się i skupiały się odpowiednio na 100, 300 i 750 nanometrach. Profile stron SDS białka Coronas utworzone na tlenku grafenu były podobne w różnych rozmiarach. Chociaż zaobserwowano wyraźne różnice między różnymi rozcieńczeniami, niższe stężenia w osoczu powodowały bardziej intensywne pasma w określonych zakresach mas cząsteczkowych, co wskazuje na selektywne wzbogacenie białek.Podczas pośrednich rozcieńczeń osocza profile metryki gęstości wykazały różnice specyficzne dla choroby, zwłaszcza w rejonie 20 do 30 kilodaltonów, gdzie próbki PDAC wykazywały niższą intensywność sygnału. Sam model profilowania SDS oparty na stronach prawidłowo zidentyfikował zarówno próbki PDAC, jak i kontrolne z dokładnością 83% oraz zrównoważoną czułością i specyficznością. Połączony model diagnostyczny obejmujący profile korony strony SDS oraz CA 19 do dziewięciu poziomów osiąga najwyższą dokładność, czułość i swoistość w klasyfikacji pacjentów z PDAC.Korzystamy z zautomatyzowanych procesów pracy, technik nieopartych na technologii oraz narzędzi opartych na AI, aby rozwijać badania diagnostyczne nad nowotworami. Nasz protokół jest szybki, przyjazny dla użytkownika, zgodny z WHO, zapewniając standaryzowane, powtarzalne odciski palców białka korona o silnym znaczeniu diagnostycznym.

standardized-sds-page-workflow-for-personalized-protein-corona

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisaliśmy procedurę dysagregacji raka jelita grubego (CRC) w celu uzyskania żywotnych pojedynczych komórek, które następnie są wychwytywane na dostosowane mikrotablice przeciwciał rozpoznających antygeny powierzchniowe (mikrotablica DotScan CRC). Subpopulacje komórek związanych z mikrotablicą mogą być profilowane za pomocą multipleksowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi.

Profilowanie białek powierzchniowych komórek raka jelita grubego z wykorzystaniem mikrotablicy przeciwciał i multipleksowania fluorescencyjnego

RPPA umożliwia jednoczesne badanie ekspresji białek setek próbek, wydrukowanych na szkiełkach nitrocelulozowych, przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Technika ta została zastosowana do zbadania wpływu heterogeniczności leczenia farmakologicznego w obrębie jasnokomórkowego raka nerki.

Zastosowanie macierzy białkowych z odwróconą fazą (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w poszczególnych nowotworach nerkowokomórkowych

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Ten protokół został zaprojektowany, aby wytrenować algorytm uczenia maszynowego do korzystania z kombinacji parametrów obrazowania pochodzących z rezonansu magnetycznego (MRI) i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT) w szczurzym modelu przerzutów raka piersi do kości w celu wykrycia wczesnej choroby przerzutowej i przewidywania późniejszej progresji do makroprzerzutów.

Algorytmy uczenia maszynowego do wczesnego wykrywania przerzutów do kości w eksperymentalnym modelu szczurzym

Poznaj standaryzowany protokół SDS-PAGE do profilowania korony białkowej nanocząstek w diagnostyce raka trzustki. Metoda oferuje odtwarzalne, niskokosztowe i zgodne z kryteriami REASSURED narzędzie do wczesnego wykrywania nowotworów.

Standaryzowany przepływ SDS-PAGE do spersonalizowanego profilowania koronawirusowego białka we wczesnym wykrywaniu nowotworów

Przeglądaj więcej filmów