Name: Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj udoskonaloną metodę podawania bleomycyny w aerozolu wewnątrztchawicowo u myszy. To minimalnie inwazyjne podejście zapewnia powtarzalne włóknienie płuc i wiarygodną ocenę terapii w badaniach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane przez Specjalny Projekt Wsparcia Funduszy Specjalnych Reform Edukacji i Nauczania Uniwersytetu Pekin Union Medical College 2024 (Tytuł projektu: OSF-Układ Oddechowy; Projekt nr 2024bkjg036), Chińskiej Akademii Nauk Medycznych na rzecz Funduszu Innowacji w Naukach Medycznych (2021-I2M-1-014) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81570077). Sponsorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu i analizie danych, decyzji o publikacji ani przygotowaniu rękopisu.

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC). Przez cały eksperyment wdrożono odpowiednie środki dotyczące dobrostanu zwierząt. Do eksperymentu wybrano samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni, ważące około 25 g. Tabela materiałów zawiera listę wszystkich zwierząt, odczynników i sprzętu używanych w tym badaniu oraz ich komercyjnych źródeł.
1. Selekcja i aklimatyzacja zwierząt
<ol>
	<li>Wszystkie myszy trzymaj w określonych warunkach wolnych od patogenów, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz improwizowanym dostępem do jedzenia i wody.</li>
	<li>Przyzwyczaj myszy do pracy w ośrodku przez 5-7 dni przed rozpoczęciem modelu opartego na aerozolu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu bleomycyny
UWAGA: Bleomycyna jest cytotoksycznym środkiem przeciwnowotworowym. Wszystkie kroki wykonuj w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa biologicznego, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Używając sterylnej strzykawki o pojemności 1 mL, pobierz 3 mL bezpłodnej 0,9% chlorku sodu i wstrzyknij ją do fiolki zawierającej 15 U chlorowodorku bleomycyny.</li>
	<li>Delikatnie mieszaj fiolkę, aż proszek się całkowicie rozpuści, aby uzyskać roztwór 5 U/mL.</li>
	<li>Roztwór zapasowy należy do sterylnych rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL. Przygotuj roztwory robocze 3,75 U/mL i 2,5 U/mL poprzez rozcieńczenie sterylną solą fizjologiczną. UWAGA: Dla myszy masowej 25 g stężenia te odpowiadają dawkom odpowiednio 7,5 U/kg i 5 U/kg. Dostosuj stężenia, jeśli waga myszy się zmienia.</li>
	<li>Przechowuj roztwory działające w 4 °C do tygodnia lub do 1 miesiąca w -80 °C. Rozmroz i przygotuj do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
</ol>
3. Podawanie bleomycyny wewnątrztchawicowej za pomocą aerozoli
<ol>
	<li>Przygotowanie i podawanie znieczulenia<ol>
		<li>Przygotuj roztwór znieczulający, rozpuszczając 0,1 g proszku sodu pentobarbitalu w 10 ml bezpłodnej soli fizjologicznej. Filtr używa membranowego filtra PES o średnicy 0,22 μm. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C w środowisku chronionym przed światłem i użyj w ciągu 3 dni od przygotowania.</li>
		<li>Podawaj roztwór pentobarbitalu sodu przez iniekcję dootrzewną za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL z igłą 26-gauge w dawce 60 mg/kg masy ciała. Jeśli głębokość lub czas działania znieczulenia jest niewystarczający, dostosuj dawkę w zależności od reakcji zwierzęcia pod okiem weterynarza.</li>
		<li>Zmierz głębokość znieczulenia kilka minut po wstrzyknięciu, mocno ściskając palec i potwierdzając brak odruchu odstawienia przed dalszymi zabiegami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie aparatury do dostarczania aerozoli<ol>
		<li>Przygotuj aparat do dostarczania aerozolu, upewniając się, że igła nebulizująca, strzykawka i filar dozujący są obecne i sterylne (Rysunek 1B).</li>
		<li>Zanurz strzykawkę aerozolową w sterylnej soli fizjologicznej. Powoli wdychajcie płyn i robicie pauzę na 8 sekund. Szybko wypróżnij płyn. Powtórz to trzy razy, aby napełnić i przepłukać system.</li>
		<li>Po ostatecznym wydaleniu ponownie napełnij strzykawkę solą fizjologiczną. Przymocuj igłę aerozolizującą, upewniając się, że połączenie jest wypełnione solą fizjologiczną.</li>
		<li>Zanurz złożoną igłę w soli fizjologicznej i powtórz cykl aspiracji-pauzy-wypychania jeszcze trzy razy, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza. UWAGA: Aby potwierdzić gotowość, wydłuż sól fizjologiczną na ciemnym tle. Upewnij się, że szybko wydzielona sól fjologiczna tworzy wachlarzowatą mgiełkę na ciemnym tle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura podawania aerozoli wewnątrztchawicowego<ol>
		<li>Sprzątaj igłę aerozolową roztworem roboczym bleomycyny, zasysając i wydychając ją trzykrotnie z 8-sekundowymi przerwami.</li>
		<li>Na szczycie słupka 50 μL wstaw kolumnę dozującą 25 μL, aby skalibrować objętość. Aspiruj wymaganą objętość (50 μL). Wyrzuć nadmiar płynów. UWAGA: Taka konfiguracja dawkowania zapewnia spójne dostarczanie poprzez minimalizację błędów ludzkich.</li>
		<li>Umieść znieczuloną mysz na platformie intubacyjnej, zaczepiając górne siekacze i tapiąc kończyny, aby ustabilizować (rysunek 1C). UWAGA: Potwierdź rytmiczne ruchy klatki piersiowej. Jeśli zwierzę wydaje się aktywne, podaj dodatkową dawkę znieczulującego.</li>
		<li>Użyj wygiętych kleszczy, aby delikatnie wyciągnąć język. Włóż laryngoskop małego zwierzęcia, aby odsłonić krtanię (Rysunek 1D).</li>
		<li>Włóż igłę aerozolizującą pionowo przez krlotę. Dostarcz aerozol bleomycyny szybko (rysunek 1E). UWAGA: Skieruj końcówkę igły w kierunku pożądanego płuca dla celowanego podania. Unikaj zbyt głębokiego wkładania, aby zapobiec urazom. Końcówka igły nebulizatora powinna być umieszczona blisko, ale nie dotykając, punktu bifurkacji (pierwszego bifurkacji) tchawicy myszy, aby uzyskać najlepszy efekt modelowania. Jeśli czubek zostanie umieszczony tylko w środku tchawicy, aerozol może uderzyć jedynie w ścianę tchawicy, tworząc duże krople, które są wyplywane lub połykane. Jeśli czubek znajduje się zbyt blisko rozgałęzienia tchawicy, istnieje ryzyko uszkodzenia tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Powrót do zdrowia po zabiegu
<ol>
	<li>Połóż mysz na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Obserwuj mysz nieprzerwanie, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu (zazwyczaj 1-2 godziny).</li>
	<li>Wykonaj szczypnięcie palca, aby sprawdzić refleks i upewnić się, że mysz żyje.</li>
	<li>Codziennie monitoruj klinicznie przez 21 dni, w tym masę ciała, poziom aktywności, pielęgnację i objawy układu oddechowego.</li>
	<li>Uśpienie zwierząt, gdy spełnione są następujące kryteria: (i) >20% utrata masy ciała w porównaniu do poziomu wyjściowego przed leczeniem, lub ≥15% utrata towarzysząca innym klinicznym oznakom cierpienia; (ii) utrzymujący się ciężki niedociąg oddechowy w spoczynku (ciężkie lub brzuszne oddychanie, wyraźna tachypnoja lub bradypneja, rozszerzenie nosa lub oddychanie otwartymi ustami), z cynianizą kończyn lub bez niej; (iii) niemożność zdobycia jedzenia lub wody, wyraźna ospałość lub wygląd umierania (brak reakcji na dotyk i/lub utrata odruchu prostowania); lub (iv) silne odwodnienie, hipotermia lub inne oznaki nieodwracalnego pogorszenia się według oceny weterynarza prowadzącego. Gdy te humanitarne cele zostaną osiągnięte, należy uśpić zwierzęta przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (≥150 mg/kg, i.p.), a następnie wykonać wtórną metodę fizyczną (np. zwichnięcie szyjki macicy), aby zapewnić śmierć i zminimalizować ból oraz niepokój.</li>
</ol>
5. Pomiar końcowej funkcji płuc i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>W dniu 21 znieczulanie myszy podano 90 mg/kg dożylnie tego samego roztworu znieczulenia, aby wywołać głęboką anestezję i zahamować oddychanie.</li>
	<li>Potwierdź całkowite znieczulenie przez uszczypanie palca. Odsłonij tchawicę, przecinając skórę i rozdzielając mięśnie.</li>
	<li>Wykonaj małe, skosowane nacięcie w tchawicy i włóż igłę do intubacji. Zabezpiecz się chirurgiczną ligaturą.</li>
	<li>Przenieś mysz do komputerowego respiratora mechaniki płuc małych zwierząt. Inicjuj wentylację mechaniczną i upewnij się, że nie oddychaj spontanicznie. Używaj systemu respiratora do pomiaru parametrów funkcji płuc.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję prawej komory z 5-10 ml bezpłodnej soli fizjologicznej, aż płuca będą wyglądać na zblednięte.</li>
	<li>Rozciąń całe płuco. Zabezpiecz lewe płuco w neutralnej buforowanej formalinie na 24 godziny.</li>
	<li>Osadzić ustaloną tkankę płucną w parafinie, przeciąć ją i wykonać barwienie H&E, barwienie trójchromowe Massona oraz immunohistochemiczne barwienia dla COL1A1 i α-SMA.</li>
	<li>Umieść prawe płuco w rurce homogenizacyjnej o pojemności 2 mL z kulkami. Dodaj wodę zgodnie z protokołem zestawu hydroksyproliny. Ujednolicz i kontynuuj test.</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, J. E., Barkman, H. W., Waring, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Semin Respir Med. 5 (3), 255-263 (1984).</li>
<li>Jo, H. E., Randhawa, S., Corte, T. J., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis+and+the+elderly%3A+diagnosis+and+management+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+Aging%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis and the elderly: diagnosis and management considerations.</a> Drugs Aging. 33 (5), 321-334 (2016).</li>
<li>Raghu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+pulmonary+fibrosis+in+US+Medicare+beneficiaries+aged+65+years+and+older%3A+incidence%2C+prevalence%2C+and+survival%2C+2001-11%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Idiopathic pulmonary fibrosis in US Medicare beneficiaries aged 65 years and older: incidence, prevalence, and survival, 2001-11.</a> Lancet Respir Med. 2 (7), 566-572 (2014).</li>
<li>Hutchinson, J., Fogarty, A., Hubbard, R., McKeever, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+and+mortality+of+idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Global incidence and mortality of idiopathic pulmonary fibrosis: a systematic review.</a> Eur Respir J. 46 (3), 795-806 (2015).</li>
<li>Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+bleomycin-induced+lung+injury+in+animals+and+its+applicability+to+human+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Exp Lung Res. 41 (2), 57-73 (2015).</li>
<li>Horowitz, J. C., Thannickal, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in pulmonary fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 27 (6), 600-612 (2006).</li>
<li>Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+bleomycin-induced+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Time course of bleomycin-induced lung fibrosis.</a> Int J Exp Pathol. 83 (3), 111-119 (2002).</li>
<li>Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bleomycin+animal+model%3A+a+useful+tool+to+investigate+treatment+options+for+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (3), 362-382 (2008).</li>
<li>Peng, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+induces+molecular+changes+directly+relevant+to+idiopathic+pulmonary+fibrosis%3A+a+model+for+%26%2334%3Bactive%26%2334%3B+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bleomycin induces molecular changes directly relevant to idiopathic pulmonary fibrosis: a model for &#34;active&#34; disease.</a> PLoS One. 8 (4), e59348(2013).</li>
<li>Gul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrosis+model+of+mice+induced+by+different+administration+methods+of+bleomycin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrosis model of mice induced by different administration methods of bleomycin.</a> BMC Pulm Med. 23 (1), 91(2023).</li>
<li>Barbayianni, I., Ninou, I., Tzouvelekis, A., Aidinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+revisited%3A+A+direct+comparison+of+the+intratracheal+micro-spraying+and+the+oropharyngeal+aspiration+routes+of+bleomycin+administration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Med.+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Bleomycin revisited: A direct comparison of the intratracheal micro-spraying and the oropharyngeal aspiration routes of bleomycin administration in mice.</a> Front. Med. (Lausanne). 5, 269(2018).</li>
<li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+pulmonary+fibrosis+induced+by+nasal+bleomycin+nebulization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A mouse model of pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.</a> J. Vis. Exp. (191), e64097(2023).</li>
<li>Li, W., Hu, Y., Yuan, W., Li, L., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+mouse+models+of+lung+fibrosis+induced+by+intratracheal+instillation+and+intratracheal+aerosol+administration+of+bleomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Comparison of two mouse models of lung fibrosis induced by intratracheal instillation and intratracheal aerosol administration of bleomycin.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 32 (2), 221-225 (2012).</li>
<li>Meng, J., Peng, Z., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pulmonary+fibrosis+model+induced+by+repeated+low-dose+intravenous+injection+and+intratracheal+instillation+of+bleomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Zhong+Nan+Da+Xue+Xue+Bao+Yi+Xue+Ban%22%5BJournal%5D)">Murine pulmonary fibrosis model induced by repeated low-dose intravenous injection and intratracheal instillation of bleomycin.</a> Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 38 (12), 1228-1232 (2013).</li>
<li>Kadam, A. H., Schnitzer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+calibrated+relationship+between+bleomycin+concentrations+and+facets+of+the+active+phase+fibrosis+in+classical+mouse+bleomycin+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Highly calibrated relationship between bleomycin concentrations and facets of the active phase fibrosis in classical mouse bleomycin model.</a> Int J Mol Sci. 25 (22), (2024).</li>
<li>Orlando, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mouse+lung+injury+by+endotracheal+injection+of+bleomycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of mouse lung injury by endotracheal injection of bleomycin.</a> J Vis Exp. (146), e58922(2019).</li>
<li>Morita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+stem+cell+administration+imaging+method+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a stem cell administration imaging method in bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse models.</a> Sci Rep. 14 (1), 18905(2024).</li>
<li>Olsson, I. A., Hansen, A. K., Sandoe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethics+and+refinement+in+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ethics and refinement in animal research.</a> Science. 317 (5845), 1680(2007).</li>
<li>Jenkins, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+use+of+animal+models+for+the+preclinical+assessment+of+potential+therapies+for+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 56 (5), 667-679 (2017).</li>
<li>Degryse, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+intratracheal+bleomycin+models+several+features+of+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299 (4), L442-L452 (2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis+and+resolution+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis+mouse+model+revealed+by+spatial+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis and resolution in bleomycin-induced pulmonary fibrosis mouse model revealed by spatial transcriptome analysis.</a> Heliyon. 9 (12), e22461(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów.

Badanie to zaproponowało zoptymalizowany model nieinwazyjnej nebulizacji tchawicy u myszy wywołanej bleomycyną włóknieniem płuc. Do zlokalizowania krloty użyto małego zwierzęcego laryngoskopu, a do dróg oddechowych myszy wprowadzono maleńką igłę nebulizacyjną. Ręcznie zastosowano ciśnienie, aby roznietleniać lek do płuc, zmniejszając tym samym dyskomfort i duszenie związane z igłą retencyjną stosowaną w nieinwazyjnych zastrzykach13,14. Dodatkowo te aerozole mogą ...

Włóknienie płuc (PF) to grupa śmiertelnych chorób charakteryzujących się postępującym uszkodzeniem mięścia przydusznego płuca oraz nieprawidłową naprawą, z których idiopatyczna fibroza płuc (IPF) stanowi 30%-40%, przy medianie wieku diagnozy pacjentów to 65 lat, a ponad 80% z nich ma 60 lat więcej niż 60 lat1, 2. W miarę nasilania się globalnego starzenia zachorowalność na IPF rośnie z roku na rok, osiągając światową częstość występowania IPF na poziomie 3-9/100 000/rok, a według badania przeprowadzonego w Stanach Zjednoczonych wśród osób powyżej 65. roku życia, częstość występowania w tej populacji wzrosła do 93,7/100 000/rok 3,4.
Pierwszym historycznie opracowanym modelem włóknienia płuc był model wywołany bleomycyną, często stosowany w środowisku akademickim, z najlepszą charakterystyką i najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym obecnie5, powtarzającym wiele cech IPF i innych fibrotycznych ILD, w tym zapalenie płuc, uszkodzenie nabłonka, proliferację fibroblastów oraz nadmierne odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)6. Ponadto zarówno ostre, jak i przewlekłe włóknienie płuc można modelować w zależności od dawki i częstotliwości podawania bleomycyny. Zgłaszano, że płuca wchodzą w ostrą fazę zapalną w ciągu 5-7 dni po ekspozycji na bleomycynę, po której następuje faza fibrotyczna zaczynająca się około 7 dnia. Do 21. dnia zazwyczaj obserwuje się wyraźną remodelację włóknistą, co pozwala modelowi podsumować zarówno wczesną odpowiedź zapalną, jak i późną patologię fibrotyczną w określonym czasie7 (Rysunek 1A). Pozwala to na badanie całego procesu chorobowego od początkowego urazu aż do stadium włókniastego, co jest bardzo ważne dla rozwoju leków i badań mechanizmów na wszystkich etapach 8,9.
Drogi modelowania bleomycyny są różnorodne i mogą być podawane lokalnie lub systemowo, w tym przez szlaki endotchawiczne, nosowe, dożylne i wewnątrzotrzewnowne. Najczęściej stosowanym jest zastrzyk do tchawicy. Minusem jest to, że powoduje to nacięcia u myszy, co wpływa na przeżywalność modelowanych myszy10. Później wprowadzono ulepszenia, aby umożliwić stosowanie igły do intubacji tchawicy i iniekcji kroplówkowej u myszy11. Jednak lek podawany przez strzykawkę może być rozprowadzany w płucach jedynie jako blokada, co może prowadzić do nierównomiernego rozkładu bleomycyny w każdym płatku płuca, powodując lokalną nadgęstość i wpływając na stabilność modelu myszy. Ponadto do podawania bleomycyny używano wkładów do nebulizatorów komorowych, ale ilość wdychanego aerozolu bleomycyny w każdej myszy nie może być dokładnie określona, a czas pojedynczej indukcji wynosidługie 12. Dlatego opracowano udoskonaloną metodę podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej opartej na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych myszowych modeli włóknienia płuc. Bleomycyna jest aerozolizowana, co umożliwia równomierną dyspersję i odkładanie się w płucach, a tym samym lepiej odtwarza patologię chorób płuc. Mamy nadzieję, że pojawienie się tej metody przyspieszy badania nad lekami, które mogą całkowicie wyleczyć włóknienie płuc.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; Filtr strzykawkowy m polietersulfonu</td><td>Cytosci</td><td>CSTPE3320</td><td></td></tr><tr><td>1 mL jednorazowej strzykawki</td><td>BD</td><td>300481</td><td></td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówki o pojemności 1,5 mL</td><td>Servicebio</td><td>EP-150-M</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL wzmocnionej rurki lizy</td><td>Servicebio</td><td>HT-200-M</td><td></td></tr><tr><td>4 stopnie; Chłodnica laboratoryjna C</td><td>Meiling</td><td>BCD-402WPCX</td><td></td></tr><tr><td>50 mL stożkowa rurka wirówkowa</td><td>Servicebio</td><td>EP-5001-J</td><td></td></tr><tr><td>-80 &°; Zamrażarka C o ultraniskiej temperaturze</td><td>Haier Biomedical</td><td>DW-86L828J</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>100092683</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór różniczkowania kwasowego</td><td>Servicebio</td><td>G1039</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospryskiwacz aerozolowy do intubacji małych zwierząt</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd</td><td>Yan-30012</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy zestaw narzędzi chirurgicznych</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd</td><td>YAN-21A3</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorowodorku bleomycyny</td><td>Hanhui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>H20055883</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik niebieski</td><td>Servicebio</td><td>G1040</td><td></td></tr><tr><td>Komputerowo sterowany respirator mechaniki płuc małych zwierząt</td><td>EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.</td><td>FX-2</td><td></td></tr><tr><td>Taśma izolacyjna elektryczna</td><td>3M</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwienia Eozyną Y</td><td>Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd</td><td>BA4022</td><td></td></tr><tr><td>Zielony tusz do znakowania</td><td>Pilot</td><td>Chiku-rin</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwienia hematoksylyny</td><td>Servicebio</td><td>G1004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do analizy ilościowej hydroksyproliny</td><td>Abcam</td><td>ab222941</td><td></td></tr><tr><td>Laminarny okap</td><td>HDL</td><td>DL-CJ-1N</td><td></td></tr><tr><td>Laryngoskop do procedur u małych zwierząt</td><td>Shenzhen Bilead Biology Technology CO., LTD</td><td>DXSHJ0</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon</td><td>E100</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dewaksowania o niskiej toksyczności</td><td>Servicebio</td><td>G1128</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do trójbarwnego barwienia Massona</td><td>Zhuhai Baso Biotech Co., Ltd</td><td>BA4079B</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłyt z detekcją absorpcji</td><td>Agilent</td><td>Synergia H1</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna formalina buforowana</td><td>Servicebio</td><td>G1101-3ML</td><td></td></tr><tr><td>Neutralne medium mocujące</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało monoklonalne przeciwko COL1A1 dla królików</td><td>Huabio</td><td>HA722517</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka chłodzona</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Generalbiol</td><td>TYJC002</td><td></td></tr><tr><td>Platforma do intubacji tchawicy dla małych zwierząt</td><td>Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd</td><td>CG-02M</td><td></td></tr><tr><td>Bezpłodny roztwór chlorku sodu 0,9%</td><td>China Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>H12020024</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkanek</td><td>Servicebio</td><td>KZ-III</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do mielenia cyrkonii</td><td>Servicebio</td><td>G0203</td><td></td></tr></tbody></table>

udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

A Refined Aerosol-Based Intratracheal Bleomycin Delivery Method for Reproducible and Minimally Invasive Mouse Models of Pulmonary Fibrosis

Włóknienie płuc charakteryzuje się stopniowym odkładaniem się tkanki bliznowatej włóknistej w obrębie mięścia płuca, prowadząc do poważnie upośledzonej wymiany gazów. Jest podstawą spektrum przewlekłych chorób śródmiąższowych płuc, w szczególności idiopatycznego włóknienia płuc, schorzenia związanego z wyjątkowo złą rokownictwem. Ze względu na brak skutecznych terapii, solidne modele myszy są kluczowe do wyjaśnienia leżących u podstaw mechanizmów patologicznych oraz oceny nowych interwencji przeciwfibrotycznych. Błona płucna wywołana bleomycyną pozostaje najczęściej wykorzystywanym modelem eksperymentalnym. Typowe metody podawania u myszy to dożylne i dootrzęwne, inwazyjne otwarte instylowanie tchawicy oraz nieinwazyjne kapanie tchawicy. Jednak inwazyjne metody chirurgiczne często powodują wtórne uszkodzenia tkanek, co może obniżyć powtarzalność i stabilność modelu. Natomiast nieinwazyjne kapanie tchawicy zwykle prowadzi do nierównomiernego rozkładu bleomycyny w płatach płuc i niesie ryzyko uduszenia, co zmniejsza powtarzalność i zwiększa wyzwania techniczne. Aby sprostać tym ograniczeniom, opracowano udoskonaloną metodę podawania wewnątrztrachowców opartą na aerozoli, która jest operacyjnie prostsza, minimalnie inwazyjna, wysoce powtarzalna i etycznie lepsza, znacząco zmniejszając stres zwierząt. Za pomocą laryngoskopu dla małych zwierząt do bezpośredniej wizualizacji rima glottidis, do tchawicy wprowadza się specjalistyczną igłę aerozolazującą, znacznie węższą niż średnica tchawicy myszy. Roztwór bleomycyny podawany jest pod precyzyjnie kontrolowanym ciśnieniem, tworząc drobny aerozol. Zapewnia to równomierne i efektywne rozmieszczenie środka w całym parenchymie płuca. Ponadto można selektywnie celować w lewy lub prawy płuco, kierując igłę do odpowiedniego oskrzela. Relacja dawka-odpowiedź tego modelu jest szeroko charakteryzowana poprzez systematyczne monitorowanie zmian funkcji płuc, przejawów histopatologicznych oraz zawartości hydroksyproliny w płucach. Ten udoskonalony protokół eksperymentalny ma ułatwić standaryzację laboratoryjną, ostatecznie przyspieszając rozwój i przedkliniczną walidację nowych terapii przeciwfibrotycznych.

W tym badaniu zaproponowaliśmy metodę podawania wewnątrzoskrzelowej opartą na aerozolu, mającą na celu wywołanie włóknienia płuc u myszy za pomocą bleomycyny. W eksperymentach wstępnych zielony barwnik był aerozolizowany i podawany do płuc różnych myszy. Barwnik wykazywał plamkowany wzór rozmieszczenia w płucach, co wskazuje, że podanie wewnątrzoskrzelowe na bazie aerozoli umożliwiało równomierne rozproszenie środka we wszystkich płatach płuc (Rysunek 1F). Podawanie zielonego tuszu pokazane ...

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Pulmonary fibrosis is characterized by progressive deposition of fibrotic scar tissue within the lung parenchyma, leading to severely impaired gas ...

Naszym celem jest opracowanie powtarzalnego, minimalnie inwazyjnego, opartego na aerozolu modelu dostarczania leków, który wywołuje włóknienie płuc i usprawnia przedkliniczną ocenę leków. Nasz model umożliwia spójne i niezawodne dostarczanie leków, jednocześnie zmniejszając liczbę urazów chirurgicznych i poprawiając powtarzalność w różnych eksperymentach. Planujemy zastosować ten model do przetestowania naszej unikalnej terapii w leczeniu włóknienia płuc oraz klinicznego urazu płuc.Na początek, używając sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra, pobierz trzy mililitry sterylnego chlorku sodu o zawartości 0,9%, a następnie wstrzykni chlorek sodu do fiolki zawierającej 15 jednostek chlorku bleomycyny. Delikatnie mieszaj fiolkę, aż proszek bleomycyny całkowicie się rozpuści, aby uzyskać roztwór pięciojednostkowy na mililitr. Roztwór zapasowy należy do sterylnych mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra.Następnie przygotuj roztwory robocze o stężeniu 3,75 jednostki na mililitr i 2,5 jednostki na mililitr, rozcieńczając zapas sterylną solą fizjologiczną. Przygotuj aparat do dostarczania aerozolu, aby igła nebulizująca, strzykawka i filar dozujący były obecne. Zanurz strzykawkę aerozolową w sterylnej soli fizjologicznej.Powoli wdechuj płyn, zatrzymaj się na osiem sekund, a następnie szybko wydmuchaj płyn. Następnie po ostatecznym wydaleniu ponownie napełniam strzykawkę sterylną solą fizjologiczną. Przymocuj igłę aerozolizującą i upewnij się, że połączenie jest wypełnione solą fizjologiczną.Następnie zanurz w pełni złożoną igłę w sterylnej soli fizjologicznej. Aby zapełnić igłę aerozolizującą roztworem działającym bleomycynę, należy ją zasysać i wydłużać trzy razy, z ośmiosekundowymi przerwami między cyklami. Aspiruj roztwór działający na bleomycynę do strzykawki.Na szczycie 50-mikrolitrowego słupka dozującego wstaw kolumnę dozującą, aby skalibrować całkowitą objętość. Wyrzuć nadmiar roztworu. Następnie umieść znieczuloną mysz na platformie intubacyjnej.Zaczepiaj górne siekacze do pętli drutu i przyklej kończyny taśmą, aby ustabilizować mysz w odpowiedniej pozycji. Używając zakrzywionych kleszczy, delikatnie wyciągnij język. Włóż laryngoskop dla małego zwierzęcia, aby zwizualizować i odsłonić lottysę.Następnie wprowadzić igłę aerozolizującą pionowo przez odsłoniętą krtanię i szybko podać aerozol bleomycyny do tchawicy. Następnie połóż mysz na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Obserwuj mysz nieprzerwanie, aż całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu.Wykonaj szczypnięcie palca, aby sprawdzić odruch i upewnić się, że mysz żyje. Barwienie hematoksyliny i eozyny wykazało łagodne pogrubienie ściany pęcherzyka oraz miejscowe włóknienie w grupie z pięciomjednostkami na kilogram bleomycyny. Natomiast grupa z 7,5 jednostki na kilogram wykazywała rozległe zapadanie się pęcherzyka i ciężkie zmiany włókniste.Zmodyfikowana ilościowa ocena Ashcrofta wykazała zależny od dawki wzrost nasilenia włóknienia u myszy leczonych bleomycyną w porównaniu do kontroli stosowanych solą fizjologiczną. Trójchromowe barwienie Massona wykazało zwiększone osadzanie kolagenu w grupie pięciojednostkowej na kilogram oraz rozległe zwłóknienie śródmiąższowe w grupie 7,5 jednostki na kilogram. Ilościowe określenie obszarów z kolagenem pozytywnym potwierdziło istotny, zależny od dawki wzrost odkładania kolagenu po leczeniu bleomycyną.Barwienie immunohistochemiczne wykazało zwiększoną ekspresję białka Col1A1 w płucach obu grup bleomycynowych, z silniejszym i szerszym barwieniem zaobserwowanym w grupie z 7,5 jednostki na kilogram. Zawartość hydroksyproliny była istotnie wyższa w obu grupach leczonych bleomycyną, co potwierdza zwiększone nagromadzenie kolagenu w tkance płucnej. Statyczna zgodność płuc była istotnie obniżona w zależności od dawki w grupach leczonych bleomycyną.Pojemność wdechowa była istotnie niższa tylko w grupie przyjmującej 7,5 jednostki na kilogram bleomycyny w porównaniu do soli fizjologicznej. Elastyny w układzie oddechowym wzrosły istotnie w grupie z 7,5 jednostki na kilogram w porównaniu do soli fizjologicznej. Uległość układu oddechowego była istotnie obniżona tylko w grupie z 7,5 jednostki na kilogram.

a-refined-aerosol-based-intratracheal-bleomycin-delivery-method-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje podejście dooskrzelowe polegające na selektywnym podawaniu eksperymentalnego środka do dystalnego prawego i lewego płuca. W przedstawionym protokole będziemy podawać bleomycynę dooskrzelowo myszy, aby uzyskać lepszy model zwłóknienia płuc.

Podawanie dooskrzelowe: technika selektywnego podawania eksperymentalnego środka do płuc myszy

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę badania aktywności przeciwzwłóknieniowej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu podawanych dożylnie, uzyskanych z całej pępowiny po indukcji uszkodzenia płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze bleomycyny u myszy C57BL/6. Protokół ten można łatwo rozszerzyć na badania przedkliniczne innych środków terapeutycznych.

Indukcja uszkodzenia płuc myszy przez wstrzyknięcie dotchwiaczą bleomycyny

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Różne modele zwierzęce zwłóknienia płuc zostały stworzone przy użyciu bleomycyny, aby wyjaśnić patogenezę zwłóknienia płuc i znaleźć nowe cele leków. Jednak większość modeli zwłóknienia płuc ukierunkowanych na tkankę płucną ma nierównomierne podawanie leków. W tym miejscu proponujemy model jednolitego zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny nosowej.

Mysi model zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny w nosie

Ten protokół opisuje izolację makrofagów śródmiąższowych płuc (IM) i ich adoptywny transfer po stymulacji pęcherzyków płucnych przez IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF).

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Ten protokół demonstruje technikę aspiracji ustno-gardłowej do użycia w mysim modelu zwłóknienia płuc z bleomycyną.

Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Protokół ten określa metodę wywoływania zwłóknienia płuc u myszy poprzez wielokrotne podawanie bleomycyny do jamy ustnej i gardła, uzyskując cechy patologiczne bardzo podobne do idiopatycznego zwłóknienia płuc.

Wyrafinowany mysi model idiopatycznego włóknienia płuc

Poznaj udoskonaloną metodę podawania bleomycyny w aerozolu wewnątrztchawicowo u myszy. To minimalnie inwazyjne podejście zapewnia powtarzalne włóknienie płuc i wiarygodną ocenę terapii w badaniach przedklinicznych.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc (Wideo) | JoVE Journal

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Przeglądaj więcej filmów