Name: Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj przestrzenną analizę glikomu w tkankach wątroby przy użyciu spektrometrii mas MALDI MSI. Ta metoda umożliwia precyzyjne mapowanie glikogenu i glikanów N-związanych w hepatocytach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Vander Kooi, Sun i Gentry za owocne dyskusje. Badanie to zostało wsparte grantami National Institutes of Health (NIH) dla Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility Uniwersytetu Kentucky Markey Cancer Center, P30CA177558 dla D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 dla R.C.S., R35NS116824 dla M.S.G., R01DC019054 dla C.W.V.K. oraz University of Florida College of Medicine.

<ol><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+Localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).</li>
<li>Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+A+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights.</a> Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+mass+spectrometry+is+an+accurate+and+rapid+method+to+analyze+different+modes+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation.</a> J Vis Exp. 82, e50926(2013).</li>
<li>Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+human+brain+organoids+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry.</a> J Vis Exp. 211, e66997(2024).</li>
<li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li>
<li>Aichler, M., Walch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+imaging+mass+spectrometry%3A+Current+frontiers+and+perspectives+in+pathology+research+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice.</a> Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).</li>
<li>Conroy, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensionality+reduction+clustering+of+complex+carbohydrates+to+study+lung+cancer+metabolic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity.</a> Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+proteins+in+tissues+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).</li>
<li>Powers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+imaging+mass+spectrometry+workflow+for+spatial+profiling+analysis+of+N-linked+glycan+expression+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues.</a> Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).</li>
<li>Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+imaging+of+N-glycans+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+of+fresh+or+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).</li>
<li>Stanback, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+n-glycan+and+lipid+analysis+from+tissues+using+MALDI-MS+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).</li>
<li>Hawkinson, T. R., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging+of+glycogen+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ.</a> Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).</li>
<li>Young, L. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mass+spectrometry+imaging+reveals+heterogeneous+glycogen+stores+in+human+normal+and+cancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues.</a> EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).</li>
<li>Conroy, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+metabolomics+reveals+glycogen+as+an+actionable+target+for+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis.</a> Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).</li>
<li>Clarke, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+drives+tumor+initiation+and+progression+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma.</a> Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).</li>
<li>Wallace, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+N-glycome+tissue+atlas+of+15+human+normal+and+cancer+tissue+types+determined+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry.</a> Sci Rep. 14 (1), 489(2024).</li>
<li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> J Vis Exp. 166, e62008(2020).</li>
<li>Mcdowell, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+and+lectin+analysis+of+N-linked+glycans+in+carbohydrate+antigen-defined+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).</li>
<li>Palmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDR-controlled+metabolite+annotation+for+high-resolution+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry.</a> Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).</li>
<li>Colpaert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+glycogen+storage+diseases+and+emerging+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics.</a> Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).</li>
<li>Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+mass+spectrometry+at+the+single+cell%3A+Recent+innovations+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).</li>
<li>Chan, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+mass+spectrometry+imaging+enables+sub-micrometer+spatial+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics.</a> Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).</li>
<li>Lim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+Hiplex-IC%3A+Multiomic+and+multimodal+imaging+of+targeted+intact+proteins+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues.</a> Front Chem. 11, 1182404(2023).</li>
<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).</li>
<li>Rappez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacem+reveals+metabolic+states+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spacem reveals metabolic states of single cells.</a> Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).</li>
<li>Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldi+MSI+protocol+for+spatial+bottom-up+proteomics+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution.</a> J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).</li>
<li>Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomic+MALDI-MSI+analysis+of+lipids+and+N-glycans+through+affinity+array+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture.</a> Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).</li>
<li>Clarke, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+the+brain+metabolome%2C+lipidome%2C+and+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome.</a> Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).</li>
<li>Juras, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+microwave+fixation+provides+an+instantaneous+snapshot+of+the+brain+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome.</a> Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).</li>
<li>Cantrell, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-power%2C+brain-focused+microwave+fixation+to+define+rodent+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism.</a> STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AI-driven+framework+to+map+the+brain+metabolome+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions.</a> Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).</li>
</ol>

R.C.S., M.S.G. i C.W.V.K. są współdyrektorami Centrum Zaawansowanych Badań Biomolekuł Przestrzennych (CASBR) na Uniwersytecie Florydy oraz współzałożycielami Sugar3 LLC. R.C.S. otrzymał wsparcie badawcze i/lub honoraria konsultingowe od Maze Therapeutics. M.S.G. otrzymał wsparcie badawcze, związki badawcze lub honoraria konsultingowe od Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics oraz Aro Biotherapeutics. M.S.G. jest członkiem rady doradczej naukowej Chelsea's Hope, Glut1-Deficiency Syndrome Foundation oraz Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

MALDI-MSI to nowe narzędzie w biologii przestrzennej glikomu. Co ważne, choć protokół ten koncentruje się na zbieraniu danych przy użyciu konkretnego sprzętu, można go łatwo dostosować do platform MALDI-MSI od wieludostawców. Obróbka próbek jest identyczna aż do metody 4, choć niektórzy dostawcy mogą wymagać użycia specjalistycznych preparatów. Modyfikacje zbierania danych, wykorzystujące parametry specyficzne dla platformy MALDI-MSI, umożliwiają szybkie dostosowanie tego protokołu. Można wykorzystać oprogramowanie specyficzne dla dostawców do przetwarzania danych, jak opisano w kroku 5, lub alternatywnie platformy do rygorystycznego i powtarzalnego przetwarzania danych MALDI-MSI19.
MALDI-MSI jest szczególnie przydatnym narzędziem do zrozumienia biologii, ponieważ różne narządy, tkanki i komórki mają różne wzory glikomu. Wątroba doskonale nadaje się do analizy glikomu, ponieważ zawiera wysoki poziom glikogenu oraz różnorodne glikany związane z azotem13. Inne narządy mają wyższy poziom i różnorodność glikanów związanych z azotem oraz niższe poziomy glikogenu13. Co ważne, glikom różni się w zależności od narządów w zależności od stanu metabolicznego i chorobowego organizmu, dlatego glikom dostarcza bogatego źródła informacji biologicznych 5,14,15,20. Kontynuacja rozwoju unikalnych enzymów aktywnych węglowodanami do analizy MALDI-MSI zapowiada rozszerzenie analizy glikomu na dodatkowe ortogonalne biomolekuły w glikomie.
Mimo wielu zalet, MALDI-MSI jest obecnie ograniczony pod względem rozdzielczości w porównaniu z innymi narzędziami wykorzystywanymi w biologii przestrzennej. Protokół ten wykorzystywał zbieranie danych o rozdzielczości 50 μm. Choć doskonałe do analizy fizjologicznej, dane w rozdzielczości pojedynczej komórki znacząco posunęłyby pole do przodu21. W szczególności delokalizacja może stanowić istotną barierę dla zwiększenia rozdzielczości w metodach wykorzystujących opryskiwanie enzymami i inkubację w wilgotnych warunkach. Najnowsze postępy w sprzęcie do przetwarzania próbek, metodach obsługi próbek, sprzęcie do akwizycji danych, zastosowaniu selektywnego oznaczania oraz przetwarzaniu danych pozwalają zbieraniu danych MALDI-MSI zbliżyć się do rozdzielczości komórkowej22,23. Jednak istnieją kompromisy między rozdzielczością a stosunkiem sygnał-szum oraz inherentne ograniczenia wynikające z obecnych metod przygotowania próbek dla MALDI, które należy wziąć pod uwagę. Bardzo konkretne zastosowania już osiągają cel MALDI-MSI z rozdzielczością pojedynczych komórek, wykorzystując innowacje zarówno w przetwarzaniu próbek24, jak i nowatorskie algorytmy, co sugeruje, że ogólne rozwiązania tych problemów są w zasięgu 25,26,27.
Po zebraniu danych preparat można barwić metodą H&E w celu adnotacji histologicznej. Jednak uszkodzenia komórek i tkanek są związane ze zbieraniem danych MALDI-MSI, dlatego ta strategia ogranicza zakres adnotacji komórkowej. Alternatywnie, sekwencyjne cięcia tkanki mogą być wykorzystywane do H&E. Ta strategia dostarcza wysokiej jakości danych, ale wymaga dopasowania i integracji dyskretnych wycięć próbek.
Warto zauważyć, że tkanki z formaliną utrwaloną w parafinę (FFPE) są bardzo dobrze nadane do analizy glikomu przeprowadzonej przez MALDI-MSI, z niewielkimi zmianami w protokole przygotowania próbki13. Jednak tkanki FFPE nie mogą być skutecznie wykorzystywane do analiz metabolomicznych i innych podobnych, dlatego dla podejść multiomicznych28 preferowane są próbki świeżo zamrożone, jak opisano tutaj. Przygotowanie próbek jest kluczowym elementem każdego procesu MSI dotyczącego niestabilnych biomolekuł, co wymaga specjalnych metod do pobierania i obsługi próbek 17,29,30.
Metodologie rozszerzające ogólność i szerokie zastosowanie podejść opartych na MALDI-MSI szybko się rozwijają, z ogromną poprawą sprzętu i oprogramowania19. Dodatkowo, najnowsze nowoczesne podejścia multiomic28 imultimodal 21 połączone z uczeniem maszynowym i sztuczną inteligencją są szczególnie obiecujące w obsłudze tych wysoce złożonych zbiorów danych31.

Dziedzina biologii przestrzennej szybko się rozwija, dostarczając kluczowych wglądów w dynamiczną przestrzenną złożoność biomolekularną organizmów żywych. Stosuje się wiele podejść do badania odrębnych biomolekuł w kontekście biologicznym. Chociaż niektóre są wysoce wyspecjalizowanymi technikami, spektrometria mas (MS) stała się ważną ogólną techniką do ilościowego określania szerokiego zakresu biomolekuł w kontekście komórek, tkanek lub organizmów.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Jonization Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) jest jedną z rozwijających się ogólnych technik wieloprzestrzennego obrazowania biomolekuł. Początkowo został opracowany do wizualizacji białek i peptydów w przekrojach tkanki1. Od tego czasu rozszerzono ją na wiele różnorodnych próbek biologicznych i cząsteczek2. Technikę tę można zastosować do próbek komórkowych3, organoidów4, zwierząt modelowych5 oraz próbek pacjentów 6,7. Niektóre klasy molekularne można bezpośrednio mierzyć metodami opartymi na MSI, w tym wiele metabolitów i lipidów, podczas gdy inne bardziej złożone biocząsteczki, takie jak białka i glikany, wymagają obróbki enzymatycznej lub chemicznej, aby nadawały się do wykrywania opartego na MSI 2,8.
MALDI-MSI został również zastosowany do analizy przestrzennej glikanów i glikogenów powiązanych z azotem, wykorzystując procesy wymagające przetwarzania enzymatycznego do produkcji fragmentów glikanów odpowiednich do wykrywania MSI 9,10,11,12,13,14,15 . N-glikany są rozszczepiane z reszty asparaginy białek z PNGazą F, a łańcuchy glukozy glikogenu są rozszczepiane izoamylazą. Kluczowymi zaletami analizy glikogenu MALDI jest zapewnienie przestrzennego zdefiniowania rozkładu glikogenu w próbce biologicznej, względnej ilościowej analizy oraz informacji o rozgałęzieniu łańcuchów glukozowych. Ponieważ zarówno procesy N-glikanu, jak i glikogenu wymagają enzymatycznego przetwarzania próbki do analizy MSI, zostały połączone w zintegrowany proces analizy glikomu (Rysunek 1A). Ten proces wymaga starannego przygotowania próbek biologicznych oraz specjalistycznego przetwarzania, aby umożliwić analizę glikomu w rozsianym skleściu skleistymowym, a następnie pobieranie i przetwarzanie danych. Chociaż workflow wymaga serii specjalistycznych kroków, generuje bogate, wysokiej jakości dane glikomu przestrzennego, które są wysoce powtarzalne i można je dostosować do wielu różnych typów próbek16. Dodatkowo proces jest modułowy, dzięki czemu etapy przetwarzania próbek mogą być wykonywane przez niezależne laboratoria badawcze przed przekazaniem próbek do specjalistycznych placówek wykonujących późniejsze etapy pozyskiwania i analizy danych MALDI-MSI.

<table><tbody><tr><td>Chłonna podkładka</td><td>Denville Scientific</td><td>B1623</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl (ACN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851-4X4L</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>15078292</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik cytrakonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>125318</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa rurka (15mL)</td><td>Alkali Scientific</td><td>CW5600</td><td></td></tr><tr><td>Słoje Coplin</td><td>DWK Nauki o Życiu</td><td>900570</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat &nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk kriostatowy</td><td>Leica</td><td>14041926491</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka</td><td>Bel Art</td><td>F424004131</td><td></td></tr><tr><td>Kubek dializowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>88400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>22032601</td><td></td></tr><tr><td>Parownik do żywności</td><td>Rival&nbsp;</td><td>CKRVSTLM21&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szklana wkładka (70 mm)</td><td>Firma Żelowa</td><td>LGI50</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8876</td><td>Standard</td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8125</td><td>Standard</td></tr><tr><td>Woda HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4X4L</td><td></td></tr><tr><td>Stryskiwacz HTX</td><td>HTX Technologies</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Izoamylaza</td><td>Megazyme</td><td>E-ISAMY</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Knauera</td><td>Knauer</td><td>P 4.1 S</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe łopatki</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>63059-01</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy M1</td><td>Epredia</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr mas</td><td>Bruker Daltonics</td><td>timsTOF fleX</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge-rurka (1,5 mL)</td><td>Alkali Scientific</td><td>CN3016</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna formalina buforowana NBF</td><td>Millipore sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gaz azotowy</td><td>Airgas</td><td>NIUHP300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>SH30256. FS</td><td></td></tr><tr><td>Lampy PCR</td><td>Partnerzy MedSupply</td><td>62-1091-1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F PRIME-LY ULTRA&nbsp;</td><td>Biografia Bulldoga</td><td>NZPULT10LY</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium SCiLS</td><td>Bruker Daltonics</td><td>1889000</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882007</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp; &nbsp;</td><td>Nauki o mikroskopie elektronowym</td><td>71873-02</td><td></td></tr><tr><td>Listka slajdowa</td><td>Produkty RPI</td><td>212620A</td><td></td></tr><tr><td>Sonicater (Bioruptor Pico)</td><td>Diagenoda</td><td>B01080010</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>DR Instruments</td><td>S08098</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel sterylny</td><td>WPI</td><td>WPI-500240</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sterylne</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka &nbsp; &nbsp;</td><td>Grainger</td><td>19G342</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Nowa Era</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>15-901-R</td><td></td></tr><tr><td>Cienki pędzel</td><td>Anezus</td><td>#00</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trójfluoroctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-1L</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka stroju, ESI o niskim stężeniu</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS120882</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-cyjano-4-hydroksycynaminowy kwas (CHCA)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>15254</td><td></td></tr></tbody></table>

przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

Spatial Molecular Imaging of the Glycome Using Mass Spectrometry

Przestrzenna organizacja glikomu w tkankach jest kluczowa dla molekularnych podstaw funkcjonowania fizjologicznego. Różnorodny i dynamiczny glikom jest kluczowy dla podstawowych procesów komórkowych, takich jak metabolizm, sygnalizacja i adhezja. Innowacje w biologii przestrzennej otworzyły nowe możliwości przestrzennego obrazowania molekularnego różnych klas glikomów. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół przestrzennego obrazowania biomolekularnego glikomu w świeżo zamrożonej wątrobie myszy. Workflow obejmuje (1) szybkie pobieranie i zamrożenie, (2) sekcjonowanie kriostatu w optymalnej grubości i pozycji, (3) przygotowanie tkanek i trawienie enzymów na tkankach przy użyciu enzymów aktywnych węglowodanów, (4) aplikację matrycy i pozyskiwanie danych za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji spektrometrii mas wspomaganej matrycą (MALDI-MSI) oraz (5) przetwarzanie i wizualizację danych w celu umieszczenia wyników w kontekście biologicznym. Zastosowanie tego podejścia pozwala na pozyskiwanie szczegółowych map przestrzennych glikanów i glikogenów związanych z azotem, ujawniających kluczowe cechy fizjologiczne i komórkowe. Dane te pozwalają zdefiniować kluczową przestrzenną heterogeniczność glikomową związaną z funkcjonowaniem i dysfunkcją wątroby. Ten sposób pracy umożliwia wysoce powtarzalną i czułą glikomię przestrzenną wątroby myszy. Dodatkowo jest łatwo adaptowalny do innych tkanek lub gatunków, co umożliwia nowatorskie wglądy przestrzenne w biologię glikomu w zdrowiu i chorobie.

Ostrożne przetwarzanie wątroby z dzikiej myszy, w tym wycięcie pełnego przekroju poprzecznego (Rysunek 1A), pozwoliło zdefiniować glikom za pomocą MALDI-MSI, z użyciem różnych oligosacharydów pochodzących z glikogenu oraz glikanów powiązanych z N w zakresie m/z (Rysunek 1B). Glikogen był szeroko zlokalizowany w celach wątrobowych hepatocytów i brakowało mu naczyń oraz tkanki łącznej w drogach wrotnych, zgodnie z oczekiwaniami (rysunek 1C,D). Co istotne, dane MALDI-MSI umożliwiły pomiar zarówno przestrzennego rozkładu glikogenu, jak i rozkładu długości łańcuchów, co jest kluczową cechą glikogenu w normalnym metabolizmie i stanach chorobowych (Rysunek 1D). Dodatkowo, różnorodne glikany związane z azotem wykazują zróżnicowane organizacje. Obserwowane rozmieszczenie przestrzenne obejmuje obszary od szeroko rozmieszczonych w hepatocytach (rysunek 1E) przez ogniska regionalne, zgodne z organizacją sinusoidalną wątroby (rysunek 1F), oraz specyficzne oznakowanie elementów dróg wrotnych (rysunek 1G-I).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69154/69154fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Analiza glikomu MALDI-MSI wątroby myszy. (A) Schemat krytycznych metod w przygotowywaniu próbek, pozyskiwaniu i analizie danych. (B) Próbki widm mas uzyskanych z tego podejścia. Strzałki na czerwono pokazują regularnie rozmieszczone oligosacharydy pochodzące z glikogenu, różniące się o jeden monosacharyd glukozy. Strzałki na niebiesko oznaczają N-glikany, które występują w całym spektre. W wątrobie szczyty glikogenu są zazwyczaj bardziej widoczne, zwłaszcza przy wyższych wartościach m/z. (C) Przestrzenny rozkład maltoheksaozy (DP6) pochodzącej z glikogenu w wątrobie. (D) Rozkład długości łańcuchów glikogenowych w wątrobie. (E-G) Przestrzenne rozmieszczenie różnych gatunków glikanów związanych z azotem w wątrobie. (H) barwienie hematoksylyną i eozyną (H&E) dla skupionego obszaru centralnego, wraz z annotacjami anatomicznymi. (I) Odpowiadająca skupiona wstawka pokazująca przestrzenną lokalizację dodatkowego glikanu sprzężonego z N (Hex5dHex1HexNAc5) w elementach drogi wrotnej. Skala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69154/69154fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.</a>

Protokół ten opisuje kluczowe kroki umożliwiające rygorystyczne i powtarzalne pomiary zarówno glikogenu, jak i glikanów powiązanych z N za pomocą spektrometrii masowej.

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

The spatial organization of the glycome within tissues is key to the molecular basis for physiological function. The diverse and dynamic glycome is ...

Wykorzystujemy ekscytujące, nowe technologie oparte na spektrometrii mas do mapowania biomolekuł w próbkach biologicznych dla biologii przestrzennej. Główne obecne wyzwania to rigor i powtarzalność wynikająca z przygotowania próbki oraz ograniczenia w czułości i rozdzielczości. Na początek przygotuj jeden lub więcej kubków dializ, umieszczając je w wysokowydajnej wodzie chromatografii cieczowej lub HPLC na 15 minut.Dializuj 200 mikrolitrów izoamylazy w kubku dializującym o pojemności 500 mikrolitrów w 14,3 mililitrach wody HPLC przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez mieszania. Za pomocą pipety delikatnie usuń izoamylazę z kubka dializacyjnego i umieść ją w mikrowirówce o pojemności 1,5 mililitra. Po dializach zmierz całkowitą objętość roztworu izoamylazy.Na podstawie aktywności zapasowej wynoszącej 200 jednostek na mililitr oraz końcowej objętości oblicz całkowitą objętość potrzebną na trzy jednostki izoamylazy. Pipeta aliquotuje zawierające trzy jednostki izoamylazy do cienkościennych rurek PCR. Zamroz rurki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze do minus 80 stopni Celsjusza.Gdy chusteczki są przetworzone i gotowe, przygotuj komorę wilgotności, umieszczając pod metalowym stojakiem ręcznik papierowy nasączony wodą dejonizowaną. Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza dla wyrównania równowagi. Następnie napełnij zbiornik do parownika wodą z kranu na górę i ustaw timer na 60 minut, aby włączyć urządzenie.Umieść szkiełko tak, aby tkanka była skierowana do środka, aby uniknąć kontaktu z bokami i zapewnić skuteczne pobieranie antygenów. Wypełnij każdy slajd świeżo przygotowanym buforem citraconic. Sprawdź, czy para jest wydzielana z parownika.Włóż kopery do parownika i inkubuj je przez 30 minut. Następnie przełóż ulotki do kąpieli wodnej z dejonizacją na pięć minut. Wymień połowę bufora cytrakonowego w każdej korytce wodą dejonizowaną i pozwól jej stać jeszcze pięć minut.Usuń cały rozpuszczalnik i umyj szkiełka, dodając 100% dejonizowaną wodę do każdej korytki, a następnie ją zdejmuj. Na odwrocie każdego slajdu narysuj koło i trójkąt, aby zaznaczyć wewnętrzne standardowe lokalizacje. Nałóż jeden mikrolitr jednego miligramu na mililitr peroksydazy chrzanu na znak koła oraz jeden mikrolitr 10 miligramów glikogenu wątroby królika na mililitr na znak trójkąta.Rozmroź jedną probówkę 100 mikrogramów liofilizowanego peptydu N glikozydazy F oraz jedną probówkę zawierającą trzy jednostki izoamylazy przez 10 minut. Wiruj rurki z ciśnieniem około 2000 G przez pięć sekund. Pipeta 50 mikrolitrów wody dejonizowanej do każdej liofilizowanej rurki z PNGazą F.Po delikatnym wirowaniu wiruj rurkę z ciśnieniem około 2000 G przez pięć sekund. Pipetą włóż powstałe 50 mikrolitrów roztworu PNGazy F bezpośrednio do rurki izoamylazowej i dodaj wodę HPLC, aby całkowita objętość wyniosła jeden mililitr. Włącz stryskiwacz HTX M5 i otwórz oprogramowanie HTX M5 na podłączonym komputerze.Wyłącz pompę Knauer, naciskając przycisk stop po prawej stronie i włącz zewnętrzną pompę strzykawkową za pomocą przełącznika na tylnym panelu. W oprogramowaniu HTX, w zakładce Metody, wybierz odpowiednią metodę opryskiwania podwójnym enzymem. Przejdź do zakładki Temperatura i ustaw temperaturę dyszy natryskowej na 45 stopni Celsjusza.Otwórz zawór gazu azotu o ultrawysokiej czystości i upewnij się, że ciśnienie w spryskiwaczu jest ustawione na 10 funtów na cal kwadratowy. Używając świeżej strzykawki i igły, napełnij ją czterema mililitrami wody klasy HPLC. Po usunięciu bąbelków przepuść dwa mililitry wody przez około sześciocalowy odcinek linii spryskiwacza do zlewki odpadowej.Podłącz strzykawkę do przewodu spryskiwacza i przepuszczaj wodę przez pompę, uruchamiając system z przepływem 95 mikrolitrów na minutę przez pięć minut. Podczas płukania pompy strzykawkowej przyklej przygotowane szkiełka do lewego dolnego rogu podgrzewanej tacy za pomocą metalowej prowadnicy wyrównanej. W zakładce Próbka zdefiniuj parametry X i Y dla obszaru natrysku.Po pięciu minutach zatrzymaj pompę strzykawki i odłącz strzykawkę. Wciągnij powietrze do środka i przepchnij je przez linię spryskiwacza, aby usunąć resztki wody. Następnie załaduję przygotowany roztwór podwójnych enzymów do nowej strzykawki i mocno podłącz ją do pompy strzykawkowej.Przyłącz załadowaną strzykawkę zawierającą roztwór podwójnego enzymu do linii sprzatełu. Gdy temperatura dyszy natryskowej osiągnie 45 stopni Celsjusza, naciśnij Start w zakładce Cykl. Gdy pojawi się poproszenie o włączenie pompy Knauer, kliknij Nr Naciśnij Start na pompce strzykawkowej, aby rozpocząć rozpylanie enzymami.Pod dyszą natryskową umieść pusty szkieł, aby potwierdzić widoczne osadzanie enzymów. Gdy spray enzymatyczny będzie wyraźnie równomierny, kliknij "kontynuuj" w programie. Następnie załóż szklaną pokrywę na spryskiwacz i monitoruj równomierne nałożenie, dbając o równomierne zwilżenie na powierzchni zamka.Po zakończeniu cyklu natrysku naciśnij stop na pompce strzykawki. Wyłącz zawór gazu azotowego i kliknij Valve Load Confirm w oprogramowaniu. Inkubuj natryskane szkiełka w komorze wilgotności HTX w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, upewniając się, że są ustawione skierowane do góry.Po zakończeniu inkubacji przełóż preparaty do osuszacza i susz przez 15 minut. Oligosacharydy pochodzące z glikogenu oraz glikany sprzężone z azotem wykryto w szerokim zakresie ładunków głównych wątroby za pomocą laserowej desorpcji w spektrometrii masowej wspomaganej macierzą. Glikogen był szeroko zlokalizowany w wątrobocie, podczas gdy w naczyniach i tkance łącznej w drogach wrotnych był nieobecny.Przestrzenny rozkład glikogenu oraz rozkład długości łańcucha były mierzalne za pomocą MALDI MSI. Jeden z gatunków glikanu powiązanych z N był szeroko rozproszony w hepatocytach wątroby. Inny gatunek glikanu związany z N wykazywał bardziej regionalny wzór rozmieszczenia zgodny ze strukturą zatokową wątroby.Odrębny i powiązany glikan zlokalizowany specjalnie do elementów traktu portalnego. Barwienia histologiczne potwierdziły anatomiczne struktury drogi wrotnej, w tym żyłę wrotną, przewody żółciowe i tkankę łączną. Wykorzystujemy przestrzenne obrazowanie molekularne, aby odkryć komórkowe, metaboliczne i molekularne podstawy biologii komórkowej, fizjologii i patologii chorób.Te odkrycia umożliwią obrazowanie molekularne glikomu w różnych źródłach biologicznych i stanach chorobowych. Przyszłe badania pozwolą na wykrywanie różnych klas glikomów oraz zwiększą czułość i rozdzielczość do poziomu pojedynczych komórek.

spatial-molecular-imaging-of-the-glycome-using-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Poznaj przestrzenną analizę glikomu w tkankach wątroby przy użyciu spektrometrii mas MALDI MSI. Ta metoda umożliwia precyzyjne mapowanie glikogenu i glikanów N-związanych w hepatocytach.

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów