Name: Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem. Technika ta pozwala na badanie i naprawę deficytów wstrząsów neuronowych w neuronach Purkinjego myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Telly'emu Galiatsatosowi oraz Joshowi Stanfordowi z Sutter Instrument za pomoc w zakresie zapytań technicznych. Dziękujemy również Jan Dolzer za pomoc w inicjowaniu badań dPatch z dPatch z dynamicnym clampem.

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Obwody móżdżkowe pełnią funkcję w propriocepcji i kontroli motorycznej37,38, ale są również kluczowe dla złożonych zachowań, takich jak interakcje społeczne i przetwarzanie emocjonalne 39,40,41. Patologia struktury i funkcji móżdżku często wiąże się z ASD 42,43,44,45,46. Prosta architektura obwodów móżdżku47 oraz wyraźna rola móżdżku w patologii ASD sprawiają, że jest to atrakcyjny obszar mózgu do badania molekularnych i komórkowych czynników przyczyn deficytów behawioralnych z ASD, a także potencjalnych terapii. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa stanowi ważne narzędzie w tych badaniach, umożliwiając badaczom bezpośrednie badanie przyczynowych zależności między zmianami właściwości kanałów jonowych/przewodnictwa jonowych związanymi z ASD a wyładowaniem neuronów móżdżku. Chociaż metody dynamicznego zacisku są szczególnie odpowiednie do badań nad zmianami pobudliwości neuronów związanych z ASD, ta technika jest istotna do badania szeregu mechanizmów patologicznych wpływających na komórki z pobudliwymi błonami. Dodatkowo dynamiczny zacisk pozostaje doskonałym narzędziem do analizy złożonych procesów, dzięki którym neurony i komórki mięśniowe regulują i utrzymują odpowiednie wyładowanie potencjału czynnościowego.
Dokładne wykonanie eksperymentów z dynamicznym zaciskiem wymaga starannej kontroli parametrów technicznych. Eksperymentatorzy powinni szczególnie znać i rozumieć konsekwencje zmienności potencjału w opóźnieniu między próbkowaniem napięcia a wstrzykiwaniem prądu, często określanego jako jitter29, a także właściwości pasywne elektrod, ograniczenia zacisków przestrzennych oraz fizjologiczną wierność badanego przygotowania eksperymentalnego. Bettencourt i in. (2008)48 oraz Butera i in. (2001)29 wcześniej wykazali, że osiągnięcie wysokich częstotliwości próbkowania co najmniej 50 kHz jest kluczowe dla dokładnego odchwycenia szybkich przewodności jonowych, przy czym opóźnienia sprzężenia zwrotnego powinny być idealnie utrzymywane poniżej 25% (≤ 5 μs) interwału próbkowania. Nominalne częstotliwości próbkowania zgłaszane przez systemy komercyjne, szczególnie platformy oparte na Windows, mogą być mylące; dlatego często konieczne jest niezależne weryfikowanie wydajności, które jest szczegółowo omawiane przez Milescu i in. (2008)25 oraz Clausen i in. (2012)49. Należy również uwzględnić ograniczenia zacisków przestrzennych, szczególnie przy pracy z nienaruszonymi neuronami o złożonych morfologiach i właściwościach błon nieizopotencjalnych. Na przykład próba zastosowania (lub odjęcia) przewodności elektrodą położoną dalej od miejsca całkującego, takiej jak AIS, skutkuje niedokładnym odwzorowaniem efektów przyłożonej przewodności. Słaba (wysoka) rezystancja elektrod, niewystarczająca kompensacja pojemności i/lub brak korekty błędu potencjału złącza mogą również powodować błędne przedstawienie pomiarów napięcia (sygnału wejściowego), a w konsekwencji nieprawidłowe zastosowanie modelowanych przewodności jonowych50,51.
Tysiące modeli Markowa i HH są bezpłatnie dostępne dla badaczy w internetowych bazach danych takich jak ModelDB52 i Channelpedia53, wspieranych odpowiednio przez Human Brain Project oraz The Laboratory of Neural Microcircuitry. Bazy danych te obejmują modele przewodności synaptycznych, przewodności kanałów jonowych oraz modele neuronów oparte na przewodnością, które są głównie pisane w NEURON, MATLAB lub Python. Pliki baz danych zazwyczaj dostarczają niezbędnych równań modelowych oraz wszelkich drobnych informacji o typach komórek i eksperymentach, które wpłynęły na model.
Zarówno modele przewodności Markowa, jak i HH zawierają stany/zmienne przewodzące (symulujące kanały otwarte/aktywowane) i nieprzewodzące (symulowane kanały zamknięte). Jednak te typy modeli różnią się sposobem obliczania przewodności przy każdym próbkowanym napięciu, przy czym modele Markowa wymagają większej mocy obliczeniowej, ale dostarczają więcej szczegółów dotyczących właściwości bramkowych symulowanych kanałów. Na przykład w modelach HH stany przewodzące i nieprzewodzące są zmiennymi niezależnymi, z których każda jest determinowana przez kinetykę napięcia wejściowego i bramki odpowiedniego stanu54,55. W przeciwieństwie do modeli Markowa, modele HH nie symulują ani nie ograniczają przejść między stanami bramkowymi, takich jak przejście symulowanych kanałów z aktywowanego/otwartego stanu kinetycznego bezpośrednio do szybko inaktywowanego stanu kinetycznego w modelu przewodności sodowej25 z bramką napięciową. Dzięki temu modele HH są mniej złożone obliczeniowo54,55 i umożliwiają badaczom jednoczesne dodawanie wielu modeli HH o szybkim przewodzeniu, przy zachowaniu wysokich częstotliwości próbkowania i aktualizacji.
Modele stanów kinetycznych Markowa składają się z dyskretnych stanów kinetycznych, które mogą przewodzić lub nie przewodzić, a te stany są ze sobą powiązane w ustalonej topologii. W symulacjach modeli Markowa przewodność jest obliczana przy każdym próbkowanym napięciu na podstawie proporcji symulowanych kanałów zajmujących przewodzący stan kinetyczny. Proporcja symulowanych kanałów zajmujących każdy stan kinetyczny (w czasie) jest określana przez stałe szybkości, które są parametrami regulującymi tempo, z jakim zajętość stanu przechodzi z jednego stanu kinetycznego do drugiego. Stałe szybkości mają jednostki odwrotności sekund (s-1), reprezentujące prawdopodobieństwo przejścia na jednostkę czasu. W zależności od modelu, wartości stałej prędkości mogą zależeć od czynników dynamicznych, takich jak napięcie czy temperatura.
W modelach Markowa równania różniczkowe zwyczajne są używane do opisu czasowo zależnego zajęcia każdego stanu kinetycznego. Równania te określają, jak prawdopodobieństwo przebywania w każdym stanie ewoluuje w czasie, w oparciu o stałe tempa przejścia. Jest to reprezentowane przez macierz szybkości Q: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/69155/69155eq1.jpg" style="margin: auto;" />56. Jak omówiono powyżej, stałe szybkości przejścia (r), które określają ruch między stanami, mogą być kształtowane przez napięcie wejściowe (V) oraz parametry α i β, które odzwierciedlają kinetykę przewodności między napięciami. Równania te można opisać jako: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/69155/69155eq2.jpg" style="margin: auto;" />, i można je wizualnie przedstawić w postaci wykresów zawierających połączenia (stałe szybkości przejścia) do i z każdego stanu kinetycznego modelu 56,57,58. Pomocną dyskusję na temat rozwoju modeli Markowa i ich topologii można znaleźć w pracy Schoeninga i Silvy (2024)56.
Od momentu powstania dynamicznego zacisku w obecnej formie, w którym nieliniowe przewodnictwa jonowe są modelowane i stosowane (za pomocą elektrody wtryskującej prąd) do żywych komórek w czasie rzeczywistym19,59, metody i zasoby tej techniki ewoluowały i stają się coraz bardziej dostępne oraz opłacalne dzięki innowacjom takim jak tanie systemy oparte na mikrokontrolerach60 i darmowe, oprogramowanie open-source 23,25,26. Systemy komercyjne, takie jak dPatch firmy Sutter Instrument czy Cybercyte firmy Cytocybernetics, dodatkowo ułatwiają szybkie wdrażanie eksperymentów z dynamicznym zaciskiem poprzez zintegrowane rozwiązania sprzętowe i programowe27,61.
Wszechstronność dynamicznego zacisku umożliwia różnorodne zastosowania, w tym tworzenie wirtualnych synaps chemicznych i elektrycznych, osadzanie prawdziwych neuronów w sztucznych sieciach (lub odwrotnie) oraz dodawanie wirtualnych kanałów jonowych62. Co ważne, zależność napięcia, właściwości kinetyczne i amplitudy przyłożonej przewodności mogą być szybko regulowane, co pozwala badaczom bezpośrednio sprawdzić, jak skalowanie jednego lub więcej parametrów wpływa na wyładowanie potencjału czynnościowego i pobudliwość membrany31. Dzisiejsze systemy oferują wysokie częstotliwości próbkowania, umożliwiając dokładne stosowanie szybkich przewodności przejściowych i można je łatwo zintegrować z konwencjonalnym sprzętem elektrofizjologicznym60,63, co wzmacnia dynamiczny clamp jako idealną metodę pogłębiania naszej wiedzy o funkcji i zaburzeniach neuronów.

Wcześniejsze badania nad molekularnymi i komórkowymi czynnikami napędzającymi zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) często podkreślały dysfunkcje synaptyczne jako kluczowe dla patofizjologii tego zaburzenia 1,2. Liczne badania wykazały wzrost gęstości synaps pobudzających 2,3,4, upośledzone przycinanie synaptyczne5 oraz zmiany w białkach gęstości postsynaptycznej 6,7 w modelach ASD. Jednak najnowsze badania wykazały, że zmiany w wewnętrznej pobudliwości neuronów są również czynnikami napędzającymi patologię ASD. Na przykład transgeniczne modele myszy z ASD oraz linie komórkowe pochodzące od pacjentów wykazały upośledzoną generację potencjału czynnościowego w neuronachPurkinje 8,9,10 i korowych piramidalnych11, a także osłabioną pobudliwość dendrytyczną i integrację synaptyczną w podklasach korowych neuronów piramidalnych12. Channelopatie związane z mutacjami utraty funkcji w SCN2A, kodującym podjednostkę α pory kanału sodowego Nav1.2 tworzącego pory kanału sodowego (Nav), są obecnie dobrze znaną monogenową przyczyną ASD13 i wykazano, że powodują deficyty w wewnętrznej pobudliwości różnych klas neuronów centralnych 14,15,16,17. W miarę postępu tego typu badań ważne jest ustalenie związków przyczynowych między patogennymi zmianami przewodności jonowej a wpływem tych zmian na funkcjonowanie neuronów i obwodów. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa zapewnia skuteczne podejście do tego zadania. Sharp i in. (1992 i 1993)18,19 wraz z Robinsonem i Kawaiem (1993)20 początkowo opisali metody dynamicznego zacisku, w których symulowana nieliniowa przewodność jonowa, z właściwościami zależnymi od napięcia lub bez, jest wstrzykiwana/dodawana do żywych neuronów, co pozwala badaczom oceniać w czasie rzeczywistym, jak właściwości lub domniemane zmiany w przewodności jonowej zależnej od napięcia wpływają na wyładowanie neuronów21, 22.
Implementację eksperymentów z dynamicznym zaciskiem ułatwiły kilka bezpłatnie dostępnych systemów programowych, takich jak RTXI23, QuB 24,25 i StdpC26; Jednak najnowsze osiągnięcia uprościły dynamiczną implementację clamp w komercyjnych systemach plug-and-play, które umożliwiają opracowywanie, modyfikowanie i stosowanie przewodności modeli na jednym komputerze i w ramach jednego pakietu oprogramowania. Przedstawiamy protokoły umożliwiające wykonanie dynamicznego zacisku z użyciem systemu Sutter dPatch27 oraz przeprowadzamy badanie próbki, w którym testujemy, jak celowane delecje stwardnienia bulwiastego 1 (Tsc1)9, będącego powszechnym miejscem mutacji ASD28, wpływa na wewnętrzne wyładowanie neuronów Purkinieja móżdżku w wyniku zmian w ekspresji przewodności sodowej zależnej od napięcia8.

<table><tbody><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-500&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Kapilarne rurki szklane borocylikat o średnicy ściany 1,5 mm średnica 0,86 mm długość 10 cm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0793</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>CleanBench</td><td>TMC</td><td>63-9090E</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kompresjom VF-500-Z wibratomi&nbsp;</td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>https://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Dell OptiPlex 7080</td><td>Dolina</td><td>https://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffus</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>System wzmacniaczy dPatch</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-DPATCH</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>EMD Millipore</td><td>324626-25GM</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Chemical</td><td>7365-45-9</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Grzejnik liniowy</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P330-500&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>193.40620.3&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>K-glukonan</td><td>TCI Chemicals</td><td>G0040</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LinLab</td><td>Scientifica</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna LSE 6L</td><td>Corning</td><td>6783</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74804-12-9</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>012288.A9</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Model P-1000 Pipeta</td><td>Sutter Instrument</td><td>FG-P1000</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>MP Biomedicals</td><td>56001-37-7</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>J.T. Baker</td><td>02-004-220&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500&nbsp;</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Oprogramowanie okulistyczne</td><td>Digital Optics Limited</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-software</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Personna</td><td>60-0139-CTN</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Harfa slice</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>SliceScope Pro 3000</td><td>Scientifica</td><td>https://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Klej superglue</td><td>Loctite</td><td>8040-00-142-9193</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SutterPatch</td><td>Sutter Instrument</td><td>https://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatch</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td>Odczynnik</td></tr></tbody></table>

metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Dynamic Clamp Methods to Investigate Impaired Neuronal Excitability Associated with Autism

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wynika z szerokiego zakresu czynników genetycznych i środowiskowych. Chociaż liczne mutacje związane z ASD zakłócają rozwój lub plastyczność synaps, coraz więcej z nich zmienia ekspresję i funkcjonowanie kanałów jonowych zależnych od napięcia, co skutkuje deficytami w wewnętrznej pobudliwości neuronów. Nagrania z użyciem zacisków napięciowych całej komórki mogą być użyte do scharakteryzowania, jak mutacje związane z ASD wpływają na funkcjonowanie kanałów jonowych. Jednak eksperymenty te nie pozwalają bezpośrednio ocenić, jak zmieniona przewodność jonowa wpływa na wyładowanie potencjału czynnościowego neuronów. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa wypełnia tę lukę, umożliwiając wstrzykiwanie w czasie rzeczywistym zdefiniowanych przez użytkownika przewodności jonowych do żywych neuronów. Pozwala to na badania przyczynowe, jak zmiany właściwości kanału jonowego wpływają na aktywność elektryczną danego typu komórki. W tym artykule metodycznym opisujemy, jak wdrożyć dynamiczną elektrofizjologię zaciskową u dorosłych myszowych neuronów Purkinjego zarejestrowanych w warunkach fizjologicznych w ostro przygotowanych przecinkach mózgu móżdżku. Neurony Purkinje'ego są szczególnie istotnym modelem dla tych badań, ponieważ mają wewnętrzną zdolność do wywoływania powtarzalnych, wysokoczęstotliwościowych (20-100 Hz) potencjałów czynnościowych i są konsekwentnie powiązane z dysfunkcją obwodów móżdżku związaną z ASD. Skupiamy się na Tsc1, genie, którego mutacje związane z utratą funkcji należą do najczęstszych monogennych przyczyn ASD. W neuronach myszy Purkinjego delecja Tsc1 została również powiązana ze zmniejszoną ekspresją kanałów sodowych zależnych od napięć (Nav). Wykorzystujemy modele stanów kinetycznych Markowa do symulacji i reprodukcji właściwości przewodności Nav neurona Purkinie, a następnie stosujemy mechanizm dynamiczny do bezpośredniej oceny, jak zmiany przewodności Nav wpływają na wewnętrzne wyładowanie nienaruszonych neuronów Purkiniego w możdżku. Dostarczamy instrukcje i materiały do modyfikowania i strojenia modeli przewodności jonowej. Poprzez integrację modelowania przewodności jonowej, dynamicznego zacisku oraz konwencjonalnych technik patch-clamp, podejście to zapewnia potężne i elastyczne ramy łączące zaburzenia genetyczne z fizjologicznymi wynikami u neuronów istotnych dla ASD.

W prezentowanych eksperymentach stosujemy, za pomocą dynamicznego zacisku, modelowaną przewodność sodu zależną od napięcia (Nav) do dorosłych (6-7 tygodni) myszych neuronów Purkinjego w kształcie móżdżku, które są ostro izolowane w przysagittalnym kawałku móżdżku. Badania prowadzono na myszach typu dzikiego (kontrolnego) oraz myszach transgenicznych, w których rekombinacja Cre-loxP służy do selektywnego usuwania stwardnienia bulwiastego typu 1 (Tsc1) z neuronów Purkiniego w możdżku. Kompleks stwardnienia bulwiastego (TSC) to zaburzenie wielosystemowe spowodowane mutacjami utraty funkcji w TSC1 lub TSC2 32,28,33. Osoby z TSC są często diagnozowane z zaburzeniami padaczki, zaburzeniami poznawczymi oraz zaburzeniami ze spektrum autyzmu34,35. Myszy z neuroneurospecyficzną delecją Tsc1, określaną tutaj jako mut/mut Tsc1, wykazują kilka fenotypów zachowań związanych z ASD, w tym zaburzenia funkcji motorycznych, zachowań interakcji społecznych oraz wokalizacji, a także przesadnie powtarzalne zachowania 9,36. Tsc1mut/mut Wykazano również, że neurony Purkiniego mają osłabione wyładowanie potencjału czynnościowego (Rysunek 2A,B), co wiąże się ze znacząco zmniejszoną amplitudą prądu Nav (Rysunek 2C) oraz ekspresją kanału Nav w początkowych segmentach aksonu neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 8. Prądy nawigacyjne w neuronach Purkinie'ego mut/mut Tsc1 mają podobne właściwości kinetyczne i zależne od napięcia jak neurony Purkinjego typu dzikiego8. W tym transgenicznym modelu myszy mut/mut Tsc1 użyliśmy dynamicznego zacisku, aby sprawdzić, czy dodanie przewodności Nav do neuronów Purkinje mut/mut Tsc1 może uratować powtarzające się wyładowania. Następnie sprawdzamy, czy odejmowanie przewodności nawigacyjnej w dzikich neuronach Purkinjego powoduje podobne tłumienie w wyładowaniu neuronów Purkinie, jak mierzone w neuronach Purkinjego mut/mut Tsc1 (Rysunek 2B). Aby odejmować przewodność Nav wyrażoną natywnie, zastosowaliśmy przewodność Nav za pomocą dynamicznego zacisku; jednak polaryzacja przewodności jest odwrócona.
Model stanu kinetycznego Markowa (Rysunek 1A) używany do symulacji przewodności nawigacyjnej neuronu Purkinie'ego zawiera dziewięć stanów kinetycznych, z których osiem jest nieprzewodzących, oznaczonych jako zamknięte (C1, C2 i C3), inaktywowane-zamknięte (IC1 i IC2), szybko inaktywowane (IF1 i IF2) oraz wolno-inaktywowane (IS). Jest jeden stan kinetyczny otwarty/przewodzący (O)30,31. Stałe szybkości przejścia, pokazane pomiędzy oznaczonymi stanami kinetycznymi (Rysunek 1A), określają proporcję symulowanych kanałów/przewodności w każdym stanie kinetycznym. Napięcie błonowe wpływa na każdą stałą prędkości modelu. Symulowane prądy Nav generowane przez ten model (in silico) w symulowanych eksperymentach z zaciskiem napięciowym są pokazane (na czerwono) po prawej stronie prądów Nav mierzonych od ostro izolowanych neuronów Purkinje, które są pokazane na czarno (Rysunek 1A, poniżej). Komenda napięciowa wywołująca te symulowane (czerwone) i neuronowe (czarne) prądy nawigacyjne jest przedstawiona nad śladami prądu czarno. Należy zauważyć, że w komendzie napięciowym początkowy krok depolaryzacji (do 0 mV) skutkuje szybkim, przejściowym prądem sodowym do środka, który w symulowanym śladzie odbija kanały przechodzące z nieprzewodzących stanów zamkniętych do stanu kinetycznego otwartego, pozwalając na krótki prąd wejściowy przed nagromadzeniem kanałów otwartych w szybko inaktywowanych (IF1 i IF2) stanach kinetycznych. Ten krok napięcia depolaryzującego jest krótki (5 ms), a potencjał membrany jest następnie stopniowo przesuwany do pośredniego napięcia respolaryzowanego -45 mV, przy którym potencjał utrzymuje się przez 80 ms (rysunek 1A, niżej). Podczas tego etapu napięcia repolaryzacyjnego zauważalne jest ponowne wzrastanie prądu sodowego do wewnątrz, czyli składowej zwanej prądem sodowym (INaR). Podczas tego 80 ms kroku do -45 mV, INaR wykazuje powolny (w porównaniu do INaT) spadek amplitudy, ostatecznie osiągając stały stan prądu wewnętrznego, który jest trwałą składową prądu nawigacyjnego (INaP). Aktywacja modelowanego INaR (Rysunek 1A, dolny, czerwony) podczas repolaryzacji błony odzwierciedla symulowane kanały odzyskujące się ze stanów kinetycznych szybko inaktywowanych (IF1 + IF2) do stanu otwartego/przewodzącego. Z czasem (utrzymując się na -45 mV) część symulowanych kanałów zajmujących stan otwarty gromadzi się w pochłaniający wolno-inaktywowany (IS) stan kinetyczny, który jest odzwierciedlany podczas zaniku INaR, a część tych kanałów pozostaje w stanie otwartym/przewodzącym, odzwierciedlonym jako stała składowa prąduI NaP 30,31.
W reprezentatywnych eksperymentach/wynikach model przewodności Nav Markova (Rysunek 1A) został dodany do dorosłych neuronów Purkinjego w ostro izolowanych przecinkach móżdżku. Kreskówkowe przedstawienie tego eksperymentalnego układu przedstawiono na Rysunku 3A. Aby zastosować modelowaną przewodność nawigacji za pomocą dynamicznego wstrzyknięcia prądu zaciskowego, zastosowaliśmy system wzmacniaczy dPatch (pokazany na rysunku 3B), który posiada w pełni zintegrowaną konwersję analogowo-cyfrową (A/D) oraz cyfrowo-analogową (D/A). System ten obsługuje również transformacje sygnałów za pomocą zintegrowanych procesorów rdzeniowych ARM (zewnętrznych od PC) i posiada zintegrowany układ FPGA (field-programmable array), który umożliwia niemal natychmiastowe przetwarzanie sygnałów wejściowych i sprzężenia zwrotnego (wysyłanie sygnałów wyjściowych) do elektrody wtryskującej prąd27. Eksperymenty tutaj polegały na zastosowaniu (w dynamicnym zacisku) złożonego modelu przewodności Markowa, który udało nam się zastosować z aktualnymi częstotliwościami aktualizacji wstrzyknięcia do 500 kHz.
Dodanie symulowanej przewodności nawigacyjnej (400 nS) do neuronów Purkiniego mut/mut Tsc1 podczas nagrań prądowych zacisków bez przerw skutkowało wyraźnym wzrostem częstotliwości powtarzalnych wyładowań komórek (Rysunek 3C1, D1), co wskazuje, że dodanie przewodności Nav w tych komórkach może być wystarczające, by zrekompensować deficyty w pobudliwości neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1, choć nie przeanalizowaliśmy pełnego repertuaru deficytów zgłaszanych w Tsc1mut/mut pobudliwość neuronów Purkinje8. Jak wynika z reprezentatywnych śladów pokazanych na Rysunku 3C2 (górny), neurony Purkinie'ego typu dzikiego mają wewnętrzną zdolność do wystrzeliwania powtarzalnych potencjałów czynnościowych z wysokimi częstotliwościami. Za pomocą dynamicznego zacisku odjęliśmy modelowaną przewodność Nav od neuronów Purkinjego typu dzikiego, stosując modelowaną przewodność Nav z odwróconą (ujemną) polaryzacją (-400 nS). Odjęcie modelowanej przewodności Nav skutkowało natychmiastowym i oczywistym zmniejszeniem powtarzalnego wyładowania (rysunek 3C2, poniżej), co jest również zgodne z hipotezą, że zmniejszone prądy Nav mierzone w neuronach Purkinjego mut/mut Tsc1 przyczyniają się do osłabionych właściwości wyładowania mierzonych w tych komórkach8. W kilku neuronach Purkinjego typu mut/mut lub typu dzikiego Tsc1, te eksperymenty z dynamicznym zaciskiem, w których przewodność Nav była dodawana lub odejmowana, przynosiły spójne efekty na częstotliwość wyładowania. Dodanie przewodności Nav istotnie (P = 0,029) zwiększyło częstotliwość wyładowania neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 (Rysunek 3D1), a w neuronach Purkinjego typu dzikiego odejmowanie przewodności Nav znacząco zmniejszało częstotliwość wyładowania (Rysunek 3D2) (test Student w parach).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Konfiguracja modelu Markowa w oprogramowaniu do dynamicznego zaciskania. (A) Przedstawiono diagram przejścia stanów Markowa dla modelu, który odtwarza właściwości przewodności Nav mierzone w neuronach Purkinjego w móżdżku myszy30. Model ten obejmuje dziewięć stanów kinetycznych. Spośród nich 8 to stany nieprzewodzące: trzy zamknięte (C), dwa nieaktywowane-zamknięte (IC), dwa szybko inaktywowane (IF) oraz jeden wolno-inaktywowany (IS). Model obejmuje jeden otwarty (O) stan kinezyczny, który przewodzi. Pomiędzy sąsiednimi stanami kinetycznymi, połączenia/zajętość stanów przechodzące w czasie definiowane są przez stałe szybkości przejścia, pokazane jako S0-S15. Należy zauważyć, że każdemu stanu kinetycznemu przypisuje się również wartość numeryczną (czerwoną), która pozwala użytkownikom definiować model Markova i jego topologię stanu kinetycznego w macierzy stanu bramkowania (pokazanej w panelu C, opisanej poniżej). (B) Przedstawiono panele/interfejsy graficzne, z którymi użytkownicy pracują w SutterPatch Dynamic Clamp Editor. Należy zauważyć, że układ tych paneli Dynamic Clamp Editor nie jest zgodny z układem przedstawionym w oprogramowaniu dynamic clamp. Dodatkowo, nie wszystkie panele związane z Dynamic Clamp Editor są pokazane. (C) (górny panel) Przykład macierzy stanu bramkowania przedstawiono z wprowadzonymi zmiennymi odpowiadającymi topologii diagramu przejść stanów pokazanym w panelu A. Czerwone ramki w wierszu i kolumnie 7 macierzy stanu bramkowania, które odpowiadają otwartemu (O) stanowi kinetycznemu modelu. W kolumnie 7 wymienione są wszystkie stałe szybkości definiujące przejścia do stanu kinetycznego otwartego (O), a w wierszu 7 wymienione są wszystkie stałe prędkości określające przejścia wychodzące ze stanu kinetycznego otwartego (O). W tej organizacji macierz stanu bramkowego opisuje liczbę stanów kinetycznych, zmienne o stałej szybkości oraz topologię (powiązania między stanami kinetycznymi) modelu. W sekcji (D) pokazano panele/interfejsy użytkownika SutterPatch związane z obciążeniem modeli przewodności z dynamicznym klamstwem, wraz z interfejsami odpowiedzialnymi za tworzenie bieżących procedur zaciskowych. Interakcje użytkowników z tymi modelami opisane są w krokach protokołu 2.17-2.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Neurony Purkiniego mut/mut Tsc1 wykazują osłabioną pobudliwość błonową w porównaniu do kontrolnych typów dzikich. (A) Rejestry zacisków prądu w całej komórkach z neuronów Purkinjego typu dzikiego (górny,) oraz mut/mut (dolny, niebieski) ujawniają osłabione wyładowanie w komórce mutanta Tsc1. (B) Zmniejszone częstotliwości wyładowania w neuronach Purkiniego mut/mut Tsc1, w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, są spójne w różnych komórkach. Średnia (±± SEM) spontaniczna częstotliwość wyładowania neuronów Purkiniego mut/mutTsc1 jest istotnie niższa (P < 0,0001) w porównaniu z dzikimi komórkami typu (niesparowany test t Welcha; kontrola N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Pomiary prądów Nav za pomocą zacisku napięciowego w dorosłych neuronach Purkinjego wykazują±±, że średni szczyt szybkiego przepływowego prądu nawigacyjnego (INaT) jest znacząco obniżony w komórkach mut/mut Tsc1 w porównaniu do kontrolnych komórek typu dzikiego. (P = 0,007, RM dwukierunkowa ANOVA; kontrola dzikich typów: N = 6, n = 22, ; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, niebieskie kwadraty). Przykładowe rekordyI NaT, wywołane krokiem depolaryzacji -35 mV, są pokazane jako panel wpuszczony po prawej stronie panelu C. Dane wcześniej opublikowane w Brown i in.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69155/69155fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Wykorzystanie klamry dynamicznej do określenia wpływu przewodności jonowej na pobudliwość neuronów Purkinie. Zacisk dynamiczny polega na pobieraniu napięcia membranowego (za pomocą elektrody rejestrującej) oraz obliczaniu, na podstawie próbkowanego napięcia, prądu wyjściowego przewodności modelu. Obliczony prąd jest następnie przyprowadzany do komórki biologicznej za pomocą elektrody wstrzykniętej prądem. Panel (A) przedstawia to eksperymentalne ułożenie. Jeśli pobieranie próbki napięciowej jest wykonywane z odpowiednią częstotliwością, a opóźnienie (opóźnienie) między próbkowaniem napięcia a zastosowaniem obliczonego prądu jest minimalne, technika ta może być użyta do oceny, jak dodawanie lub odejmowanie modelowanej przewodności wpływa na wyładowanie neuronów i pobudliwość błon. (B) W eksperymentach reprezentatywnych nagrania dynamiczne z zaciskiem pozyskiwano za pomocą oprogramowania SutterPatch oraz systemu wzmacniaczy dPatch. dPatch to wzmacniacz patch-clamp, wyposażony w zewnętrzne procesory sygnału oraz w pełni zintegrowany cyfrowy procesor, co czyni go dobrze przystosowanym do dynamicznych nagrań zaciskowych (patrz Dyskusja). (C) Reprezentatywne zapisy zacisków prądu spontanicznego wyładowania neuronów Purkinje, przed i po użyciu klamry dynamicznej do dodania lub odejmowania 400 nS z modelowanej przewodności nawigacyjnej (przedstawionej na Rysunku 1A). W C1 (po lewej) zapisy pochodzą z neuronu Purkinje'ego mut/mut Tsc1 z osłabionym wyładowaniem. Dodanie przewodności nawigacyjnej 400 nS skutkuje wyraźnym wzrostem częstotliwości wystrzału tej komórki. Alternatywnie, w C2 zapisy pochodzą z neuronu Purkinje'ego typu dzikiego. W tym eksperymencie modelowana przewodność nawigacji jest stosowana z odwróconą polaryzacją (-400 nS), co skutkuje odejmowaniem przewodności nawigacyjnej i wyraźnym spadkiem częstotliwości powtarzalnego wystrzału. Rekordy dynamicznego wtrysku prądu zaciskowego, pokazane na szaro, są przedstawione poniżej zapisów potencjału czynnościowego (napięcia), pokazanych na czarno. (D) Wyniki tych eksperymentów z dynamicznym klamrem, przedstawione jako zmiany spontanicznej częstotliwości wyładowania po dodaniu przewodności Nav do neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 (D1, n = 3) lub odejmowaniu przewodności Nav od neuronów Purkinjego typu dzikiego (D2, n = 3), ujawniają spójne i istotne efekty dodawania lub odejmowania tej przewodności pomiędzymut/mut Tsc1 (P = 0,029) i typem dzikim (P = 0,029) = 0,031) komórek, odpowiednio (sparowany test t-Studenta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69155/69155fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Autism spectrum disorder (ASD) arises from a wide range of genetic and environmental factors. While numerous ASD-linked mutations disrupt synapse ...

dynamic-clamp-methods-to-investigate-impaired-neuronal-excitability

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy, jak wprowadzić przewodnictwo do neuronu dopaminergicznego rejestrowanego w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu szczura. Technika ta nazywa się dynamic clamp.

Zastosowanie przewodnictwa receptora NMDA w neuronach dopaminergicznych śródmózgowia szczura z wykorzystaniem techniki dynamicznej elektrodynamicznej kontroli prądu (dynamic clamp)

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Film pokazuje analizę elektrofizjologiczną neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych po ekspozycji na neurotoksyny. Traktowanie tych neuronów neurotoksynami botulinowymi zmniejsza częstotliwość spontanicznych miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych, potwierdzając zahamowanie transmisji synaptycznej.

Technika oceny hamującego wpływu ekspozycji na toksyny na miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC)

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Wieloelektrodowe nagrania patch-clamp stanowią skomplikowane zadanie. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób, poprzez automatyzację wielu etapów eksperymentu, można przyspieszyć proces prowadzący do jakościowej poprawy wydajności i liczby nagrań.

Wspomagany komputerowo wieloelektrodowy system krosówek

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Poznaj metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem. Technika ta pozwala na badanie i naprawę deficytów wstrząsów neuronowych w neuronach Purkinjego myszy.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Przeglądaj więcej filmów