Name: Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj protokół rozwarstwienia pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do analiz mikroskopowych. Technika umożliwia badanie morfologii mięśni i lokalizacji białek w czasie rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Gregory'emu Materze za udostępnienie allelu Smn E33 oraz za pomocne dyskusje na temat Smn. Autorzy dziękują Frankowi Schnorrerowi, Cornelii Schoenbauer, Manueli Weitkunat oraz Aynur Kaya-Copur za pomocne dyskusje i wsparcie. Autorzy doceniają centrum zapasowe w Bloomington za dostarczanie much. Prace te były wspierane przez początkowe środki z University of Missouri Kansas City (UMKC) School of Science and Engineering, Division of Biological and Biomedical Systems (MLS), UMKC Funding for Excellence Program (MLS) oraz UMKC Office of Undergraduate Research and Creative Scholarship (SF, MLS).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia procedurę sekcji Hemitorax dorosłych (Rysunek 1) i późnych poczwarek (48 h - 96 h APF) (Rysunek 3) oraz otwartą sekcję IFM w wczesnych punktach czasowych poczwarki (8 h - 48 h APF) (Rysunek 4). Protokół ten jest optymalny do zastosowań w immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół jest ilustrowany schematami i zdjęciami krok po kroku z procedury sekcji. Diagramy przeglądowe dodatkowo udostępniają protokół naukowcom nowym w dziedzinie Drosophila, a także studentom licencjackim i wczesnym stażystom. Przedstawiono reprezentatywne przykłady błędów związanych z utrwaleniem i przygotowaniem próbki, aby umożliwić użytkownikom protokołu odróżnienie artefaktów od prawdziwych fenotypów sarkomerów.
Najtrudniejszym krokiem w rozwarstwieniu hemitoraxu IFM jest przecięcie tułowia na pół (Rysunek 1I, J, L i Rysunek 3O). Ten krok wymaga czasu i praktyki, by go opanować. Dla większej stabilności podczas cięcia można przyłożyć poszczególne piersi na taśmę dwuprzylepną i wyciąć36, ale należy zachować ostrożność, aby nie wysychać IFM. Możliwe jest także cięcie od brzusznej strony klatki piersiowej, z grzbietową stroną skierowaną w dół, aby nowi użytkownicy mogli przetestować, które podejście jest najskuteczniejsze w ich ustawieniu. Cięcia powinny być wykonywane nowymi, ostrymi ostrzami, aby nie uszkodzić IFM, a ostrze powinno być wymieniane, gdy staje się. W tym protokole do czystego cięcia tułowia używa się mikrotomowych (kriostatowych) ostrzy, w przeciwieństwie do innych protokołów wykorzystujących igłę, kleszcze lub ostrze skalpela 24,32,36. Żyletki to kolejna opcja do czystego przecięcia klatki piersiowej na pół. Fiksacja jest również ważna przed przecięciem, ponieważ lekko utrwalona tkanka, choć stabilnie zachowana, może być "miękka" i trudniejsza do cięcia. Czas fiksacji to 30-60 minut, równoważność dostępności antygenów i sztywność tkanek ułatwiający cięcia, a można skrócić do 15 minut z doświadczeniem.
Jednym z ograniczeń preparatów hemitorax jest penetracja przeciwciał. Hemitoraki to grube próbki32, a najlepszej jakości mikrofotografie konfokalne pochodzą z górnych 10-20 μm IFM 42,58. Zbyt niskie stężenie detergentu lub zbyt krótki czas przepuszczania może prowadzić do słabego i nieregularnego zabarwienia. Przenikanie przeciwciał można również poprawić poprzez dłuższą (2-3 dni) inkubację pierwotnego przeciwciała. System dwufotonowy lub obiektyw o większym zasięgu roboczym również może zwiększyć głębokość obrazowania59. Jeśli eksperymentator musi obrazować pełną średnicę miowłókna IFM, należy rozważyć alternatywne podejście, takie jak mikrotom24,58 lub kriosekcja27 w płaszczyźnie strzałkowej.
Ważnym aspektem, który nie jest uwzględniony w głównym protokole, jest analiza danych obrazowych. Do analizy miofibr IFM na obrazach 10x lub 20x (rysunek 6A-D, rysunek 7A,B,E,F,I,J) STANDARDOWA ANALIZA OBEJMUJE OKREŚLENIE, CZY WŁÓKNA SĄ POŁĄCZONE ORAZ CZY MORFOLOGIA GRUBA MIOFIBRY JEST NIENARUSZONA37,38. Przykłady parametrów, które można ilościowo określić, w zależności od eksperymentu, to długość, szerokość, liczba, liczba dołączonych lub liczba rozdartych miofibrów37,60. Główną zaletą tego protokołu jest kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną oraz możliwość analizy morfologii sarkomeru i miofibrylu przy większych powiększeniach 60x lub 100x (Rysunek 6E-H, Rysunek 7C, D,G,H, K,L). Morfologia sarkomerów powinna być analizowana w próbkach wolnych od artefaktów technicznych (rysunek 6K-P). Wcześniej zdefiniowano wiele kategorii możliwych fenotypów miofibrylnych i sarkomerowych(60). Najczęściej długość i szerokość sarkomeru mierzy się albo poprzez narysowanie i zmierzenie linii od Z-disc do Z-disc w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, albo alternatywnie za pomocą jednego z kilku dostępnych narzędzi automatycznych 18,45,61. Ocenę morfologii sarkomeru można ulepszyć, dodając markery oznaczające Z-dysk lub linię M, albo grube lub cienkie filamenty 30,34,58. Dane te mogą być użyte do ilościowego opisu fenotypów miofibryli, miofibrylu i sarkomeru pomiędzy próbką kontrolną a testową przygotowaną przy użyciu tego protokołu sekcji.
Użytkownicy protokołu powinni być świadomi, że choć fiksacja zachowuje morfologię miofibry i sarkomeru, utrwalający, i ośrodek montażowy mogą powodować kurczenie się lub obrzęk tkanek oraz wpływać na pomiar parametrów morfologicznych45. Utrwalanie i odwodnienie glutaraldehydu niezbędne do mikroskopii elektronowej jest znane z kurczenia się średnicy sarkomeru43, natomiast włóknistość i gliceracja zwiększają średnicę sarkomeru 44,45. To zjawisko może stanowić podstawę różnic w parametrach sarkomerów w literaturze i podkreśla znaczenie uwzględniania próbek kontrolnych i testowych w każdym eksperymencie. IFM kontrolne i testowe powinny być przetwarzane jednocześnie w tych samych dla dokładnego porównania ilościowych parametrów sarkomerów.
Ten szczegółowy protokół ma na celu uczynienie rozbiorów IFM u dorosłych i poczwarek w zakresie immunohistochemii oraz mikroskopii fluorescencyjnej bardziej dostępną dla początkujących i zaawansowanych drosofilistów. Protokół ten może być dostosowany do stosowania z innymi owadami, a także do innych technik obrazowania, takich jak mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM), hybrydyzacja in situ fluorescencją pojedyncząłych cząsteczek (smFISH) czy transkryptomika przestrzenna. Połączenie potężnych narzędzi genetycznych Drosophila z mikroskopią fluorescencyjną daje wyjątkowe możliwości badania zachowanych zasad miogenezy i funkcji mięśni. Ponieważ IFM są również podatne na podejścia molekularne ibiochemiczne 26,27, przyszłe badania łączące fenotypy molekularne z morfologią mięśni, biologią komórek i funkcją zapewnią głębsze zrozumienie miogenezy i etiologii zaburzeń mięśniowych.

Zwierzęta mają setki mięśni, które kontrolują różne ruchy, od umożliwiania chodzenia, przez ułatwianie mowy, po chwytanie narzędzia. Aby wspierać tak szeroki zakres funkcji, mięśnie różnią się rozmiarem, przyczepem, zdolnością kurczliwym, metabolizmem i ekspresją genów1. Głównym obszarem w dziedzinie biologii mięśni jest zrozumienie, jak te różnice strukturalne i funkcjonalne powstają w trakcie rozwoju i jak są zmieniane w chorobie mięśni2. Skurcz mięśni jest napędzany przez sarkomery zbudowane z cienkich filamentów zawierających aktynę, zakotwiczonych w dysku Z, które przeplatają się z grubymi włóknami zawierającymi miozynę w dwubiegunowym, zakotwiczonymi na liniiM-3. Sarkomery są zorganizowane od końca do końca w miofibrilach, a ten regularny układ w mięśniach prążkowanych objawia się jako naprzemienne jasne i ciemne pasy pod mikroskopem4, co stanowi praktyczną wizualną metodę monitorowania zmian w montażu i organizacji sarkomerów. W połączeniu z genetyką i podejściami biochemicznymi, mikroskopia dostarczyła ważnych informacji na temat procesów komórkowych, takich jak regulacja transkrypcji, przetwarzanie RNA, metabolizm oraz mechanotransdukcja 5,6,7, które instruują i dopracowują rozwój oraz funkcję mięśni. Wiele z tych procesów komórkowych jest zakłóconych w ludzkich miopatiach i zaburzeniach nerwowo-mięśniowych 8,9, podkreślając znaczenie zrozumienia rozwoju mięśni, aby lepiej zrozumieć etiologię chorób mięśni. Postępy w inżynierii genetycznej, umożliwiające manipulację pojedynczymi komórkami oraz endogenne znakowanie białek10,11, w połączeniu z postępem technologicznym w pozyskiwaniu obrazów i rozdzielczości12,13, zapewniają ciągłe znaczenie mikroskopii dla badań mięśniowych. Systemy modelowe z jasnymi i łatwymi do wdrożenia protokołami do sekcji i przygotowania próbek mięśni są zatem cenne w dziedzinie mięśni.
Mięśnie pośredniego lotu (IFM) D. melanogaster są potężnym i dobrze scharakteryzowanym modelem do badania podstawowych zasad miogenezy8. IFM składają się z sześciu mięśni grzbietowo-podłużnych (DLM) na hemitoraksie, które tworzą się na larwalnych wzorcach mięśniowych, oraz siedmiu włókien grzbietowo-brzusznych (DVM), które powstają de novo podczas rozwoju poczwarki14. Ze względu na ich dostępność w pobliżu linii środkowej, wiele badań IFM koncentruje się na DLM, największym mięśniu dorosłych much obejmujących całą długość 1 mm tułowia15. Na początku poczwarkownictwa mioblasty IFM migrują ze swojej niszy na zawiasie dysku skrzydła do klatki piersiowej, gdzie łączą się, tworząc myorurki syncytialne16. Po przyczepieniu ścięgien około 24 godzin APF w temperaturze 27 °C, miofibry IFM stopniowo organizują cytoplazmę i cytoszkielet, kompaktowają się i rozpoczynają miofibrylogenezę od 30 do 32 h APF17. Do miofibrylów dodaje się nowe sarkomery, a włókna rosną, wypełniając tułów aż do około 48 godzin APF. IFM przechodzą następnie proces dojrzewania zgodny ze zmianami zarówno w transkrypcji, jak i splicingu, co sprzyja nabyciu właściwości metabolicznego i kurczliwego u dorosłych oraz aktywacji rozciągania18. Dorosłe muchy wylatują z przewarki w odległości od 90 do 100 godzin APF w 27 °C, a około 100 h APF (samice około 98 h APF, samce około 102 h APF) przy 25 °C19. IFM to wszechstronny i istotny system modelowy. Mogą być monitorowane na wszystkich etapach miogenezy, morfologicznie i funkcjonalnie różnią się od innych typów miofibr u muchy oraz korzystają z szerokiego wachlarza dostępnych narzędzi genetycznych i podejść do manipulacji 8,20. Mechanizm kurczliwy, podstawowa morfologia sarkomerów oraz wiele elementów strukturalnych są zachowane od much do kręgowców5, co umożliwia przeniesienie zasad miogenicznych z much na ludzi. Rzeczywiście, modele much chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak dystrofia miotoniczna, zanik ruchowy rdzenia kręgosłupa (SMA), miofibrylacje i aktinopatie, dostarczyły etiologicznych i terapeutycznych wglądów21,22. Co istotne, muchy doskonale nadają się do mikroskopii, analizując morfologię miofibry i sarkomeru w różnych obszarach miogenezy, od specyfikacji mioobszaru, przez miofibrylogenezę, aż po dojrzewanie i utrzymanie sarkomerów.
IFM Drosophila są wykorzystywane w mikroskopii od ponad czterech dekad, co znacząco przyczynia się do zrozumienia wzrostu i rozwoju mięśni8. W tym czasie protokoły rozcinania IFM były nieustannie adaptowane wraz z postępem technologii, co doprowadziło do szerokiego wachlarza protokołów prezentowanych na różnym poziomie szczegółowości, które są optymalne dla jednych, a suboptymalne dla innych technik obrazowania. Na przykład protokoły opracowane dla mikroskopii elektronowej obejmują silne warunki fiksacji, ultracienkie sekcjonowanie oraz barwienie kontrastowe metalamiciężkimi 3,23,24,25, ale nie są optymalne dla mikroskopii lekkiej. Protokoły opracowane do szybkiego rozkładania IFM z tułowia do zastosowań w testach biochemicznych lub analizach molekularnych26,27 tracą kontekst tkankowy i mogą zakłócać strukturę miofibryli, przez co są nieoptymalne dla podejść mikroskopowych. Metody sekcji opracowano do analizy mięśni larwalnych lub dorosłych mięśni brzucha20,28, ale nie są optymalne do izolacji nienaruszonych IFM. Metody obrazowania na żywo wymagają albo minimalnie inwazyjnych sekcji, albo specjalnych mediów, aby utrzymać tkankę IFM przy życiu podczas procesu obrazowania29,30, i nie obejmują etapów fiksacji niezbędnych do zachowania mięśni do immunohistochemii. Istnieje wiele protokołów dotyczących osadzania parafiny lub kriogenicznego przecięcia tkanek IFM, które są zgodne z barwieniem histochemii lub przeciwciałami 27,31,32, ale podejścia te zazwyczaj obejmują zamrażanie i odwodnienie tkanek, co może zmieniać ultrastrukturę mięśni i ograniczać rozpoznawanie niektórych antygenów przez przeciwciała pierwotne. Protokoły bezpośrednio ustalające IFM zachowują morfologię mięśni i ograniczają zmiany w konformacji antygenów i są pożądane w wielu eksperymentach immunohistochemicznych24. Jednak protokoły te są również skierowane do konkretnych zastosowań, na przykład protokołów dysocjujących IFM umożliwiających analizę pojedynczych miofibryli za pomocą fluorescencji, krioEM lub mikroskopii superrozdzielczej 20,33,34. Inne przykłady to protokoły polegające na rozcinaniu nienaruszonych włókien IFM z tułowia 32,35 lub generowaniu preparatów pełnościennych lub hemitoraksu 20,32,36, które umożliwiają analizę zarówno miofibr, jak i sarkomerów w nienaruszonym kontekście. Dla nowego użytkownika może być trudno przejrzeć się przez dużą liczbę istniejących protokołów, z których większość jest oparta na tekstie. Studenci i studenci naukowi skorzystaliby z szczegółowego protokołu sekcji IFM stosowanego w standardowych zastosowaniach immunohistochemii.
Artykuł zawiera serię protokołów dotyczących sekcji i przygotowania IFM D. melanogaster na etapach poczwarki i dorosłych dla podejść mikroskopii immunohistochemicznej. Podejście to zostało wykorzystane w ostatnich publikacjach śledzących funkcje rozwojowe białek wiążących RNA Bruno137 i Rbfox138 w całym okresie miogenezy IFM. Protokół zawiera szczegółowe ilustracje i obrazy krok po kroku, które prowadzą potencjalnych użytkowników przez rozwarstwienie hmitołówki IFM dorosłych i późnych poczwarek (48 h do 96 h APF), gdzie tułów jest przecięty wzdłuż linii środkowej, zachowując nienaruszoną strukturę miofibry. Ponadto protokół obejmuje otwarte rozdziały wczesnych stadiów poczwarki (8 h do 48 h APF), gdzie brzuszna część tułowia jest przecięta i podnoszona, podobnie jak otwieranie książki, aby odsłonić nienaruszone IFM przyczepione do grzbietowej naskórki. Dalsze etapy protokołu obejmują utrwalanie, barwienie i montaż próbek, a reprezentatywne dane pokazują, że to podejście jest kompatybilne z różnymi metodami fiksacji przygotowującymi tkanki do immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Przedstawione są reprezentatywne przykłady, aby pomóc nowym użytkownikom w identyfikacji powszechnych artefaktów sekcji. Protokół ten jest stosowany do analizy fenotypu rozwojowego IFM SmnE33, hipomorficznego allelu neuronu ruchowego przeżycia (Smn), używanego jako model muchy zaniku ruchowego rdzenia (SMA)21,39, w 26 h APF, 72h APF oraz u dorosłych IFM. Przedstawione tutaj dane dostarczają wglądu w specyficzną funkcję mięśniową Smn i podkreślają zastosowanie tego protokołu sekcji do badania rozwoju mięśni oraz etiologii chorób mięśni.

<table><tbody><tr><td>Naczynia do hodowli tkanek o średnicy 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td>60 mm, polistyren</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowiec (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa, wytrzymała</td><td>Amazon</td><td></td><td>12 cali. x 1000 stóp.</td></tr><tr><td>Czarne poduszki do rozcinania silikonu: proszek z węgla aktywnego</td><td>Millipore Sigma</td><td>C9157</td><td>Dostępne także w większości aptek</td></tr><tr><td>Czarne naczynia do rozcinania krzemu: Sylgard 184</td><td>Millipore Sigma</td><td>761036</td><td>Aby przygotować talerze do rozcinania krzemu, połącz składniki Sylgard w woreczku strunowym i dobrze wymieszaj. Dodaj proszek z węgla aktywnego (~200 mg) do Sylgard (~50 g), dobrze wymieszaj, odetnij róg worka, napełnij 60 mm misek do hodowli, usuń bąbelki końcówką pipety i utwardzaj przez noc. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kartonowa taca na slajdy, Research Products International Corp</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-136-7558</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, odwrócony mikroskop konfokalny Nikon AXR</td><td>Nikon</td><td></td><td><a href="http://www.microscope.healthcare.nikon.com/">www.microscope.healthcare.nikon.com/</a></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, Zeiss LSM 780 odwrócony konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>Komora do wychowu owadów Darwin (inkubator)</td><td>Fisher Scientific/Darwin Chambers</td><td>IN034</td><td>Inkubator kontrolowany światłem, temperaturą i wilgotnością</td></tr><tr><td>Talerz do rozcinania (czarne szkło)</td><td>Mikroskop Technik Diethelm</td><td>398011</td><td>Lymphbecken (miski do barwienia/zbiorniki limfatyczne), czarne szkło, 4x4 cm, z przezroczystą szklaną pokrywą</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #3</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>11231-30</td><td>Dumokel prosta końcówka 12 cm z końcówką 0,17 x 0,1 mm & nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>11252-20</td><td>Pinpsy o prostym końcówce inox 11 cm, klasy biologicznej z końcówką 0,05 x 0,02 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA (kwas egtazowy)</td><td>Millipore Sigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absolutny (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Glassglass Premium Fisherbrand (18 x 18 mm), slipy</td><td>Fisher Scientific</td><td>12548A</td><td>Szkło, kwadratowe, grubość #1 (0,13 - 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Glassglass Premium Fisherbrand (22 x 22 mm), pokrywki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12548B</td><td>Szkło, kwadratowe, grubość #1 (0,13 - 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Płytki hodowli komórek płaskiego dna (24-dołkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7200740</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopu fluorescencyjnego do rozwarstwiania, kamera Infinity8</td><td>Teledyne (Visual Dynamix)</td><td></td><td>6 megapikseli, w słabym świetle, monochromatycznie</td></tr><tr><td>Latać: Smn[E33]</td><td></td><td></td><td>Muchowe indy; dar Grzegorza Matery</td></tr><tr><td>Mucha: w[1118]</td><td>Centrum Stockowe Bloomington</td><td>RRID:BDSC_3605</td><td>Zapas muchowy</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td>Stopień biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Roztwór glioksalu (40% masy w H2O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>128465</td><td>&nbsp; To jest 40% roztworu bulwaryjnego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, Affinity Designer 2</td><td>Pokrewieństwo</td><td></td><td>https://affinity.serif.com/en-us/</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, Image J (Fidżi)</td><td>ImageJ2</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Szpilki owadzie</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>26002-10</td><td>Stal nierdzewna, średnica 0,1 mm (piny miniaturowe)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA12315A1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical (Fisher Scientific)</td><td>A452-4</td><td>Chill przy -20? Przed użyciem</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, matowane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-400</td><td>Powierzchnia pisania, nienaładowana, 75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, gładkie szkło</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td>Wstępnie oczyszczony, 75 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Łopatki mikrotomowe MX35 Ultra</td><td>epredia (Fisher Scientific)</td><td>3053835</td><td>Niski profil, 34 i g; kąt cięcia; Ostrza C35 feather 80mm sprawdzają się dobrze</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci, przezroczysty (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)</td><td>Amazon</td><td></td><td>0,4 fl. oz.</td></tr><tr><td>Zwykłe serum koziego</td><td>Millipore Sigma</td><td>S26-LITR</td><td></td></tr><tr><td>Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)</td><td>Midwest Scientific</td><td>H3D1020</td><td>24 obr./min, stałe; 8 x 6 cali. Peron z matą z wgłębieniami</td></tr><tr><td>Pędzel (Runda nr 0)</td><td>Amazon</td><td></td><td>Okrągły pędzel nr 0 lub podobny z dowolnego materiału plastycznego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanową (PBS): KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552-250GM</td><td>Przygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanową (PBS): KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662-500G</td><td>Przygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS): Na2HPO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763-500G</td><td>Przygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS): NaCl</td><td>Fisher Chemical (Fisher Scientific)</td><td>S271-1</td><td>Przygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247</td></tr><tr><td>Końcówki do pipety PR1MA (10 & micro; L)</td><td>Midwest Scientific</td><td>PR10XLRK-NS</td><td>Uniwersalny 10 & mikro; Końcówki pipety L</td></tr><tr><td>Końcówki do pipety PR1MA (1000 &; L)</td><td>Midwest Scientific</td><td>PR-1000RK-FL</td><td>Universal 1000 & micro; Końcówki pipety L</td></tr><tr><td>Końcówki do pipety PR1MA (200 & mikro; L)</td><td>Midwest Scientific</td><td>PR-200RK-NS</td><td>Universal 200 &micro; Końcówki pipety L</td></tr><tr><td>Rodamina-faloidyna</td><td>Invitrogen, sondy molekularne</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Taśma szkocka dwustronna</td><td>Szkocka/3M (Staples)</td><td>649280</td><td>Obie strony pokryte klejem, 0,5" x 7 jardów, dostępne u większości sklepów z artykułami biurowymi</td></tr><tr><td>Dihydrat fosforanu sodu (NaH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1131636</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie: GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td><a href="http://www.graphpad.com/">www.graphpad.com</a></td></tr><tr><td>Oprogramowanie: Infinity Analyze 7</td><td>Teledyne (Visual Dynamix)</td><td></td><td><a href="https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/">https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/</a></td></tr><tr><td>Oprogramowanie: Microscoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>chusteczki/ Kimtech Science Kimwipes Delikatne Wycieraczki Zadaniowe, 1 warstwa</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Standardowe chusteczki do tkanek</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AMMD</td><td>Plastikowa pipeta</td></tr><tr><td>Trition X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia Nauki Ścisłej</td><td>15000-00</td><td>Krawędź tnąca 3 mm, średnica grotu 0,05 mm, długość 8 cm</td></tr><tr><td>Vectashield z DAPI</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-2000</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield bez DAPI</td><td>Laboratoria Vector</td><td>H-1900</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1004070</td><td>Okręgi z papieru filtracyjnego, Grade 4, 70 mm</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny stereo mikroskop rozcinający z10</td><td>Visual Dynamix (Midwest Scientific)</td><td></td><td>http://www.visualdynamix.net/</td></tr><tr><td>Ergonomiczny stereo zoom mikroskop rozcinający z850</td><td>Visual Dynamix (Midwest Scientific)</td><td></td><td>http://www.visualdynamix.net/</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Dissection of Drosophila melanogaster Indirect Flight Muscles for Microscopy Approaches

Pośrednie mięśnie lotu (IFM) Drosophila melanogaster stanowią potężny model genetyczny do badania podstawowych zasad miogenezy. Mechanizm kurczliwy oraz wiele składników sarkomeru są zachowane od much po kręgowce, umożliwiając badanie procesów komórkowych od regulacji transkrypcji i przetwarzania RNA po metabolizm i mechanobiologię, które kierują i precyzyjnie dostosowują rozwój mięśni. Wiele z tych szlaków komórkowych jest zmienionych w ludzkich miopatiach, a badania IFM dostarczają istotnych informacji na temat molekularnej etiologii chorób mięśni. W szczególności muchy doskonale nadają się do mikroskopii, analizując morfologię i funkcję miofibry oraz sarkomeru w całym procesie miogenezy IFM, od specyfikacji mioblastów po tworzenie, dojrzewanie i utrzymanie miofibryli. Przedstawiono tutaj protokół do sekcji D. melanogaster IFM w punktach czasowych poczwarki i dorosłych dla podejść mikroskopowych. Przedstawiono ilustrowane protokoły do sekcji hemitorax późnych poczwarek i dorosłych IFM, a także do otwartej księgi rozwarstwiania wczesnych IFM poczwarek. Opisano procedury utrwalania, barwienia i montażu próbek oraz typowe artefakty rozcinania, a reprezentatywne dane pokazują kompatybilność sekcji IFM z różnymi odczynnikami fiksacyjnymi. Protokoły te są stosowane do badania hipomorficznego allelu SmnE33 neuronu przeżywalnego (Smn) wiążącego białko RNA, 26 godzin po utworzeniu poczwarki (APF), 72 h APF oraz u dorosłych IFM, dostarczając nowych wglądów w model zaniku ruchowego rdzenia (SMA) i ilustrując ogólną użyteczność tego protokołu. Ten szczegółowy protokół ułatwia dostęp do systemu modelu IFM oraz pozyskiwanie wysokiej jakości danych mikroskopicznych w celu badania zasad miogenezy.

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

The indirect flight muscles (IFMs) of Drosophila melanogaster are a powerful genetic model to explore foundational principles of myogenesis. The ...

Badamy rozwój mięśni, a w szczególności to, jak regulacja RNA przyczynia się do powstawania sarkomeru oraz funkcji specyficznej dla typu włókien u Drosophila melanogaster. Mięśnie lotu pośredniego są składane podczas rozwoju poczwarki. Aby wykonać ten proces in vivo, konieczne jest opracowanie i optymalizacja technicznie wymagających protokołów sekcji.Na początek umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem rozcinającym. Użyj plastikowej pipety, aby przenieść kroplę PBS na zamk. Za pomocą pędzla lub kleszczy przenosi próbkę Drosophila w małych grupach do kropli PBS.Następnie użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby usunąć głowę, skrzydła i odwłok, pozostawiając nogi przymocowane. Teraz delikatnie przenieś klatkę piersiową do 500 mikrolitrów roztworu fiksacyjnego w jednym dołku z 24-dołkową płytką z pomocą szczoteczki. Umieść płytę na nutatorze lub bujającym shakerze i ustabilizuj przez pożądany czas, zazwyczaj od 15 do 60 minut.Przy pipecie P1000 mikrolitrów usuń bufor z otworu. Umieść kroplę 0,05% PBS za pomocą Triton X-100 na szkiełku mikroskopowym pod stereoskopowym mikroskopem rozcinającym. Następnie użyj szczoteczki lub kleszczy, aby przenieść klatkę piersiową do kropli PBST.Ukierunkuj tułów tak, że tarcza skierowana jest ku górze i ustabilizuj ją między dwoma kleszczami Dumont 3. Następnie przesuń ostrze kriostatu przez tułów, aby naciąć tarczę. Następnie jednym płynnym, opuszczającym ruchem wzdłuż linii środkowej przetnij mięśnie klatki piersiowej, aby uzyskać hemisekcię i odsłonić mięśnie lotu pośredniego.Za pomocą kleszczy przenieś hemisekcję klatki piersiowej z preparatu mikroskopowego do 500 mikrolitrów 0,05% PBST do jednego dołka płyty 24-dołkowej do dalszego przetwarzania. Aby przeprowadzić rozwarstwienie pośrednich mięśni poczwarki, należy zebrać wiek przed poczwarkami do właściwego punktu czasowego na zwilżonym papierze filtracyjnym. W przypadku sekcji poczwarki hemitorax umieść pasek taśmy podwójnie przyklejonej do szkiełka mikroskopu pod mikroskopem stereo z powiększeniem 10X do 20X.W odpowiednim momencie użyj pędzla, aby przenieść poczwarki z papieru filtrującego na taśmę. Użyj pary 5 kleszczy, aby otworzyć przednią część osłony poczwarki i delikatnie usunąć operkulum. Ostrożnie rozcinaj wzdłuż grzbietowej strony osłony poczwarki i odklejaj ją w krokach od 1 do 2 milimetrów.Po uwolnieniu z poczwarki delikatnie przenieś poczwarkę do kropli PBS na drugim szkiełku mikroskopowym. Teraz użyj nożyczek sprężynowych Vanny, żeby usunąć odwłok. Za pomocą szczoteczki lub kleszczy przenieś główkę i tułów do 500 mikrolitrów roztworu fiksacyjnego do wgłębienia z płytą 24-dołkową.Po utrwaleniu i usunięciu roztworu fiksacyjnego przenieś klatkę piersiową do kropli 0,05% PBST na szkiełku mikroskopowym. Oddziel jeden tułów od reszty i skieruj go brzuszną stroną do dołu, stabilizując między szczypcami Dumont 3. Przesuń ostrze kriostatu przez tułów, aż błona podstawna i skórkowa zostaną rozcięte.Następnie jednym płynnym, opadłym ruchem wzdłuż linii środkowej przyciąć w dół, aby uzyskać hemisekcje tułowia i odsłonić pośrednie mięśnie lotu. Użyj pędzla lub kleszczy, aby przeprowadzić hemisekcje do 500 mikrolitrów 0,05% PBST w 24-dołkowej płycie do dalszego barwienia. Do otwartej sekcji mięśni lotu pośredniego, przenieś poczwarki do czarnej silikonowej misy wypełnionej PBS po wyjęciu z obudowy poczwarki.Używając kleszczy Dumont 5, delikatnie dociskaj rozcięte poczwarki do powierzchni talerza i włóż dwie igły owadzie przez odwłok każdej poczwarki, aby ułożyć je w linii. Używając nożyczek sprężynowych Vanna, rozciń błonę podstawy i przednią część głowy każdej poczwarki. Teraz włóż nożyczki do otworu i tnij wzdłuż boków poczwarki.Użyj kleszczy, aby podnieść i usunąć brzuszną część nożyczkami. Następnie usuwam mózg, sznur nerwowy brzuszny, tchawicę i jelita. Użyj pipety 200 mikrolitrów z przyciętą końcówką, aby delikatnie pipetować PBS nad tułowiem i usuwać pozostałe tłuszczowe ciała.Następnie użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby przyciąć linię środkową grzbietowej klatki piersiowej, tworząc dwa płatki zawierające pośrednie mięśnie lotu. Odetnij listki grzbietowego tułowia od odwłoka i przelej je do 300 mikrolitrów roztworu utrwalającego w czarnej szklanej misce za pomocą szczypiec Dumont 5. Po odpowiednim czasie użycia pipety do usunięcia utrwalacza i przemycia 500 mikrolitrami 0,05% PBST przed immunodawizacją.Po zakończeniu immunobarwienia wyciągnij mieszankę wtórną lub barwnikową. Następnie przemyj próbki cztery razy przez 10 minut w soli fizjologicznej z buforem 0,05% fosforanem z Tritonem X-100 w temperaturze pokojowej. Oznacz matowy obszar preparatu mikroskopowego numerem próbki lub danymi identyfikującymi, takimi jak data, genotyp, przeciwciało lub numer preparatu.Pipetować kroplę glicerolu na szkiełku mikroskopu, aby zabezpieczyć dystansy. Następnie na szkiełku mikroskopu umieszczone są dystansy pokrywy 1 w odległości około 1 centymetra. Teraz dodaj kroplę medium mocującego między dystansami.Usuń pipetą resztki bufora płukania i natychmiast przenieś próbki do medium montażowego. Używając kleszczy Dumont 5, uporządkuj próbki w nienakładające się rzędy i kolumny, z mięśniami lotu pośrednimi skierowanymi do góry. Ostrożnie dodaj 1 slip na próbki.Następnie wypełnij obszar próbki podłożem montażowym, aż wszystkie piersi zostaną zamknięte. Następnie użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić zarówno pokrywkę do próbki, jak i na dystansie. Morfologia sarkomeru została skutecznie zachowana przy 4% paraformaldehydu, ale zaobserwowano istotną różnicę w szerokości sarkomeru między paraformaldehydem a PBS w porównaniu do roztworu relaksującego.Utrwalanie metanolu zachowało struktury miofibry i sarkomerów, ale sarkomery były znacząco krótsze i cieńsze niż przy wiązaniu 4% PFA. Fiksacja glioksalu znacząco zmniejszyła szerokość sarkomeru w porównaniu do 4% paradehydu. Utrwalenie przez 15 lub 30 minut zachowało strukturę sarkomerów, ale sedemminutowe fiksowanie spowodowało niespójne morfologie.Struktura miofibrylowa mięśni pośrednich lotu wygląda na postrzępioną i rozdartą z powodu ostrzy lub ślizgania się łopatek. Kleszcze w bezpośrednim kontakcie z mięśniami powodowały wgłębienia lub rozciąganie, rozciągając sarkomery. Rozciąganie lub deformacja klatki piersiowej prowadziła do utraty dysku Z.Piłowanie włókien powodowało rozplątanie. 72 godziny po utworzeniu poczwarki i dorosłych stadiach mutantów SmnE33 brakowało sarkomerów, z obniżoną liczbą wiązek F-aktyny i gwiezdnych wybuchów. 26 godzin po utworzeniu puparium, SmnE33 i kontrolery wykazały podobne kable SmnE33 i sieci mesh.Otrzymaliśmy protokoły immunofluorescencji mikroskopii pośredniej mięśni lotu już 16 godzin po utworzeniu poczwarki, aż do późnego rozwoju poczwarki i stadium dorosłości. Nasz protokół pozwala nam analizować fenotypy molekularne i deficyty komórkowe w kontekście lokalizacji białek oraz struktury i funkcji mięśni, które zwykle prowadzą do deficytów behawioralnych.

dissection-drosophila-melanogaster-indirect-flight-muscles-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Przedstawiamy metodę ilościowego określania powierzchni mięśniowej, która jest pośrednią metodą określania masy mięśniowej u dorosłych Drosophila. Demonstrujemy zastosowanie naszej metodologii, analizując pośrednie mięśnie lotu w modelu Drosophila choroby dystrofii miotonicznej.

Optyczne oznaczanie obszaru mięśni w przekroju poprzecznym dorosłych mięśni lotu pośredniego Drosophila melanogaster

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

Poznaj protokół rozwarstwienia pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do analiz mikroskopowych. Technika umożliwia badanie morfologii mięśni i lokalizacji białek w czasie rozwoju.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Przeglądaj więcej filmów