Name: Wiszące krople Shrinky-Dink: prosty sposób na formowanie i hodowlę ciał zarodkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj prostą metodę formowania ciał zarodkowych z komórek macierzystych przy użyciu mikrostruktur PDMS. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę liczby komórek i redukuje pracochłonność w porównaniu z klasyczną metodą wiszących kropel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować CIRM za wsparcie tych prac. Linia komórkowa została hojnie przekazana przez dr. Andrasa Nagy’ego z Mount Sinai Hospital w Toronto, Ontario.

1. Wykonywanie formy Shrinky-Dink
<ol>
<li>Wydrukuj wybrany wzór na arkuszu shrinky-dink, używając drukarki o wysokiej rozdzielczości.</li>
<li>Wypal arkusz shrinky-dink w temperaturze 163° C przez około 10 minut lub do momentu pełnego skurczenia się i uzyskania regularnego kształtu.</li>
<li>Po ostygnięciu formy shrinky-dink zanurz ją w kąpieli z izopropanolu, aż cała powierzchnia zostanie ledwie przykryta.</li>
<li>Ostrożnie spryskaj formę acetonem i kilkakrotnie potrząśnij pojemnikiem. Dodaj więcej izopropanolu, aby wypłukać nadmiar acetonu i powtórz ten krok kilka razy, aż forma shrinky-mold będzie wyglądać na czystą.</li>
<li>Zanurz formę w wodzie destylowanej na 10 minut, aby wypłukać wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.</li>
<li>Oczyszczaj formę shrinky-mold powietrzem. Podgrzej ją ponownie przez około 5 minut w temperaturze 163° C. Pozwoli to utrwalić tusz i odparować pozostały rozpuszczalnik.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrootworów z PDMS
<ol>
<li>Przygotować mieszaninę PDMS i czynnika sieciującego w stosunku 10:1, a następnie energicznie mieszać przez kilka minut.</li>
<li>Umieścić formę shrinky-dink w małej płytce Petriego. Wlewać mieszaninę PDMS, aż jej poziom przekroczy powierzchnię formy o około 1/2 cm.</li>
<li>Umieścić płytkę w dzwonie próżniowym w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS.</li>
<li>Umieścić płytkę w piekarniku w temperaturze 70°C na noc.</li>
<li>Odciąć utwardzony PDMS od formy i przytwierdzić go do szkiełka przedmiotowego, stosując sam nacisk.</li>
<li>Odrzucić pierwszy chip mikrootworowy ze względu na obecność resztek tuszu w strukturze PDMS.</li>
<li>Powtórzyć tę procedurę, aby wytworzyć drugi chip, który będzie wolny od tuszu i będzie miał bardziej zdefiniowany kształt.</li>
<li>Oczyścić chip mikrootworowy za pomocą 70% roztworu etanolu. Umieścić go pod źródłem światła UV na 10 minut w celu sterylizacji.</li>
</ol>
3. Pułapkowanie komórek w mikrosodkach
<ol>
<li>Należy policzyć komórki i rozcieńczyć je w pożywce hodowlanej do pożądanej koncentracji (zależnie od liczby początkowych komórek w poszczególnych studniach). Na przykład, aby uzyskać około 10-15 komórek na studnię (średnia = 11, SD = 5.4, stopień załadowania = 93%), zastosowano koncentrację 8×104 komórek/ml. Przy koncentracji 17×104 komórek/ml można było stabilnie uzyskać od 25 do 35 komórek na studnię (średnia = 27.17857 SD = 7.7, stopień załadowania = 100%).</li>
<li>Należy ostrożnie umieścić chip z mikrostudniami w probówce wirówki o pojemności 50 ml zawierającej utwardzoną podstawę z PDMS.</li>
<li>Należy dodać około 2JDP ml zawiesiny komórkowej.</li>
<li>Wirować przez 5 minut przy 760 rpm i 4°C.</li>
<li>Odpompować nadmiar roztworu i ostrożnie przemyć mikrostudnie roztworem PBS 1X.</li>
<li>Umieścić chip z mikrostudniami w małej płytce Petriego, zachowując ostrożność podczas wyjmowania chipa z probówki wirówki.</li>
<li>Przemyć nadmiar komórek roztworem 1 X PBS.</li>
<li>Umieścić chip z mikrostudniami pod mikroskopem odwróconym, aby zweryfikować zamierzoną liczbę komórek w studni.</li>
<li>Inkubować mikrostudnie z komórkami w standardowych warunkach. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="Schemat mikroskopowy komórek; analiza rozkładu i struktury komórkowej." width="350" height="183" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek-01"></li>
</ol>
4. Inkubacja komórek
<ol>
<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem EB obowiązującym w laboratorium.</li>
<li>Powoli wymień medium, wprowadzając je od boku komory; unikaj niepokojenia komórki w mikrootworze.</li>
</ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Opracowaliśmy prostą, szybką i skalowalną metodę hodowli do wprowadzania określonej liczby komórek do mikrofabricated wells (wykonanych z folii Shrinky-Dinks) i ich utrzymywania w celu rozwoju ciał zarodkowych (embryoid bodies). Ostatecznie komórki te są łatwo dostępne do dalszych analiz i eksperymentów. Metoda ta jest dostępna dla każdego laboratorium i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, ponieważ eliminuje potrzebę stosowania fotolitografii. Możemy zmieniać rozmiar mikrootworów, a także koncentrację komórek na otwór,...

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa materiału</td><td>Typ</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td></tr><tr><td>Folia termokurczliwa Shrink-Dink</td><td>Materiał</td><td>K&amp;amp;B Innovations</td><td>D300-10A</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Materiał</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P-4</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma</td><td>P4417</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Odczynnik</td><td>R and D systems</td><td>314-BP-010</td></tr><tr><td>Knock-Out DMEM (KO DMEM)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td></tr><tr><td>Penn-Strep</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td></tr><tr><td>Nieessentialne aminokwasy (NEAA)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td></tr><tr><td>D-merkaptoetanol (BME)</td><td>Odczynnik</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę (LIF) {ESGRO 106 jednostek}</td><td>Odczynnik</td><td>Chemicon</td><td>ESG1106</td></tr><tr><td>Drukarka</td><td>Narzędzie</td><td>HP</td><td>Laser Jet 2420d</td></tr><tr><td>Piec</td><td>Narzędzie</td><td>Yamato Scientific</td><td>DP-22</td></tr><tr><td> Dla pożywki do mESC (protokół laboratorium McCloskey): (dla całkowitej objętości pożywki: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamina: .5ml; 1ml NEAA: .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Rozcieńczony BME: 50ul; 100ul (Dodać 35ul sterylnie przefiltrowanego BME do 5ml PBS i wysterylizować za pomocą filtra strzykawkowego. Utylizować po 2 tygodniach. Końcowe stężenie w roztworze wynosi .1mM) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

krople wiszące typu shrinky-dink: prosty sposób formowania i hodowli ciał embrioidalnych

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Ciałka zarodkowe (EB) są agregatami embrionalnych komórek macierzystych. Najczęstszą metodą tworzenia tych agregatów jest metoda wiszącej kropli, wymagające podejście polegające na pipetowaniu dowolnej liczby komórek do płytek z dołkami. Interakcje między komórkami macierzystymi, wymuszonym bliski kontakt, sprzyjają powstawaniu EB. Ponieważ pożywka w każdym z dołków musi być codziennie wymieniana ręcznie, metoda ta jest pracochłonna.
Ponadto, ponieważ parametry środowiskowe, w tym interakcje międzykomórkowe, oddziaływania czynników rozpuszczalnych, pH oraz dostępność tlenu mogą być funkcjami wielkości ciał embrioidalnych (EB), populacje komórek otrzymane z tradycyjnych kropli wiszących mogą się znacząco różnić, nawet jeśli były hodowane w identycznych warunkach. Niedawne badania wykazały, że początkowa liczba komórek tworzących agregat może mieć istotny wpływ na różnicowanie komórek macierzystych. Opracowaliśmy prostą, szybką i skalowalną metodę hodowli, pozwalającą na wprowadzenie precyzyjnie określonej liczby komórek do mikrowytrawionych studni i ich utrzymanie w celu rozwoju ciał embrioidalnych. Ostatecznie komórki te są łatwo dostępne do dalszych analiz i eksperymentów. Metoda ta jest dostępna dla każdego laboratorium i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Demonstrujemy tę metodę poprzez tworzenie ciał embrioidalnych przy użyciu czerwonej fluorescencyjnej linii komórkowej myszy (129S6B6-F1).

Przedstawiamy prostą i szybką metodę ładowania określonej liczby komórek do mikrofabrykowanych studni oraz ich utrzymywania w celu rozwoju ciał embrionalnych.

Krople wiszące typu Shrinky-Dink: prosty sposób formowania i hodowli ciał embrioidalnych

Ciała embrionalne (EB) to agregaty embrionalnych komórek macierzystych. Najczęstszym sposobem tworzenia tych agregatów jest metoda wiszącej kropli, która jest pracochłonnym...

Ciałka embroidalne są agregatami embrionalnych komórek macierzystych. Najbardziej powszechnym sposobem tworzenia tych agregatów jest metoda wiszącej kropli. Jest to pracochłonne podejście polegające na pipetowaniu określonej liczby komórek do płytek wielodołkowych.Proces ten jest pracochłonny, ponieważ pożywka oraz każda płytka wielodołkowa muszą być wymieniane codziennie w sposób ręczny. Co więcej, niedawne badania wykazały, że początkowa liczba komórek tworzących agregat może wpływać na różnicowanie komórek macierzystych. W przypadku tej metody nie ma możliwości wcześniejszego określenia liczby komórek.W tym filmie przedstawiamy sposób na prosty i szybki załadunek różnej liczby komórek do mikrofabrykowanych studni w celu rozwoju ciał embrionoidalnych. Jestem Jonathan Pagan z laboratorium Michelle K w School of Engineering na University of California Merced, a ja jestem Jesus Luna, również z laboratorium K. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia ciał embrionoidalnych w mikrofabrykowanych studniach przy użyciu wirówki.Procedura ta obejmuje następujące etapy: wykonanie urządzenia mikroprzepływowego, załadowanie komórek macierzystych oraz karmienie komórek macierzystych. Przejdźm

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dropy zawieszone Shrinky-Dink: Prosty sposób tworzenia i uprawiania ciał zarodkowych

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w ciała zarodkowe z wykorzystaniem metody wiszących kropli.

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film pokazuje proces generowania kulek neuronów za pomocą techniki hodowli wiszącej kropli. W wiszących kroplach komórki przemieszczają się w kierunku dołu, samoorganizując się w trójwymiarowe struktury tworzące kule neuronów, które można wykorzystać do badań neurobiologicznych.

Rozwijanie kulek neuronalnych przy użyciu techniki hodowli wiszącej kropli

Film pokazuje różnicowanie się embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) do ciał embrionalnych (EB) metodą wiszącej kropli. Po zawieszeniu mESC w wiszących kroplach i inkubacji, komórki agregują się, tworząc EB, które są dalej różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą pożywki różnicującej uzupełnionej kwasem retinowym (RA).

Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy metodą wiszącej kropli

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film prezentuje wykorzystanie techniki bocznego miękkiego oświetlenia światłem w celu poprawy wizualizacji gołym okiem ciał embrionalnych, ułatwiając tym samym ich manipulację i transfer podczas hodowli organoidów mózgowych. Wyjaśnia konfigurację miękkiego oświetlenia światłem, metody zmian w pożywce i transferu ciała zarodka, a także procedurę indukowania różnicowania neuronalnego w ciałach embrionalnych w celu rozwoju organoidów mózgowych.

Technika optymalizacji hodowli organoidów mózgowych przy użyciu bocznego oświetlenia miękkim światłem

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Protokół ten generuje organoidy nerkowe w ciągu dwóch tygodni. Powstałe w ten sposób organoidy nerkowe można hodować w dużych kolbach obrotowych lub wielodołkowych magnetycznych płytkach mieszających w celu równoległego testowania leków.

Uproszczona metoda generowania organoidów nerkowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Poznaj prostą metodę formowania ciał zarodkowych z komórek macierzystych przy użyciu mikrostruktur PDMS. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę liczby komórek i redukuje pracochłonność w porównaniu z klasyczną metodą wiszących kropel.

Krople wiszące typu Shrinky-Dink: prosty sposób formowania i hodowli ciał embrioidalnych

Przeglądaj więcej filmów