Name: Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Poznaj automatyczną kontrolę jakości RNA-seq dla biologów bez doświadczenia bioinformatycznego. Ten protokół integruje narzędzia R do niezawodnej oceny danych transkryptomicznych przed analizą ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie techniczne ze strony Bioinformatics Core Facility na katedrze biologii systemów JLU Giessen oraz zapewnienie zasobów obliczeniowych i wsparcia ogólnego przez centrum usług BiGi (grant BMFB 031A533) w ramach de. NBI network. Prace przedstawione tutaj zostały sfinansowane przez grant Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) BE2547/24-1 dla A.B., a także jesteśmy wdzięczni za wsparcie Uniwersytetu Justusa Liebiga w Giessen z Niemiec.

<ol><li>Kivivirta, K. I., Herbert, D., Roessner, C., De Folter, S., Marsch-Martinez, N., Becker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+gynoecium+morphogenesis+uncovers+the+chronology+of+gene+regulatory+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of gynoecium morphogenesis uncovers the chronology of gene regulatory network activity.</a> Plant Physiol. 185 (3), 1076-1090 (2021).</li>
<li>Hohenfeld, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+infected+cassava+root+transcriptomics+reveals+candidate+genes+for+root+rot+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of infected cassava root transcriptomics reveals candidate genes for root rot disease resistance.</a> Sci Rep. 14 (1), 10587(2024).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+transcriptomic+information+unravels+the+mechanisms+of+improved+drought+tolerance+by+drought-priming+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Integr+Agric%22%5BJournal%5D)">Time-course transcriptomic information unravels the mechanisms of improved drought tolerance by drought-priming in wheat.</a> J Integr Agric. 24 (8), 2902-2919 (2024).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28 (11), 1530-1532 (2012).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+Quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: Quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li>
<li>Zhou, Q., Su, X., Jing, G., Chen, S., Ning, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-QC-chain%3A+Comprehensive+and+fast+quality+control+for+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-QC-chain: Comprehensive and fast quality control for RNA-seq data.</a> BMC Genomics. 19 (1), 144(2018).</li>
<li>Deshpande, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+data+science%3A+From+raw+data+to+effective+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-seq data science: From raw data to effective interpretation.</a> Front Genet. 14, 997383(2023).</li>
<li>Li, D., Zand, M. S., Dye, T. D., Goniewicz, M. L., Rahman, I., Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+RNA-seq+differential+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An evaluation of RNA-seq differential analysis methods.</a> PLoS One. 17 (9), e0264246(2022).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2025).</li>
<li>Kassambara, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKassambara%2C+A+%22fastqcr%3A+Quality+control+of+sequencing+data%22">fastqcr: Quality control of sequencing data</a>. , https://rpkgs.datanovia.com/fastqcr/index.html (2023).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastp%3A+An+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Wang, W., Luo, J. D., Carroll, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+W+%22Rfastp%22">Rfastp</a>. , https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rfastp.html (2025).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer-Verlag. New York. https://ggplot2.tidyverse.org (2016).</li>
<li>Shi, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShi%2C+W+%22Rsubread%22">Rsubread</a>. , https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html (2025).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory Biosci. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+sequencing+depth+on+transcriptome+profiling+in+human+adipose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of sequencing depth on transcriptome profiling in human adipose.</a> PLoS One. 8, e66883(2013).</li>
<li>Schurch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+biological+replicates+are+needed+in+an+RNA-seq+experiment+and+which+differential+expression+tool+should+you+use%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">How many biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and which differential expression tool should you use.</a> RNA. 22 (6), 839-851 (2016).</li>
<li>Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+differential+expression+studies%3A+More+sequence+or+more+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq differential expression studies: More sequence or more replication.</a> Bioinformatics. 30 (3), 301-304 (2014).</li>
<li>Deschamps-Francoeur, G., Simoneau, J., Scott, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+multi-mapped+reads+in+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Handling multi-mapped reads in RNA-seq.</a> Comput Struct Biotechnol J. 18, 1569-1576 (2020).</li>
<li>Seppey, M., Manni, M., Zdobnov, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BUSCO%3A+Assessing+genome+assembly+and+annotation+completeness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">BUSCO: Assessing genome assembly and annotation completeness.</a> Methods Mol Biol. 1962, 227-245 (2019).</li>
<li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Jakość analiz różnicowej ekspresji genów zależy w dużej mierze od dwóch czynników: liczby odczytów zsekwencjonowanych w każdej próbce i replikacji16 oraz liczby replikacji na próbkę17,18. Tutaj przedstawiamy przyjazny dla użytkownika pipeline Rup, aby określić liczbę odczytów odpowiednich do kwantyfikacji ekspresji genów w każdym replikacie. Różne metryki pozwalają badaczom zrozumieć, dlaczego repliki wykazują niskie przypisane liczby odczytów oraz identyfikować problemy w korelacji próbek. Chociaż Rup został opracowany do oceny jakości próbek RNA-seq roślin, jest równie odpowiedni dla innych organizmów eukariotycznych, nie wymagając dalszych korekt dla próbek nieroślinnych (Plik uzupełniający 1).

Pierwszy krok Rup określa całkowitą liczbę odczytów przed i po przycięciu odczytów. Liczba zsekwencjonowanych odczytów decyduje o liczbie wykrywalnych genów, a jeśli liczba odczytów jest zbyt niska, wiele genów różnicowo wyrażanych pozostanie niewykrytych. Znaczna część odczytów odrzuconych podczas procesu przycinania jakości i filtrowania może wskazywać na degradację RNA, co może prowadzić do niedoszacowania ekspresji genów o wysokiej degradacji. Jednak to, czy próbka może być użyta do zastosowań w dalszych etapach, zależy od organizmu docelowego i celu badania. Na przykład, aby uchwycić ekspresję większości genów roślinnych, z naszego doświadczenia potrzebne jest 30 do 50 milionów odczytów, podczas gdy dla grzybów wystarcza tylko 10 milionów. W związku z tym Rup nie będzie definiował progów jakości wykluczających problematyczne próby, lecz dostarczał miar do identyfikacji różnorodnych problemów, które mogą się pojawić.

Drugi etap (jakość mapowania) ocenia dokładność i wiarygodność wyrównania odczytu do genomu referencyjnego, określając ich przydatność do dalszych analiz. Nie wszystkie odczyty sekwencjonowane mogą być używane do obliczeń obfitości genów; odczyty, które nie są zgodne z genomem lub transkryptomem, albo odwzorowują się na wiele miejsc w genomie, są wwiększości przypadków ignorowane i nie przyczyniają się do ogólnej liczby odczytów. Wyniki drugiego etapu potoku można wykorzystać do zrozumienia, dlaczego odczyty nie są używane w obliczeniach obfitości. Duża liczba niezmapowanych odczytów może wskazywać na skażenie podczas ekstrakcji RNA (np. przez patogeny roślinne lub roślinożerne) lub niepełny genom referencyjny. Niekompletne modele genów genomu referencyjnego mogą skutkować dużą liczbą odczytów "brak cech". Znaczna część wielokrotnie mapowanych odczytów może być spowodowana dużą liczbą genów rRNA w bibliotece, co wskazuje na niewystarczające usunięcie rRNA podczas procesu przygotowania biblioteki sekwencjonowania (jeśli wielokrotnie mapowane odczyty rzeczywiście pochodzą z rRNA, można je dalej analizować, dostarczając plik adnotacji rRNA do potoku, który automatycznie oblicza liczbę możliwych odczytów rRNA).

Trzecim, równie ważnym wskaźnikiem jakości jest korelacja między replikacjami tej samej próby. Zazwyczaj korelacja między replikacjami tej samej próby powinna być wyższa niż korelacja między replikacjami różnych próbek. Niska korelacja między replikacjami może wskazywać na dużą zmienność biologiczną między replikacjami, wysokie podobieństwo między próbkami/warunkami/tkankami, inne efekty partii, a nawet zamianę próbek lub błędne oznakowanie. Rup oblicza korelacje parowe między wszystkimi próbkami i tworzy grupową mapę cieplną korelacji próbek. Dodatkowo na próbkach można wykonać analizę głównych składników (PCA), aby zidentyfikować możliwe efekty wsadowe, które należy uwzględnić w dalszych analizach. Chociaż efekty partii można skorygować w analizach dalszych, może być lepiej usunąć problematyczne próbki, jeśli zmierzona różnica jest zbyt duża.

Materiał wejściowy ma bezpośredni wpływ na jakość sekwencjonowania: pobieranie próbek tkanek, ekstrakcja RNA oraz przygotowanie biblioteki to kluczowe kroki minimalizujące problemy z jakością RNA-seq. Utrzymuje się stabilne warunki, jeśli to możliwe, na przykład poprzez stosowanie komór wzrostowych. Środki zwalczania szkodników powinny być przeprowadzane terminowo, ponieważ do pobierania próbek należy wybierać wyłącznie zdrowe osoby. Zaleca się również pobieranie próbek tego samego dnia i/lub o tej samej porze, aby zmniejszyć zmienność transkryptomu okołodobowego. Dostępnych jest wiele zestawów do ekstrakcji RNA, a wybór odpowiedniego zestawu dla gatunku docelowego może poprawić jakość mRNA. Protokoły przygotowania biblioteki powinny zawierać kroki wzbogacania RNA poliA+ w celu zminimalizowania frakcji rRNA.

Rup może być stosowany jako początkowy krok kontroli jakości w różnicowej analizie ekspresji genów. Ta kontrola jakości jest wymagana z kilku kluczowych powodów, ponieważ zapewnia jakość danych wejściowych (identyfikuje repliki/próbki niskiej jakości, może ustalać progi jakości dla głębi odczytu i szybkości mapowania) oraz identyfikuje problemy techniczne, takie jak błędy sekwencjonowania, efekty wsadowe czy błędne oznakowanie. Jeśli wejście RNA jest odpowiedniej jakości, Rup może pomóc poprzez przycinanie odczytów niskiej jakości lub identyfikację błędnie oznakowanych próbek. Jednak Rup nie jest w stanie zrekompensować niskiej jakości wejściowego RNA. W przypadku niskiej jakości danych RNA lub błędnych sekwencjonowania może być konieczne ponowne pobranie próbek, dostosowanie protokołu ekstrakcji RNA i/lub powtórzenie sekwencjonowania. To samo dotyczy próbek z dużą częścią niezmapowanych odczytów, które mogły być spowodowane skażeniem. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że nie wszystkie ekstrakcje RNA można po prostu powtórzyć ze względu na brak dostępności materiału. W tym przypadku nie nadają się do niektórych dalszych zastosowań: próbki z niską liczbą odczytów pojedynczych mapowanych nie powinny być analizowane w analizach różnicowej ekspresji genów, ale nadal zawierają informacje do analizy obecności transkrypcji. W takim przypadku brak transkrypcji w tkankach/leczeniu/warunkach nie może być brany pod uwagę przy analizie i ilościowym określeniu obfitości transkryptów.

Rup wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Na przykład nie testuje bezpośrednio degradacji RNA, ponieważ przed przygotowaniem i sekwencjonowaniem biblioteki wymagane są bezpośrednie pomiary integralności RNA. Jednak w repozytorium tego potoku znajduje się skrypt do identyfikacji degradacji RNA z wykorzystaniem modułów RSeQC geneBodyCoverage.py i tin.py. Ponadto Rup nie testuje treści GC ani długości transkrypcji. Rozmiar genomu referencyjnego jest obecnie ograniczony do 4 Gb, a według naszego doświadczenia moduł mapowania odczytów zawyża odczyty wielokrotnie mapowane w poliploidach, co ilustruje Plik Uzupełniający w porównaniu mapowania odczytu na haploida z wersjami diploidalnymi E. californica, dlatego preferowanym wejściem dla tego pipeline'u jest genom haploidalny. Jakość wyjścia Rup w dużej mierze zależy od jakości genomu referencyjnego i adnotacji, tak że niepełna lub silnie fragmentowana sekwencja genomu może prowadzić do przeszacowania liczby odczytów niemapowanych. Co więcej, niekompletne adnotacje modeli genu prowadzą do przeszacowania liczby nieprzypisanych odczytów. Kompletność i duplikację sekwencji genomu oraz adnotacji genu można wywnioskować za pomocą narzędzi takich jak BUSCO20.

Rup jest samodzielnym narzędziem dla wszystkich początkowych kroków kontroli jakości, niezbędnych w eksperymentach RNA-seq. W przeciwieństwie do RSeQC i RNA-SeQC, wstępne przetwarzanie surowych odczytów sekwencjonowania nie jest wymagane. Analiza jakości sekwencjonowania nie może być przeprowadzona za pomocą RNA-SeQC, a heatmapy korelacji próbek nie są obliczane przez RSeQC i RNA-SeQC (Tabela 1). Ponadto wyjście normalizacyjne jest w FPKM w RSeQC, a wizualizacja wyników nie jest standardem wszystkich modułów w RSeQC i RNA-SeQC. W związku z tym w dwóch alternatywnych narzędziach nie testuje się kilku problemów kontroli jakości, takich jak niska liczba odczytów, wysoki udział przyciętych odczytów oraz identyfikacja replikowanych wartości odstawających. Porównanie Rup, RSeQC i RNA-SeQC jest dostępne w Pliku Uzupełniającym 1. Ponadto Rup może być używany jako uzupełnienie RNA-SeQC lub RSeQC, na przykład posortowane pliki BAM wytworzone przez ten pipeline mogą służyć jako dane wejściowe dla tych narzędzi.

Obecnie Rup jest zoptymalizowany pod niewielką liczbę próbek, ale najbardziej czasochłonne kroki, takie jak przycinanie jakości i mapowanie odczytu, można obliczyć precom, na przykład w klastrze komputerowym lub infrastrukturze chmurowej. Dla genomów większych niż 4 GB jest to obowiązkowe, ponieważ nakładnik Rsubread jest ograniczony do genomów mniejszych niż 4 Gb. Adnotacja rRNA wykonywana jest za pomocą barrnap, który identyfikuje wysoce zachowane geny rRNA. Według naszego doświadczenia, adnotacja genu rRNA nie wymaga kompleksowości, ponieważ nawet jeśli brakuje niektórych nieprawidłowych genów rRNA, ogólny przegląd obecności rRNA w zbiorze danych jest wystarczający do oceny jakości zbioru. Przyszłe wersje Rup mogą przejść na inną metodę mapowania, jak narzędzie pseudo-wyrównania salmon21, aby skrócić czas działania. Ponadto do Rup można dodać więcej metod normalizacji i korekty, takich jak błędy GC lub długości.

Podsumowując, Rup dostarcza niezbędnych informacji, aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność analizy danych RNA-seq. Ten pipeline kompleksowo raportuje główne metryki jakości RNA-seq i generuje pliki wyjściowe do bezpośredniego wykorzystania w dalszych analizach. Został zaprojektowany jako samodzielne narzędzie dla badaczy z minimalną wiedzą bioinformatyczną do oceny jakości danych z zakresu sekwencjonowania podstawowego za pomocą intuicyjnej wizualizacji.

Eksperymenty transkryptomiki (RNA-seq) kompleksowo badają sygnatury transkrypcyjne kształtujące fenotypy. To podejście stało się niezastąpione w genetyce molekularnej roślin, aby identyfikować pojedyncze lub współekspresyjne geny oraz procesy biologiczne zaangażowane na przykład w rozwoju, interakcjach patogenów roślin czy odporności na stres abiotyczny1, 2, 3. Najnowsze osiągnięcia w technologii RNA-seq zwiększyły specyficzność i umożliwiły wykrywanie różnych izoform i wariantów w rozdzielczości pojedynczej zasady, umożliwiając identyfikację wariacji sekwencji od większych indel do polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP). Dane uzyskane przez RNA-seq charakteryzują się szerokim zakresem dynamicznym, ułatwiającym wykrywanie zarówno bardzo obfitych, jak i słabo eksprimowanych transkryptów, i wymagają odpowiednich warunków eksperymentalnych dla spójności. Ponadto zbiory danych RNA-seq są duże, a więc wymagające analizy i przechowywania obliczeniowo, co wymaga efektywnego zarządzania danymi i rozległych zasobów obliczeniowych. RNA-seq wymaga wysokiej jakości danych wejściowych na każdym etapie pracy, ponieważ słabości na każdym etapie mogą się propagować i zaburzać wyniki. Słaba integralność RNA lub problemy techniczne podczas przygotowań bibliotecznych prowadzą do stronniczości i obniżenia dokładności. Parametry uzyskiwania wysokiej jakości surowych odczytów mogą się różnić w zależności od obiektów sekwencjonowania nowej generacji (NGS).
Według naszego doświadczenia zalecamy używanie wyłącznie RNA o liczbie integralności RNA (RIN) powyżej 7, co wskazuje na w dużej mierze nienaruszoną strukturę mRNA, jako wejścia do przygotowania biblioteki RNA-seq. Do pomyślnego sekwencjonowania wymagane jest około 2 μg całkowitego RNA przy stężeniu 50–200 ng/μL dla standardowych protokołów przygotowania biblioteki. Czystość RNA powinna być potwierdzona przez stosunek OD260/280 między 1,8 a 2,1 oraz OD260/230 większy niż 1,5 za pomocą spektrofotometru. Niewystarczająca głębokość sekwencjonowania, niskie tempo mapowania lub niedopasowanie do genomu referencyjnego mogą dodatkowo zakłócać ekspresję genów i kwantyfikację splicingu. Ponadto niewystarczające projektowanie eksperymentalne, takie jak brak rozróżnienia między próbkami różnych tkanek lub zabiegów oraz duża zmienność między replikacjami, może wprowadzać szum i zmniejszać powtarzalność. Chociaż wiele laboratoriów rutynowo analizuje transkryptomy, rygorystyczne kontrole jakości pierwszych kluczowych kroków analiz często nie są podawane lub mogą być całkowicie nieobecne w publikacjach. Może to prowadzić do nadinterpretacji wyników uzyskanych na podstawie analizy transkryptomu, a w konsekwencji do wyników niepowtarzalnych.
Przedstawiamy tutaj workflow do kontroli jakości początkowych kroków wymaganych do wysokiej jakości analiz transkryptomu profili mRNA w celu pomiaru zmian transkrypcyjnych. Naszym celem jest umożliwienie biologom laboratoryjnym z ograniczoną wiedzą z zakresu bioinformatyki oceny ich podstawowych danych transkryptomicznych. Rup (Rysunek 1) jest dostępny dla badaczy zaznajomionych z podstawową wiedzą o R. Wykonanie przedstawionego tutaj workflow pozwoli badaczom uzyskać szczegółowe zrozumienie ich danych pierwotnych, w tym potencjalnych ograniczeń do dalszej analizy. Z naszej wiedzy brakuje praktycznego procesu oceny danych pierwotnych transkryptomów w połączeniu z wytycznymi pozwalającymi rozróżnić dane wysokiej od niskiej jakości.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69253/69253fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przepływ pracy w potoku kontroli jakości RNA-seq in silico . Pliki wejściowe do kontroli jakości pochodzą z danych RNA-seq wygenerowanych podczas sekwencjonowania materiałów zakładowych, a także z publicznie dostępnych zbiorów danych. Dostarczony potok R ocenia jakość sekwencji za pomocą trzech głównych podejść: jakości sekwencjonowania, jakości mapowania oraz jakości replikacji. Obliczane są różne metryki jakości, a wyniki statystyczne wizualizowane są za pomocą popularnych pakietów R, takich jak ggplot2 i pheatmap (np. wykresy słupkowe i mapy ciepła). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69253/69253fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Wcześniej zgłaszane potoki ewaluacyjne wymagały wstępnie przetworzonych danych (np. odczyt wyrównania jako pliki .bam), nie obejmują wszystkich wskaźników lub nie są już utrzymywanew 4,5,6. Zaletą przedstawionego tutaj przepływu pracy jest jego kompleksowość poprzez konsolidację najczęstszych problemów kontroli jakości w jednym procesie. Ponadto podajemy przykłady wysokiej jakości danych odpowiednich do wszystkich zastosowań analizy downstream, ale także przykłady danych niskiej jakości, oraz omawiamy ich konkretne ograniczenia w dalszej analizie. Kilka wcześniej opublikowanych raportów opisuje cel narzędzi analizy RNA-seq oraz przedstawia porównawcze oceny ich wydajności 7,8. Jednak standardy kontroli jakości RNA-seq i raportowania metodologicznego nie są standaryzowane i pogarszają powtarzalność oraz biologicznie istotne interpretacje eksperymentów transkryptomicznych.
Rup integruje standardowe, wysokiej jakości narzędzia, analizę kontroli jakości oraz wizualizację wyników. Rup wymaga surowych odczytów sekwencjonowania oraz annotowanego genomu jako wejścia i działa na Mac OS, Linux oraz "Windows Subsystem for Linux" (WSL) na systemach Windows. Integruje narzędzia do oceny jakości sekwencjonowania i ilościowo określa odkładanie odczytu do genomu, uwzględnia pomiar zawartości rRNA w próbkach oraz oferuje korelację próbek do oceny korelacji replikacyjnych. Dane testowe zostały uzyskane za pomocą laserowej mikrosekcji centralnej tkanki merysty dwóch różnych stadiów gatunku rośliny Eschscholzia californica, protokołu ultra-niskowejściowego do przygotowania biblioteki, i zsekwencjonowanego na Novaseq 6000.

<table><tbody><tr><td>fastqcr</td><td>R</td><td>0.1.3</td><td></td></tr><tr><td>FUJITSU ESPRIMO D958 Desktop</td><td>FUJITSU</td><td></td><td>pipeline został opracowany i przetestowany na Ubuntu Linux 24.02 (32 Gb RAM)</td></tr><tr><td>getopt</td><td>R</td><td>1.20.4</td><td></td></tr><tr><td>ggplot2</td><td>R</td><td>3.5.2</td><td></td></tr><tr><td>MacBook Pro&nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td>pipeline był testowany na maxOS 15.4.1 (16 GB RAM)</td></tr><tr><td>mapa pheatmap</td><td>R</td><td>1.0.13</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>4.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Reshape2</td><td>R</td><td>1.4.4</td><td></td></tr><tr><td>rfastp</td><td>Bioconductor</td><td>1.16.0</td><td></td></tr><tr><td>rsamtools</td><td>Bioconductor</td><td>2.22.0</td><td></td></tr><tr><td>rsubread</td><td>Bioconductor</td><td>2.20.0</td><td></td></tr></tbody></table>

rup (rna-seq benchmark assessment pipeline) – kontrola jakości eksperymentów masowych rna-seq u eukariontów

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Quality Control for Bulk RNA-seq Experiments in Eukaryotes

Nowoczesne podejścia w molekularnej nauce o roślinach często wymagają eksperymentów RNA-seq w całości, na przykład do śledzenia globalnych zmian w transkryptomach po zabiegach lub identyfikacji kluczowych elementów szlaków regulacyjnych. W konsekwencji różnorodne dziedziny nauk o roślinach opierają się na wysokiej jakości i powtarzalnych danych RNA-seq w zakresie rozwoju nauki. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że wiedza o zakresie i stosowanie miar kontroli jakości w zbiorach danych RNA-seq często są niewystarczające. Wprowadzamy tutaj Rup (RNA-seq assessment assessment pipeline) do kontroli jakości danych RNA-seq objętości, do późniejszych analiz ekspresji genów, które są samodzielne i łatwo przydatne dla biologów laboratoryjnych z podstawową wiedzą o R. Rup pomaga rozróżnić dane sekwencjonowania wysokiej jakości, odpowiednie do dalszych eksperymentów ekspresji genów, od tych, które nie nadają się do dalszej analizy. Rup obejmuje testy na kilka często spotykanych problemów, takich jak niewystarczające liczby odczytów lub mapowania, identyfikacja zanieczyszczeń, ilościowa identyfikacja frakcji rRNA w całkowitych danych RNA-seq, testy podobieństwa replikacyjnego, wykorzystanie rzeczywistych danych do demonstracji oraz oferowanie intuicyjnej wizualizacji. Rup oferuje zestaw narzędzi do identyfikacji niedociągnięć eksperymentalnych przed standaryzowaną analizą transkryptomową, co poprawia jakość danych zarówno dla poszczególnych badaczy, jak i dla całej dziedziny. Zwiększa to zaufanie do masowej analizy danych RNA-seq i stanowi podstawę dla przyszłych wytycznych definiujących minimalne kryteria kontroli jakości, poprawiając tym samym wiarygodność i przejrzystość opublikowanych danych RNA-seq. Dane z rozbicia i testów są dostępne w https://github.com/oliverrupp/rup.

Potok jest w pełni zaimplementowany jako skrypt R i był testowany na systemach Linux i Mac OS. Użytkownicy Windows mogą korzystać z Windows Subsystem for Linux (WSL). Kod i dane testowe są dostępne jako repozytorium GitHub: https://github.com/oliverrupp/rup. Dane sekwencjonowania są dostępne w ramach projektu ENA EBI PRJEB96400.
Dziesięć próbek zostało sztucznie utworzonych z dwóch rzeczywistych próbek, aby zilustrować różnorodne problemy, które mogą wystąpić podczas kontroli jakości masowego RNA-seq z wykorzystaniem Rup do analizy. Próbka s2_r1 została zaprojektowana tak, aby wykazywać niską całkowitą liczbę odczytów, próbka s2_r2 zawiera dużą część odczytów niskiej jakości do odrzucenia w procesie przycinania. s2_r3 próbki obejmuje dużą część odczytów rRNA, a s2_r4 próbki zawierają odczyty zanieczyszczeń, które nie dopasowały się do genomu referencyjnego. Nazwy próbek s1_r5 i s2_r5 zostały zamienione, aby zilustrować niską korelację replikacji.
Sekcja protokołu 2 umożliwia identyfikację próbek o niskich liczbach odczytów przed lub po przycięciu (Rysunek 2). Wykres słupkowy pokazuje niższą wartość odczytu w próbkowej s1_r1 zarówno przed, jak i po przycięciu. Tutaj początkowa liczba odczytów była niska. Niska liczba odczytów próbek s1_r2 po przycięciu sugeruje dużą liczbę sekwencji adapterów, błędów sekwencjonowania, sekwencji primerów, rozciągnięć poli-A/T, które zostały usunięte podczas procesu przycinania. Degradacja wejściowego RNA może również zmniejszyć liczbę wysokiej jakości odczytów.
Sekcja protokołu 3 identyfikuje problemy w przypisaniach odczytu. Rysunek 3 przedstawia podwyższoną liczbę odczytów wielomapowanych w próbie s2_r3 (zielono), a także wysoką liczbę odczytów rRNA. Zanieczyszczenie s2_r4 próbki widoczne jest po dużej części odczytów nieprzypisanych do genomu referencyjnego (różowy). Odczyty te nie korelują z rRNA, lecz z sekwencjami organizmu niebędącego celem. Rysunek 4 przedstawia ogólne problemy związane z niską liczbą przypisanych odczytów w transkryptomach. W próbkach o niskim wskaźniku odczytów przypisanych unikalnie do genomu referencyjnego (s2_r1 do r4) tylko około jednej trzeciej genów przypisano więcej niż 100 odczytów, podczas gdy w pozostałych próbkach około połowa genów należy do tych klas. Odczyty genów o bardzo niskiej ekspresji mogą nie być znalezione w próbkach s2_r1 r4, dlatego analiza porównawcza ekspresji z użyciem tych próbek będzie bardzo niewiarygodna i należy jej unikać.
Sekcja protokołu 4 może być użyta do identyfikacji replikowanych wartości odstających. Replikacje tej samej próbki/warunku/tkanki powinny wykazywać wyższą korelację między sobą niż replikacje z innych próbek/warunków/tkanek. Rysunek 5 przedstawia korelację heatmapę dwóch próbek (S1 i S2) z pięcioma replikacjami każda. Dendrogramy na górze i z boku wykresu pokazują dwa skupiska z pięcioma replikami w każdej gromadzie. Lewy klaster zawiera cztery repliki próbki 1 i jedną replikę próbki 2 (s2_r5), prawy klaster zawiera cztery repliki próbki 2 oraz jedną replikę próbki 1 (s1_r5). W takim przypadku, gdy nazwy próbek s1_r5 i s2_r5 są zamieniane z powrotem, każdy klaster zawiera wszystkie replikacje jednej próbki, co może wskazywać na błąd w etykietowaniu replikacji. Inne powody, dla których replikacje nie grupują się razem, mogą być brak rozróżnienia między próbkami/stanami/tkankami lub skupianie replikacji wyłącznie ze względów jakościowych. To drugie może wystąpić, gdy wszystkie replikacje o wyjątkowo niskiej liczbie odczytów lub te o wyjątkowo wysokiej liczbie odczytów po przycięciu i mapowaniu tworzą klaster.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69253/69253fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Przykładowa mapa ciepła korelacji. Mapa korelacji próbek opiera się na logariatucie2 przekształconych wartości TPM i pokazuje dwa odrębne klastry po pięć próbek każda. Oczekuje się, że repliki biologiczne/techniczne będą wykazywać wyższą korelację między sobą niż te z innych tkanek/terapii. Lewy klaster zawiera cztery repliki próbki 1 i jedną replikę próbki 2 (s2_r5), prawy klaster zawiera cztery repliki próbki 2 oraz jedną replikę próbki 1 (s1_r5). Pojedyncze repliki należy sprawdzić pod kątem możliwej wymiany próbek lub efektów wsadowych, aby wyjaśnić ich klasteryzację na mapie ciepła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69253/69253fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Tabela 1: Porównanie pipeline'ów oceny jakości RNA-seq. Szczegółową analizę można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69253/69253_Table 1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Wybór parametrów i odniesień. Analizy pokazują wpływ wyboru parametrów i odniesień na ogólne wyniki QC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69253/20250912_JoveManuscript_SupplementalFile.docx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Modern approaches in molecular plant science often require bulk RNA-seq experiments, for example, to track global changes in transcriptomes upon ...

Opracowaliśmy innowacyjne narzędzia bioinformatyczne, które upraszczają, automatyzują i integrują analizę danych z eksperymentów o wysokiej przepustowości. Korzystamy z sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, zaawansowanego oprogramowania bioinformatycznego oraz zaawansowanej infrastruktury obliczeniowej, aby umożliwić systematyczną analizę biologiczną. Na początek zainstaluj wszystkie wymagane pakiety R za pomocą menedżera pakietów Bioconductor.Stwórz folder źródłowy, aby uporządkować pliki wejściowe do analizy. Dodaj sekwencję genomu referencyjnego w formacie FASTA jako ReferenceGenome. FA do tego folderu.Dodaj plik adnotacji modelu genu o nazwie ReferenceAnnotation. Przejdź do tego samego folderu. Opcjonalnie można dołączyć adnotację genu RRNA jako plik GTF o nazwie ReferenceRRNA.gtf.Wszystkie odczyty sekwencjonowania umieszczaj jako skompresowane pliki FASTQ w folderze o nazwie Reads. Upewnij się, że każdy plik jest zgodny z formatem nazewnictwa. Następnie ustaw parametry analizy zgodnie z zastosowaną metodą sekwencjonowania.Aby zmapować jakość sekwencji, użyj pakietu Rsubread, aby zbudować indeks referencyjnego genomu z pliku FASTA genomu. Dla każdej próbki użyj funkcji wyrównania, aby iterować i dopasowywać odczyty sekwencjonowania do genomu referencyjnego. Przechowywać powstałe pliki wyrównania w folderze wyjściowym w formacie BAM.Teraz użyj funkcji liczby cech, aby policzyć odczyty przypisane do każdego genu. Pliki adnotacji powinny być w formacie GTF. Upewnij się, że liczone są tylko odczyty z pojedynczym dopasowaniem do genomu.Licz odczyty odwzorowane na geny RRNA, korzystając z funkcji liczenia cech w pliku GTF genu RRNA. Pozwól na uwzględnienie odczytów wielomapowych do tego liczenia. Pobierz statystyki przypisania odczytu wygenerowane przez funkcję liczby cech dla każdej próbki.Statystyki te obejmują liczbę odczytów sklasyfikowanych jako przypisane, niemapowane, wielomapowane i inne. Zbieraj statystyki dotyczące przypisania genów RRNA osobno. Następnie generuj wykresy słupkowe, wizualizując statystyki odwzorowania odczytu z poprzednich kroków.Grupuj geny na podstawie liczby przypisanych im odczytów. Wyniki klasyfikacji wyrysuj jako wykres słupkowy. Próbka S2R1 wykazała niską liczbę odczytów zarówno przed, jak i po przycięciu.Przycięta liczba odczytów próbki S2R2 była widocznie zmniejszona w porównaniu do surowej liczby odczytów, co wskazuje na usunięcie niskiej jakości odczytów podczas przycinania. Mapowanie wykryło problemy w przypisaniach odczytu. Próbka S2R3 wykazała dużą liczbę wielokrotnie mapowanych odczytów oraz podwyższoną liczbę odczytów RNA rybosomalnego.Duża część odczytów w próbce S2R4 nie odpowiadała genomowi referencyjnemu, co sugeruje skażenie sekwencjami organizmu niebędącego celem. Próbki od S2R1 do S2R4 wykazały mniej genów z ponad 100 przypisanymi odczytami. W mapie cieplnej korelacji próbka S2R5 skupiona z replikacjami próbki S1, a próbka S1R5 skupiona z replikacjami próbki S2, co wskazuje na prawdopodobny błąd w znakowaniu replikacji.Zajmujemy się brakami kontroli jakości RNA-Seq, zapewniając wiarygodną ocenę danych przed analizą ekspresji genów w dalszej fazie. Nasze narzędzie integruje wiele wysokiej jakości tekstów, oferując dostępną, zautomatyzowaną i powtarzalną ocenę RNA-Seq dla biologów. Nasze narzędzie umożliwia badanie, jak jakość RNA-Seq wpływa na interpretację biologiczną, torując drogę do przejrzystej i powtarzalnej transkryptomiki.

rup-rna-seq-usability-assessment-pipeline-quality-control-for-bulk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Planarne dwuwarstwy lipidowe, nazywane również sztucznymi dwuwarstwami lipidowymi, pozwalają na badanie kanałów przewodzących jony w ściśle określonym środowisku. W niniejszym materiale prezentujemy poszczególne kroki niezbędne do przygotowania komory do dwuwarstw, elektrod oraz sposób sprawdzenia, czy dwuwarstwa nadaje się do pomiarów pojedynczych kanałów.

Przygotowanie sztucznych dwuwarstw do eksperymentów elektrofizjologicznych

Prezentujemy zastosowanie mikromacierzy DNA w profilowaniu ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, znakowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Poznaj automatyczną kontrolę jakości RNA-seq dla biologów bez doświadczenia bioinformatycznego. Ten protokół integruje narzędzia R do niezawodnej oceny danych transkryptomicznych przed analizą ekspresji genów.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Przeglądaj więcej filmów