Name: Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj dwie metody lizy komórek do wykrywania ubikwitynacji w komórkach ssaków przy użyciu modelu SMAD2/SMURF2. Protokół ten pomaga badaczom wybrać odpowiednią technikę do analizy modyfikacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin, nr 82370647 (W.H.), nr 82170642 (J-X. Z), Nr 81801923 (X-F. Z), Nr 81670575 (J-X. Z), nr 81570570 (W.H.) oraz nr 81070355 (J-X. Z), oraz Program Akademickiej Młodzieżowej Drużyny HUST Frontier, Huazhong University of Science and Technology (2018QYTD02). Otwarta Fundacja Hubei Kluczowe Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej i Interdyscyplinarnych Badań Translacyjnych (2022zsyx003). Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2024YFA1107601).

1. Przygotowanie buforu lizyzowego i odczynników
UWAGA: Przygotuj wszystkie bufory w wskazanych stężeniach. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi proszków odczynników, aby uniknąć rozbieżności w stężeniach.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor lizowy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) oraz 1% Triton X-100. W razie potrzeby dostosuj stężenie NaCl w zakresie 50-150 mM. Przygotuj wszystkie bufory za pomocą podwójnie destylowanego H₂O.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy, uzupełniając bufor lizowy koktajlem inhibitorów proteazy 1% (bez EDTA). Wymieszaj dokładnie i trzymaj na lodzie aż do użycia.</li>
	<li>Przygotuj 10% SDS, rozpuszczając 1 g proszku SDS w 10 mL PBS. Mieszaj, aż całkowicie się rozpuści. Przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj bufor obciążający białkiem 5× zawierający 250 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% glicerol, 0,5% błękit bromofenolu oraz 5% β-merkaptoetanol. Rozpuszczaj składniki w podwójnie destylowanym H2O. Dokładnie wymieszaj przed użyciem. UWAGA: Obchodz się z SDS i β-merkaptoetanolem w okapie wyparowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny. Utylizacja zanieczyszczonych materiałów zgodnie z wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych instytucji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj HEK293T komórki w wysokoglukozowym DMEM, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyną. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w warunkach sterylnych. Komórki przejściowe mają około 90% zbiegu się.</li>
	<li>Komórki nasienne w płytkach 6-dołkowych po 5 × 10⁵ komórek na dołek. Zgrupuj komórki z dwóch studni, aby wygenerować jedną próbkę.</li>
	<li>Przygotuj mieszaniny transfekcyjne, które będą stanowić 10% całkowitej objętości hodowli i wykorzystaj ubikwitynację SMAD2 jako model eksperymentalny. Połącz 1 μg plazmidu HA-Ub, 1 μg plazmidu FLAG-SMAD2 oraz 0,5 μg plazmidu pustego wektora lub MYC-SMURF2 w 100 μL bezsurowicowego DMEM. W osobnej probówce rozcieńcz 3,75 μL odczynnika transfekcyjnego w 100 μL DMEM wolnego od surowic. Dodaj mieszaninę odczynników kropelo do roztworu plazmidowego, inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej i równomiernie rozprowadzaj na komórkach.</li>
	<li>Po 6-8 godzinach wymień podłoże transfekcyjne na 2 mL świeżego, kompletnego DMEM na odwiert. Inkubuj komórki przez 48 godzin.</li>
	<li>Traktuj komórki 5 μM MG132 przez 12 godzin przed pobraniem. UWAGA: Obchodz się z MG132 w szafce zabezpieczeń biologicznych, mając na sobie rękawiczki. Utylizacja skażonych materiałów zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.</li>
</ol>
3. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Pobieraj komórki przy 90-100% łączności (~3 × 10⁶ komórki). Aspiruj medium i przemyj każdy dołek 1 mL schłodzonego PBS. Całkowicie usuń PBS.</li>
	<li>Dodaj 1 mL PBS do każdego dołka i delikatnie zawiesz komórki. Przełóż zawieszenie do rurki 1,5 mL i umieść na lodzie.</li>
	<li>Wiruj w 380 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i zachowaj granulat.</li>
</ol>
4. Przygotowanie koralików agarozowych
<ol>
	<li>Przenieś 50 μL białka A/G agarozowych koralików na próbkę do nowej probówki. Myj koraliki 3 razy z 1 mL buforu lizy. Wiruj w 100 × g przez 1 minutę w 4 °C między płukaniami.</li>
	<li>Usuń resztki buforu bez naruszania granulki. Dodaj 100 μL roztworu roboczego i 5 μL przeciwciał anty-FLAG. Inkubuj przez 6 godzin w temperaturze 4 °C z delikatnym obracaniem.</li>
</ol>
5. Liza komórek
<ol>
	<li>Metoda kąpieli lodowej<ol>
		<li>Dodaj 500 μL wstępnie schłodzonego roztworu roboczego do pelletu. Inkubuj na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Sonikować przy 2 W, stosując 4 sekundy włączenia/4 sekundy wyłączenia przez pięć powtórzeń. Trzymaj próbki na lodzie podczas sonifikacji. Zwrócić próbki do lodu na resztę inkubacji. UWAGA: W przypadku słabych interakcji białkowych zmniejsz stężenie NaCl do 50-75 mM i pomiń sonikację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda obróbki cieplnej<ol>
		<li>Dodaj 45 μL roztworu roboczego do pelletu. Dodaj 5 μL 10% SDS podczas ciągłego mieszania.</li>
		<li>Krótko podgrzej i podgrzej do 95 °C, aż zawieszenie stanie się przezroczyste i całkowicie spłynione. Odwracaj przerywanie, aby zapewnić równomierną denaturację.</li>
		<li>Dodaj 450 μL roztworu roboczego. Sonikować przy 2 W, stosując cykle 4 sekundy włączenia/4 sekundy wyłączenia przez pięć powtórzeń, trzymając próbki na lodzie. UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie SDS pozostaje <0,1%. Powierdź pełną lizę, potwierdzając zniknięcie widocznych granulek i jednolitą klarowność roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Immunoprecipitacja i wykrywanie ubikwitynacji
<ol>
	<li>Lizaty w wirówce podawaj 13 680 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przelej supernatant do nowej rurki.</li>
	<li>Zarezerwuj 60 μL lizatu i dodaj 15 μL bufora obciążenia 5×. Podgrzej w 95 °C przez 15 minut i oznacz jako wejście.</li>
	<li>Do pozostałego lizatu dodano 100 μL kulek sprzężonych przeciwciałami (końcowy objętość 540 μL). Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 8-12 godzin z rotacją.</li>
	<li>Kulki do wirówki nadają się na 100 × g przez 1 minutę w 4 °C i wyrzucają supernatant. Myj koraliki 3 razy z buforem lizatycznym. Dodaj 75 μL bufora ładowania 1× SDS i podgrzej go w temperaturze 95 °C przez 15 minut, aby wylučować białka. Oznacz jako IP.</li>
	<li>Wykrywanie białek ubikwitynowanych przez western blot zgodnie ze standardowym protokołem JoVE. UWAGA: Szczegółowe procedury transferu i wykrywania należy zapoznać się z protokołem Western Blot29 . Pełne nieprzycięte plamy z oznacznikami masy cząsteczkowej są dostępne w Pliku Uzupełniającym 1.</li>
</ol>

<ol><li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system in breast cancer.</a> Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).</li>
<li>Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+as+a+danger+signal+promoting+G1+arrest+after+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis.</a> Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+linear+ubiquitination+in+regulating+cell+death+and+correlative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases.</a> Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).</li>
<li>Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+DUBs%3A+A+bidirectional+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Akt and DUBs: A bidirectional relationship.</a> Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).</li>
<li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDH2+triggers+ROS-induced+cell+death+and+autophagy+by+promoting+NRF2+ubiquitination+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).</li>
<li>Cappadocia, L., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation%3A+Structures%2C+chemistry%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism.</a> Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRA+upregulates+OTUD6B+to+recruit+CD8%2B+T+cells+to+suppress+colorectal+liver+metastasis+by+stabilizing+DDX5%2FSTAT3%2FCXCL11+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis.</a> Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).</li>
<li>Niu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP33+deubiquitinates+PRKN%2FParkin+and+antagonizes+its+role+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy.</a> Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).</li>
<li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li>
<li>Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Met1-linked+ubiquitination+in+cell+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation.</a> Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).</li>
<li>Di, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-Myc-WDR43+signalling+axis+promotes+chemoresistance+and+tumour+growth+in+colorectal+cancer+by+inhibiting+p53+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist+Updat%22%5BJournal%5D)">The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity.</a> Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).</li>
<li>Liebl, M. C., Hofmann, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+p53+signaling+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of p53 signaling in colorectal cancer.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).</li>
<li>Oikawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTUD1+deubiquitinase+regulates+NF-%CE%BAB-+and+KEAP1-mediated+inflammatory+responses+and+reactive+oxygen+species-associated+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways.</a> Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinase+OTUD1+stabilizes+NRF2+to+alleviate+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury.</a> Redox Biol. 75, 103287(2024).</li>
<li>Moreau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+ixazomib%2C+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+for+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma.</a> N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).</li>
<li>Stewart, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carfilzomib%2C+lenalidomide%2C+and+dexamethasone+for+relapsed+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma.</a> N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+gut+microbial+nitrogen+recycling+and+cellular+uptake+of+ammonium+to+improve+bortezomib+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma.</a> Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).</li>
<li>De Silva, A. R. I., Page, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+detection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination detection techniques.</a> Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of protein ubiquitination.</a> J Vis Exp. (30), e1293(2009).</li>
<li>Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+measure+ubiquitination+of+NLRs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Method to measure ubiquitination of NLRs.</a> Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).</li>
<li>DeCaprio, J., Kohl, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+lysis+of+cells+for+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Med+Sci+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research.</a> Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+Technique%2C+theory%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: Technique, theory, and troubleshooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crane, J. L., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+and+TGF-%CE%B2+signaling+in+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling.</a> J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).</li>
<li>Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+liver%2C+pancreas%2C+and+gastrointestinal+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer.</a> Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).</li>
<li>Tzavlaki, K., Moustakas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> Biomolecules. 10 (3), 487(2020).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+western+blot%5BTitle%5D)+AND+%22J+vis+exp%22%5BJournal%5D)">The western blot.</a> J vis exp. , e5065(2025).</li>
<li>Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+osteoblast%2C+skeletal+development%2C+and+bone+formation%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease.</a> Bone Res. 4, 16009(2016).</li>
<li>Jeon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-15b-SMURF2-HSP27+axis+promotes+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis.</a> J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMURF2+predisposes+cancer+cell+toward+ferroptosis+in+GPX4-independent+manners+by+promoting+GSTP1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation.</a> Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).</li>
<li>Pi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SMURF2+expression+enhances+RACK1+stability+and+promotes+ovarian+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression.</a> Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Niniejsze badanie przedstawia i porównuje dwa szczegółowe protokoły lizy białek specjalnie zoptymalizowane do wykrywania ubikwitynacji substratu pośredniczonego przez ligazę E3. Aby zapewnić wykrywalność, zastosowaliśmy nadekspresję opartą na plazmidach (np. oznaczoną SMAD2, SMURF2 lub Ub) w komórkach, co zapewniło wystarczające poziomy białek do wizualizacji specyficznych sygnałów ubikwitynacji, co było kluczowe dla weryfikacji interakcji E3 z podłożem w tym badaniu. Przed pobieraniem komórek dodano MG132, silny inhibit...

Ubikwitynacja, niezbędna modyfikacja potranslacyjna, jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych1. System ubikwitany-proteasomu (UPS), który pośredniczy w degradacji ponad 80% białek u eukariontów, składa się z ubikwityny (Ub), enzymów aktywujących E1, enzymów sprzężających E2, ligaz E3, enzymów deubikwitylujących (DUB) orazproteasomu 26S. System ten reguluje wymianę białek z dużą specyficznością, kontrolując tym samym kluczowe procesy komórkowe, takie jak progresja cyklukomórkowego 3, transdukcja sygnału 4,5 oraz odpowiedzi stresowe 6,7. Ubikwitynacja to wieloetapowy proces enzymatyczny. E1 hydrolizuje ATP, aby adenylować końcowy punkt C Ub, tworząc pośredni Ub-AMP. Następnie aktywowany Ub jest przenoszony z E1 do cysteiny w miejscu aktywnym enzymu sprzęgającego E2, tworząc wiązanie tioesterowe. Na koniec ligaza E3 rekrutuje zarówno kompleks E2-Ub, jak i białko docelowe, katalizując transfer Ub z E2 do reszty lizyny na substratie8.
Ubikwityna może tworzyć różnorodne łańcuchy poliubikwityny poprzez sprzężenie w siedmiu resztach lizyny (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) lub Met1(M1)4. Każdy typ sprzężenia wyznacza różne wyniki biologiczne: łańcuchy sprzężone K48 głównie celują w białka do degradacji proteasomalnej9, łańcuchy sprzężone z K63 regulują sygnalizację i naprawę DNA10,11, a łańcuchy powiązane z M1 są kluczowe dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej12. Ubikwitynacja i deubikwitynacja to kluczowe procesy modyfikacji potranslacyjnej, które kontrolują różnorodne zdarzenia komórkowe, od degradacji białek po transdukcję sygnałów. Na przykład w raku jelita grubego nieprawidłowa aktywacja ubikwitynacji p53 wywołanej przez MDM2 prowadzi do nadmiernej degradacji p53, co osłabia jego zdolność do wywołania zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy, a tym samym napędza postęp guza i chemiooporcję13,14. W urazie niedokrwienia wątroby i reperfuzji OTUD1 stabilizuje NRF2 poprzez usunięcie poliubikwitynacji wiązanej z K48, łagodząc tym samym poziomy stresu oksydacyjnegowewnątrzkomórkowego 15,16. Szereg inhibitorów proteasomu, takich jak bortezomib, karfilzomib i ixazomib, stopniowo weszł do praktyki klinicznej w leczeniu chorób takich jak szpiczak mnogi 17,18,19.
Obecnie istnieje wiele metod wykrywania białek ubikwitynowanych, w tym western blotting, testy radioaktywności oraz testy fluorescencyjne20. Jednak w badaniach naukowych western blot pozostaje preferowaną metodą wykrywania ubikwitynacji białek ze względu na stosunkowo szybki i prosty protokół. Tradycyjne metody wykrywania białek ubikwitynowanych są podobne do technologii koimmunoprecipitacji (co-IP): używają buforu lizy do inkubacji i lizują granulki komórkowe w niskiej temperaturze, aby uwalniać białka, a następnie używają przeciwciał do wykrywania ubikwikwitynacji białek substratowych21,22. Jednak ten protokół eksperymentalny często wymaga dużej liczby komórek. Dodatkowo, ponieważ stosunkowo łagodna metoda lizy w niskiej temperaturze nie może całkowicie zakłócić interakcji białek, zwiększa to prawdopodobieństwo fałszywie pozytywnych wyników w wykrytym ubikwitynacji. Podgrzewanie i stosowanie SDS mogą znacząco zakłócić strukturę białek, wywołując ich całkowitą denaturację, co skutecznie zmniejsza liczbę fałszywie pozytywnych wyników wywołanych interakcjami białko-białko 23,24,25. Podobnie komórki przechodzą wystarczającą lizę po podgrzaniu i leczeniu SDS, uwalniając więcej białek i odpowiednio zmniejszając liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu. Podsumowując, zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metoda obróbki cieplnej lizują komórki i wykrywają poziomy ubikwitynacji białek substratu poprzez inkubację przeciwciał. Jednak metoda podgrzewania prowadzi do większej lizy komórek i silniejszej denaturacji białek.
TGF-β odgrywa podwójną rolę w procesach patofizjologicznych różnych chorób 26,27. SMAD2 jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym TGF-β. Ubiquitinacja SMAD2 za pośrednictwem SMURF2 celuje w degradację proteasomalną, tym samym precyzyjnie dostroiła intensywność sygnalizacji TGF-β28. Badanie to wyodrębnia i porównuje dwie metody lizy komórek do pomiaru poziomu ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF2/SMAD2 jako model. Tutaj nadekspresja białek w komórkach HEK293T została wywołana przez transientną transfekcję plazmidami HA-Ub, FLAG-SMAD2 i MYC-SMURF2. Komórki były lizowane odpowiednio metodą kąpieli lodowej i metodą obróbki cieplnej. Białka ubikwitynowane zostały wykryte przez analizę Western blot. Stwierdziliśmy, że zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metody obróbki cieplnej mogą być stosowane do wykrywania poziomów ubiquitinacji, a metoda obróbki cieplnej może ułatwić wykrywanie ubikwitynacji SMAD2. Protokół ten stanowi nową alternatywę dla wykrywania białek ubikwitynowanych. Ponadto, dla niektórych białek substratowych silnie związanych z ubikwitynacją, metoda obróbki cieplnej zapewnia lepszą skuteczność lizy białek, co ułatwia wykrywanie ubikwitynacji.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL mikrorurki</td><td>Servicebio</td><td>EP-150-M</td><td></td></tr><tr><td>Fermentowana misa 100 mm TC-otoczona</td><td>Servicebio</td><td>CCD-100</td><td></td></tr><tr><td>Dysk 6-dołkowy</td><td>Servicebio</td><td>CCP-6H</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-FLAG</td><td>Proteintech</td><td>20543-1-AP</td><td>Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:10000 dla WB</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GAPDH</td><td>Proteintech</td><td>MA5-15738</td><td>rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw HA</td><td>Proteintech</td><td>51064-2-AP</td><td>rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-IgG</td><td>CST</td><td>#3900</td><td>Rozcieńczenie stosowane w 1:200 dla IP</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-MYC</td><td>Proteintech</td><td>60003-2-Ig</td><td>rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000</td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw SMAD2</td><td>CST</td><td>#5339</td><td>Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:2000 dla WB</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Servicebio</td><td>GC307006-5g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (pH=8,0)</td><td>Servicebio</td><td>G1207-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ABW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sinopharm</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Sucha kąpiel podgrzewczo-chłodząca</td><td>Guocheng</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Servicebio</td><td>G4515-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Łańcuch lekki IgG IgG z HRP sprzężony z HRP;</td><td>Abclonal</td><td>AS062</td><td>Rozcieńczenie używane w stosunku 1:5000</td></tr><tr><td>HRP-sprzężony myszy antykróliczy IgG lekki łańcuch &nbsp;</td><td>Abclonal</td><td>AS061</td><td>rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000</td></tr><tr><td>Lipo8000</td><td>Beyotime</td><td>C0533</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Aladyn</td><td>M421264</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Labgic</td><td>CF1524R</td><td></td></tr><tr><td>Proszek NaCl</td><td>Servicebio</td><td>GC102004</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-FLAG-SMAD2</td><td></td><td></td><td>Dla ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>pCMV-HA-Ub</td><td></td><td></td><td>Dla ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>pCMV-MYC</td><td></td><td></td><td>Dla ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>pCMV-MYC-SMURF2</td><td></td><td></td><td>Dla ekspresji ssaków</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Servicebio</td><td>G4003-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>TargetMol</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>Białko A/G agarozowe koraliki</td><td>Beyotime</td><td>P2017</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Vayzme</td><td>E801</td><td></td></tr><tr><td>Proszek SDS</td><td>Solarbio</td><td>S8010-500g</td><td></td></tr><tr><td>Sysytem SDS-PAGE</td><td>Aervicebio</td><td>BVE4-BVT4</td><td></td></tr><tr><td>Soniki</td><td>Komórka Uibra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proszek Tris-HCl</td><td>Biotoped</td><td>HST-0372</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Servicebio</td><td>GC204003-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Servicebio</td><td>G4021-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mieszacz wirowy</td><td>Uprzejmie przekazane przez Vayzme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Aladyn</td><td>M301573</td><td></td></tr></tbody></table>

porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem smad2/smurf2 jako modelu

Comparative Strategies for Ubiquitination Detection in Mammalian Cell Lysates Using SMAD2/SMURF2 as a Model

Ubikwitynacja, modyfikacja potranslyczna, jest kluczowym regulatorem funkcjonowania białek wewnątrzkomórkowych. Ubikwitynacja moduluje funkcje białek poprzez promowanie degradacji proteasomalnej lub zmianę lokalizacji subkomórkowej poprzez sygnalizację zależną od łańcucha ubikwityny. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji SMAD2 w komórkach HEK293T oraz porównamy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji białek. Nadmierna ekspresja białek w komórkach została wywołana przez transfekcję przejściową. Plazmidy (HA-Ub, FLAG-SMAD2 i MYC-SMURF2) oraz odczynniki transfekcyjne zostały osobno dodane do ośrodka bazalnego, wymieszane, a mieszanina dodana do komórek. Przed pobraniem dodano MG132, aby hamować degradację proteasomalną i zwiększyć gromadzenie białek ubiquitinowanych. Główną różnicą między tymi dwoma podejściami eksperymentalnymi są metody lizy komórek – metoda kąpieli lodowej (wykonywana w 4 °C) oraz metoda obróbki cieplnej (inkubacja w 95 °C), co znacząco wpływa na efektywność lizy białek. Po zakończeniu analizy komórek wymieszano lizat komórkowy, koraliki agarozy oraz przeciwciało FLAG i wybudowano w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie białka ubikwitynowane były wykrywane analizą western blotem. Przed wykryciem białek ubikwitynowanych stosowano przeciwciało lekkie do inkubacji przeciwciał wtórnych. Następnie wykryto pasma ubiquitynacji. Wyniki pokazują, że zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metody obróbki cieplnej mogą być stosowane do wykrywania poziomów ubikwitynacji, podczas gdy metoda obróbki cieplnej może ułatwić wykrywanie ubikwitynacji SMAD2. Badanie to wyodrębnia i porównuje dwie metody lizy komórek do pomiaru poziomów ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF2/SMAD2 jako model, aby pomóc naukowcom w wyborze bardziej odpowiednich metod wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych.

Jako "molekularny posłaniec" w szlaku sygnalizacyjnym TGF-β, SMAD2, po fosforylacji przez receptory TGF-β, tworzy kompleks z SMAD3 i SMAD4, translokuje się do jądra i inicjuje transkrypcję genów docelowych30. Jest więc kluczową cząsteczką łączącą sygnały zewnątrzkomórkowe z ekspresją genów wewnątrzkomórkową. Jej degradację pośredniczi SMURF2, ligaza ubikwityna E3, która katalizuje poliubikwitynację białka docelowego, kierując go w ten sposób do degradacji proteasomalnej. Ta degradacja SMAD2 wywoła...

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Ubiquitination, a post-translational modification, is a critical regulator of intracellular protein function. Ubiquitination modulates protein functions ...

Ubikwitynacja kontrolowana przez kaskadę enzymatyczną E jeden, E dwa, E 3 jest kluczowym regulatorem funkcji białka. Elastyczność strukturalna ubikwityny pozwala na tworzenie różnorodnych łańcuchów za pomocą różnych łańcuchów lizynowych lub Met, gdzie każda topologia dyktuje odrębny wynik, K 48 dla degradacji, K 63 dla sygnalizacji i naprawy oraz Met dla odporności wrodzonej. Niniejsze badanie wyodrębnia i porównuje dwie różne metody lizy komórek mających na celu pomiar poziomu aplikacji w komórkach ssaków, wykorzystując modele Smurf 2, SMAD 2, co pomoże naukowcom wybrać bardziej odpowiednie metody wykrywania poziomu ubikwitynacji białek substratowych.Utrzymuj HEK dwie komórki 93 T w wysokoglukozowym DMEM, uzupełnione 10% FBS i 1% PS. Komórki nasienne w sześciu płytkach dołków po 500 000 komórek na odwór. Przygotuj mieszaniny transfekcyjne, które będą reprezentować 10% całkowitej wartości hodowli i wykorzystaj ubikwitynację SMAD 2 jako model eksperymentalny. Łącz różne plazmidy w 100 mikrolitrach bezsurowicowego DMEM.W osobnej tubie rozcieńcz odczynnik transfekcyjny. Gdy mieszanina odczynników kropla do roztworu plazmidowego, inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej i równomiernie rozprowadzaj na komórki. Po sześciu godzinach wymień podłoże transfekcyjne na dwa mikrolitry świeżego, kompletnego DMEM na odwiert.Traktuj komórki pięcionanometrowym MG 1 3 2 przez 12 godzin przed pobraniem. Aspiruj medium i przemyj każdy dołek jednym mil schłodzonego PBS. Całkowicie usuń PBS.Przenieś zawieszenie do rury o średnicy 1,5 i umieść na lodzie. Wirówka na trzysta 80 XG przez pięć minut w temperaturze czterech stopni. Usuń supernatant i zachowaj granulat.Przelej 50 mikrolitrów białka AG agarozowych koralików na próbkę do nowej probówki. Płucz koraliki trzy razy z jednym milionem buforu lizy. Usuń resztki buforu bez naruszania granulki.Przy 100 mikrolitrach roztworu roboczego i pięciu mikrolitrach przeciwciał. Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie schłodzonego roztworu roboczego do pelletu. Inkubuj na lodzie przez 30 minut.Sonikować przy dwóch W używając czterech sekund włączonych, cztery sekundy przerwy przez pięć powtórzeń. Zwrócić próbki do lodu na resztę inkubacji. Dodaj 40 mikrolitrów roztworu roboczego do pelletu.Dodaj pięć mikrolitrów ponad 10% SDS, mieszając w trybie ciągłym. Krótko podgrzej i podgrzej w temperaturze 95 stopni, aż zawieszenie stanie się przezroczyste i całkowicie rozpłynnione. Odwracaj przerywanie, aby zapewnić równomierną denaturację.Dodaj 450 mikrolitrów roztworu roboczego. Sonikować na dwóch W z czterema sekundami w cyklach przez pięć powtórzeń. Lizaty w wirówce przez 15 minut w temperaturze czterech stopni.Zarezerwuj 60 mikrolitrów lizatu i dodaj 15 mikrolitrów bufora wieloładunkowego. Podgrzewaj w 95 stopniach przez 15 minut i oznacz jako wejście. Do pozostałego lizatu dodaj 100 mikrolitrów kulek sprzężonych z przeciwciałami.Inkubuj w temperaturze czterech stopni przez osiem do dwunastu godzin z rotacją. Kulki w wirówce na 100 XG przez minutę w temperaturze czterech stopni i wyrzuć supernatant. Dodaj 75 mikrolitrów jednego bufora ładowania multi SDS i utrzymuj temperaturę 95 stopni przez 15 minut, aby eluować białka, oznaczone jako IP. Wykrywanie białek ubiquinowanych przez western blot.HE K, dwie 93 limfocyty T, zostały transfekowane i stymulowane MG 132. Komórki zostały podzielone na pięć grup według różnych metod leczenia, a różnice między grupami są następujące: bez flagi SMAD dwa pasy jeden, bez MG jeden trzy dwa pasy dwa, bez przeciwciał FLAG dodanych do koralików tor trzy, z MYC-SMURF dwa pasy pięć. Wszystkie komórki zostały zlizowane metodą kąpieli lodowej.Pierwszy pas służył jako kontrola, aby potwierdzić skuteczną nadekspresję plazmidu SMAD 2. Druga ścieżka służyła jako kontrola, aby wykazać hamujący wpływ MG 13 2 na degradację białek ubikwitynowanych. Pas trzeci służył jako kontrola, aby potwierdzić, że wiązanie niespecyficzne zostało całkowicie wyeliminowane.Ścieżka piąta została użyta do zbadania działania promującego SMURF 2 na ubikwitynację SMAD 2. Wartość HA w skali szarości na torze piątym była wyższa niż na pasie czwartym, co wykazało, że SMURF dwa podnosi poziom ubikwitynacji SMAD 2. Gdy stosowaliśmy lysecelli metodą obróbki cieplnej, uzyskaliśmy podobne wyniki jak przy metodzie kąpieli lodowej, jednak przy użyciu metody obróbki cieplnej nie udało się wykryć ekspresji SMURF 2 w wynikach IP FLAG.Wykazaliśmy również, że metoda obróbki cieplnej jest również odpowiednia do wykrywania ubikwitynacji endogennych białek. Porównaliśmy również efektywność obu metod wykrywania poziomów ubiquitinacji, zarówno w wynikach wejściowych, jak i IP flag – i stwierdziliśmy, że wartość HA w skali szarości w grupie stosującej metodę obróbki cieplnej była wyższa niż w metodzie kąpieli lodowej. Aby poprawić wykrywanie sygnalizacji, zastosowaliśmy nadekspresję opartą na plazmidach w połączeniu z leczeniem MG 13 2 podczas pobierania komórek, aby zapobiec degradacji białek ubikwitynowanych.Przygotowanie lizatu wymaga starannej modulacji stężenia na cl, ponieważ wysoka ilość soli zakłóca słabe interakcje, podczas gdy niska ilość soli zwiększa agregację niespecyficzną. Jednak niskie stężenia mogą prowadzić do nadmiernego tła z agregatów niespecyficznych. Dla wzmocnienia wzbogacenia białek przeciwciała do kulek przy czterech stopniach zapewniają bardziej efektywne wychwytywanie białek docelowych i ograniczają niespecyficzne wiązanie.W metodzie obróbki cieplnej kluczowe jest zapewnienie, że stężenie SDS pozostaje poniżej jednego procenta, ponieważ dostęp do SDS może usuwać przeciwciała z kulek. Badanie to przedstawia i porównuje różne metody lizy mające na celu pomiar poziomów ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF 2 SMAD 2 jako model, który pomoże naukowcom wybrać bardziej odpowiednie metody wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych.

comparative-strategies-for-ubiquitination-detection-mammalian-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Protokół opisuje krok po kroku metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków na przykładzie białka supresorowego p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono z komórek w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Poznaj dwie metody lizy komórek do wykrywania ubikwitynacji w komórkach ssaków przy użyciu modelu SMAD2/SMURF2. Protokół ten pomaga badaczom wybrać odpowiednią technikę do analizy modyfikacji białek.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Przeglądaj więcej filmów