13 lutego 2026
Błony amyloidowe są formowane przez liczne białka, a powstałe włókna mają strukturę "krzyżowego arkusza β". Opisujemy tutaj, jak próbki włókien amyloidowych mogą być przygotowywane do dyfrakcji rentgenowskiej włókien i jak wzory mogą być analizowane.
Nasze badania wykorzystują dyfrakcję promieni X na włóknach do zbadania struktury włókien amyloidowych krzyżowych beta i jej organizacji molekularnej. Ten protokół wykorzystuje dyfrakcję promieni X na włóknach do potwierdzenia krzyżowych wzorców beta i wyjaśnienia architektur włókien. Ten protokół umożliwia analizę strukturalną włókien amyloidowych od potwierdzenia organizacji krzyżowej beta do wyjaśnienia dalszych szczegółów molekularnych.
Aby rozpocząć, wyrównaj włókna białkowe lub peptydowe, aby uzyskać pęczek, którego osie włókien są idealnie wszystkie równoległe. Roztop wosk z świeczki na płycie grzewczej, aż się upłynni. Używając szkła tnącego, wytnij 1-milimetrowe kapilary ze szkła borokrzemowego na długość około 2-3 centymetrów.
Krótko zanurz wycięte kapilary w ciekłym wosku. Następnie zasysz wosk z świeczki dzięki działaniu kapilarnemu do około 1-2 milimetrów wewnątrz kapilary. Teraz użyj plastyliny, aby przymocować uszczelnione kapilary poziomo wewnątrz naczynia Petriego.
Zachowaj odstęp 0,5-2 milimetrów między wypełnionymi woskiem końcami kapilarów. Za pomocą pipety ostrożnie zawieś kroplę 10 mikrolitrów roztworu włókien między wypełnionymi woskiem końcami dwóch kapilarów. Przykryj naczynie Petriego, aby chronić próbkę przed kurzem i pozwól im odparować przez noc.
Następnie uszczelnij płytkę, aby pomóc w utrzymaniu kontrolowanego środowiska schnięcia. Aby wyrównać włókna amyloidowe w szklanej kapillarze, przymocuj strzykawkę 1-mililitrową z gumowym wężem do szerokiego końca silicyzowanej szklanej kapillary o średnicy 0,7 milimetra. Zasysz 2-3 centymetry zawiesiny włókien do kapillary.
Uszczelnij jeden koniec kapillary za pomocą stopionego wosku i pozostaw drugi koniec otwarty, aby umożliwić odparowanie. Ułóż kapillarę pionowo i pozwól jej wyschnąć, aż uformuje się wysuszony dysk. Aby wyrównać włókna jako matę lub cienką warstwę, umieść próbkę o wysokiej koncentracji włókien na szklanej szklance i przykryj przed wysuszeniem na powietrzu przez 24 godziny.
Ostrożnie zamontuj pęczek włókien na głowicy goniometru i ustal go tak, aby promień X przechodził przez pęczek. Jeśli używasz próbki z matą włókien, ustal ją tak, aby promień X przechodził przez krawędź maty. Zbadaj próbkę pod mikroskopem optycznym wyposażonym w krzyżowy polaryzator, aby obserwować dwójłomność.
Umieść próbkę na promieniu X w oparciu o to, czy jest to pęczek włókien, mata czy dysk. Zbierz wzór dyfrakcji przy użyciu sprzętu do promieni X lub promieniowania synchrotronowego. Aby wykonać analizę danych, wczytaj plik do oprogramowania do analizy wzorów dyfrakcji CLEARER.
Przejdź do Wzoru Dyfrakcji i Ustawienia Dyfrakcji, aby wprowadzić ustawienia dyfrakcji, w tym rozmiar piksela, źródło promieni X i odległość od próbki do detektora. Kliknij Przetwarzanie Obrazu i Obróć, aby obrócić obraz dyfrakcji tak, aby merydian był pionowy. Użyj modułu centralizacji, przechodząc do Wzoru Dyfrakcji i klikając na Center Image, aby scentralizować obraz.
Zdefiniuj osie merydianu i równika. Zapisz scentralizowany obraz do dalszej analizy. Następnie określ odpowiedni kąt wzdłuż merydianu i równika.
Kliknij Wzorzec Dyfrakcji, a następnie moduł Radialnie Średnia, aby wygenerować wykres pozycji sygnału dyfrakcji. wobec intensywności. Przejdź do modułu Peak Find z menu Wzorzec Dyfrakcji, aby zmierzyć i automatycznie wydać sygnał dyfrakcji.
Dostosuj szerokość wyszukiwania szczytu, aby wykryć prawdziwe sygnały bez szumów. Użyj opcji zoomu i pomiaru, aby zweryfikować wynik sygnału dyfrakcji za pomocą wyszukiwania szczytów. Zbadaj potencjalne wymiary komórki elementarnej za pomocą modułu Optymalizacji Komórki Elementarnej.
Wprowadź wstępne oszacowania na podstawie silnych sygnałów równikowych i określ minimalne i maksymalne indeksy dla wyszukiwania komórek. Oblicz potencjalne wymiary komórki elementarnej i porównaj przewidywane pozycje sygnału dyfrakcji z obserwowanymi odbiciami. Wybierz komórkę elementarną, która najlepiej pasuje do danych i próbki.
Aby zbudować modele molekularne, stwórz układy 3D peptydów w konfiguracji arkusza beta, która pasuje do określonej komórki elementarnej. Upewnij się, że wszystkie składniki związane z symetrią są zawarte. Następnie kliknij Symulację Dyfrakcji, a następnie Struktury i Generator Łańcucha Struktury i załaduj model PDB.
Przypisz oś włókna i oś wiązki, wprowadź wymiary komórki elementarnej, a następnie sprawdź, czy nie ma zderzeń sterycznych. Przejdź do Symulacji Dyfrakcji i kliknij Symulację Dyfrakcji Włóknistej, aby wczytać współrzędne PDB do modułu Symulacji Dyfrakcji Włóknistej. Wprowadź kierunek osi włókna, orientację wiązki, wymiary komórki elementarnej, ustawienia źródła promieni X i detektora, a następnie kliknij Symuluj, aby uruchomić symulację.
Upewnij się, że oś wiązki jest prostopadła do osi włókna. Następnie przejdź do Pliku
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Włókna amyloidowe to błędnie sfałdowane, samoorganizujące się białka o powtarzalnej strukturze, powiązane z takimi chorobami jak choroba Alzheimera i cukrzyca typu 2, a także pełniące funkcje biologiczne w różnych organizmach. Niniejszy artykuł przedstawia metody określania architektury włókien amyloidowych, w tym przygotowanie próbek, gromadzenie danych oraz analizę w celu modelowania ich struktury.
Wyjaśnienie struktury włókien amyloidowych jest kluczowe dla ograniczania ryzyka na wczesnych etapach odkrywania leków w ramach portfeli dotyczących chorób neurodegeneracyjnych i białkowych chorób z błędnym sfałdowaniem. Wysokorozdzielcze modele architektur cross-beta pozwalają na uzyskanie wiarygodnych prognoz w walidacji celów oraz badaniach mechanistycznych, co wspiera podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów terapeutycznych. Metody te stanowią podstawę ciągłości translacyjnej – od etapu odkrywania po badania przedkliniczne – poprzez wyjaśnienie molekularnych podstaw patologii i funkcji napędzanych przez amyloidy.
Analiza strukturalna włókien amyloidowych wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od wczesnej weryfikacji hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną.