Name: Amyloid i architektura krzyżowa beta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-13T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metody dyfrakcji promieniowania X włókien do badania struktury amyloidów i ich organizacji molekularnej. Protokół ten umożliwia analizę architektury fibryl z potwierdzeniem organizacji krzyżowo-beta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Pawłowi Sikorskiemu i profesorowi Edwardowi Atkinsowi za pomoc w opracowaniu programu CLEARER i analizie wzorców. Program został napisany przez dr O Sumner Makin. Praca ta została wsparta finansowaniem z Alzheimer's Research Trust i BBSRC.

1. Preparation of fibrillar samples for X-ray fiber diffraction
<ol>
	<li>Rozpuść białko lub peptyd interesujący w optymalnych warunkach dla formowania fibryli dla wybranego peptydu amyloidogennego i oceń formowanie fibryli za pomocą mikroskopii elektronowej lub mikroskopii sił atomowych. Szczegóły dotyczące przygotowania próbek i przeprowadzania obrazowania są dostępne w innym miejscu13. Upewnij się, że fibryle są długie, proste i nierozgałęzione jak pokazano na Rysunku 1. Na przykład fibryle pokazane na Rysunku 1 zostały przedstawione za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej (TEM). Umieść kroplę zawierającą fibryle na siatce mikroskopu elektronowego, a następnie wykonaj ujemne barwienie za pomocą octanu uranylu14. 
	UWAGA: Korzystne jest równomierne pokrycie i rozmieszczenie fibryli na siatce.</li>
	<li>Wyrównaj, aby uzyskać pęczek fibryli, których osie włókien są idealnie wszystkie równoległe (Rysunek 2A).
	<ol>
		<li>Roztapiaj wosk z świec do stanu ciekłego za pomocą płyty grzewczej. Za pomocą szkła tnącego, takiego jak diamentowe pióro, wytnij 1 mm kapilarki ze szkła borokrzemowego na długość około 2-3 cm i krótko zanurz je w ciekłym wosku. Wyciągnij wosk z świec w górę dzięki działaniu kapilarnemu (około 1-2 mm długości wewnątrz kapilarki). Upewnij się, że powierzchnia wosku jest płaska, aby zawiesina fibryli mogła spoczywać równomiernie.</li>
		<li>Za pomocą plastiliny przymocuj uszczelnione kapilarkę poziomo w naczyniu Petriego z odstępem 0,5 mm do 2 mm między zakończeniami wypełnionymi woskiem (Rysunek 2A).</li>
		<li>Za pomocą pipety ostrożnie zawieś 10 μL kroplę roztworu między zakończeniami wypełnionymi woskiem dwóch kapilar. Upewnij się, że roztwór styka się z oboma końcami wosku, ale nie rozciąga się na szklany materiał.</li>
		<li>Zapobiegnij zanieczyszczeniu próbki kurzem, przykrywając naczynie Petriego. Pozostaw próbkę do odparowywania przez noc, co spowoduje wyrównanie fibryli (zobacz Rysunek 2A). 
		UWAGA: Całkowite wyschnięcie próbki może zająć kilka dni, a zależy to od temperatury otoczenia i wilgotności oraz lepkości próbki.</li>
		<li>Uszczelń płytkę; inkubuj w niższych temperaturach w lodówce lub inkubuj z użyciem wilgotności w szczelnym pudełku, aby spowolnić schnięcie, co może spowodować lepsze wyrównanie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównaj fibryle amyloidowe w szklanej kapilarce (Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Przymocuj strzykawkę 1 mL wyposażoną w mały kawałek gumowego węża do szerokiego końca do kapilary ze szkła krzemianowego o średnicy 0,7 mm i wsadzisz 2-3 cm zawiesiny fibryli.</li>
		<li>Uszczelnij jedno zakończenie kapilary za pomocą stopionego wosku i pozwól, aby drugi koniec pozostawał otwarty, aby umożliwić odparowanie. Ułóż kapilarkę pionowo i pozwól jej wyschnąć przez kilka dni lub tygodni, aż uformuje się wysuszony dysk w rurze kapilarnej (Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównaj fibryle jako "matę" lub cienką warstwę (​​Rysunek 2C).
	<ol>
		<li>Umieść wysokie stężenie (np.>10 mg/mL) próbki fibryli na szklanej szlamie, parafilmie lub kawałku teflonu, przykryj i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 24 godziny. Powinna się wyschnąć, tworząc cienką, płaską warstwę na powierzchni. Ostrożnie podnieś ją skalpem, a następnie przymocuj do rury kapilarnej za pomocą kleju lub plastiliny.</li>
		<li>Mata będzie miała losowe ułożenie fibryli (zobacz Rysunek 2C). Ostrożnie zamontuj próbkę na głowicy goniometru, aby wiązka rentgenowska przechodziła przez krawędź próbki i równolegle do płaszczyzny folii (Rysunek 2C). 
		UWAGA: Diffrakcja przez powierzchnię folii da efekt dyfrakcyjnych pierścieni z powodu losowego ułożenia (zobacz Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj próbkę.
	<ol>
		<li>Zbadaj, jak dobrze jest wyrównany, badając go przez krzyżową polaryzację pod mikroskopem świetlnym. Jeśli obecne jest dwójłomność, może to sugerować dobre wyrównanie w paśmie fibryli.</li>
		<li>Przymocuj próbkę kapilarki do głowicy goniometru za pomocą plastiliny. Weź pod uwagę, czy próbka jest pakietem włókien, matą czy dyskiem, umieszczając ją w wiązce promieniowania rentgenowskiego.
		<ol>
			<li>Zwróć uwagę, że oś obrotu próbki będzie wokół osi włókna dla pakietu włókien (Rysunek 2A), podczas gdy w dyskach włókna mają tendencję do wyrównania na średnicy rury (Rysunek 2B). Mata będzie miała dwa odrębne kierunki (równolegle do płaszczyzny folii i prostopadle do niej) (Rysunek

<ol><li>Shirahama, T., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+electron+microscopic+analysis+of+the+amyloid+fibril%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution electron microscopic analysis of the amyloid fibril.</a> J Cell Biol. 33, 679-706 (1967).</li>
<li>Buxbaum, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+nomenclature+2024%3A+Update%2C+novel+proteins%2C+and+recommendations+by+the+International+Society+of+Amyloidosis+%28ISA%29+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amyloid nomenclature 2024: Update, novel proteins, and recommendations by the International Society of Amyloidosis (ISA) Nomenclature Committee.</a> Amyloid. 31 (4), 249-256 (2024).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+protein+folding+and+its+links+with+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structural basis of protein folding and its links with human disease.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1406), 133-145 (2001).</li>
<li>Sunde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+core+structure+of+amyloid+fibrils+by+synchrotron+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction.</a> J. Mol. Biol. 273, 729-739 (1997).</li>
<li>Astbury, W. T., Woods, H. J., Bragg, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+studies+of+the+structure+of+hair%2C+wool%2C+and+related+fibers.+II.+The+molecular+structure+and+elastic+properties+of+hair+keratin%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+A%22%5BJournal%5D)">X-ray studies of the structure of hair, wool, and related fibers. II. The molecular structure and elastic properties of hair keratin.</a> Philos Trans R Soc Lond A. 232, 333-394 (1934).</li>
<li>Geddes, A. J., Parker, K. D., Atkins, E. D., Beighton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BCross-beta%26%2334%3B+conformation+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">&#34;Cross-beta&#34; conformation in proteins.</a> J Mol Biol. 32 (2), 343-358 (1968).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+amyloid+cross-beta+spines+reveal+varied+steric+zippers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of amyloid cross-beta spines reveal varied steric zippers.</a> Nature. 447 (7143), 453-457 (2007).</li>
<li>Makin, O. S., Atkins, E., Sikorski, P., Johansson, J., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+amyloid+fibril+formation+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for amyloid fibril formation and stability.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (2), 315-320 (2005).</li>
<li>Eanes, E. D., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+studies+on+amyloid+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction studies on amyloid filaments.</a> J Histochem Cytochem. 16 (11), 673-677 (1968).</li>
<li>Kirschner, D. A., Abraham, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+from+intraneuronal+paired+helical+filaments+and+extraneuronal+amyloid+fibers+in+Alzheimer+disease+indicates+cross-beta+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction from intraneuronal paired helical filaments and extraneuronal amyloid fibers in Alzheimer disease indicates cross-beta conformation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (2), 503-507 (1986).</li>
<li>Ke, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+century+of+amyloids%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Half a century of amyloids: Past, present and future.</a> Chem Soc Rev. 49 (15), 5473-5509 (2020).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid. 21 (4), 221-224 (2014).</li>
<li>Morris, K. L., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+fiber+diffraction+studies+of+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray fiber diffraction studies of amyloid fibrils.</a> Methods Mol Biol. 849, 121-135 (2012).</li>
<li>Al-Hilaly, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+%28297-391%29+forms+filaments+that+structurally+mimic+the+core+of+paired+helical+filaments+in+alzheimer%27s+disease+brain%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Tau (297-391) forms filaments that structurally mimic the core of paired helical filaments in alzheimer's disease brain.</a> FEBS Lett. 594 (5), 944-950 (2020).</li>
<li>Makin, O. S., Sikorski, P., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearer%3A+A+new+tool+for+the+analysis+of+X-ray+fiber+diffraction+patterns+and+diffraction+simulation+from+atomic+structural+models%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Clearer: A new tool for the analysis of X-ray fiber diffraction patterns and diffraction simulation from atomic structural models.</a> Appl Cryst. 40 (5), 966-972 (2007).</li>
<li>Winn, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+CCP4+project+in+protein+crystallography%3A+An+example+of+a+collaborative+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">An overview of the CCP4 project in protein crystallography: An example of a collaborative project.</a> J Synchrotron Radiat. 10 (Pt 1), 23-25 (2003).</li>
<li>Squire, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+CCP13+software+and+the+strategy+behind+further+developments%3A+Stripping+and+modelling+of+fiber+diffraction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Fibre+Diffr+Rev%22%5BJournal%5D)">New CCP13 software and the strategy behind further developments: Stripping and modelling of fiber diffraction data.</a> Fibre Diffr Rev. 11, 7-19 (2003).</li>
<li>Makin, O. S., Serpell, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMakin%2C+OS+%22Amyloid+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22">Amyloid Proteins: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+pymol+molecular+graphics+system%22">The pymol molecular graphics system</a>. , DeLano Scientific. San Carlos, USA. (2002).</li>
<li>Jahn, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+architecture+of+cross-beta+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The common architecture of cross-beta amyloid.</a> J Mol Biol. 395 (4), 717-727 (2009).</li>
<li>Madine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+polymorphism+of+amyloid-like+fibrils+formed+by+region+20-29+of+amylin+revealed+by+solid-state+NMR+and+X-ray+fiber+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the polymorphism of amyloid-like fibrils formed by region 20-29 of amylin revealed by solid-state NMR and X-ray fiber diffraction.</a> J Am Chem Soc. 130 (45), 14990-15001 (2008).</li>
<li>Madine, J., Copland, A., Serpell, L. C., Middleton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-%CE%B2+spine+architecture+of+fibrils+formed+by+the+amyloidogenic+segment+nfgsvqfv+of+medin+from+solid-state+NMR+and+X-ray+fiber+diffraction+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-β spine architecture of fibrils formed by the amyloidogenic segment nfgsvqfv of medin from solid-state NMR and X-ray fiber diffraction measurements.</a> Biochemistry. 48 (14), 3089-3099 (2009).</li>
<li>Papapostolou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+nanoscale+order+into+a+designed+protein+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Engineering nanoscale order into a designed protein fiber.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (26), 10853-10858 (2007).</li>
<li>Steinmetz, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+models+of+de+novo+designed+cc%CE%B2-met+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic models of de novo designed ccβ-met amyloid-like fibrils.</a> J Mol Biol. 376 (3), 898-912 (2008).</li>
<li>Blake, C., Serpell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrotron+x-ray+studies+suggest+that+the+core+of+the+transthyretin+amyloid+fibril+is+a+continuous+%CE%B2-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Synchrotron x-ray studies suggest that the core of the transthyretin amyloid fibril is a continuous β-helix.</a> Structure. 4, 989-998 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnienia

Rozpraszanie rentgenowskie na włóknach może być wykorzystywane do oceny, czy próbka tworzy strukturę amyloidową oraz do uzyskania dalszych informacji na temat organizacji molekularnej białka lub peptydu prekursora wewnątrz włókien. Tutaj opisano metody, którymi można przygotować włókniste próbki do rozpraszania rentgenowskiego na włóknach, uzyskać dane i następnie je przeanalizować. Krytycznie, jakość uzyskanych danych zależy zarówno od uporządkowania wewnątrz pojedynczych włókien. Dlatego początkowa przygotowanie próbki...

Fibryle amyloidowe zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w grupie chorób znanych jako amyloidozy, w których białkowe fibryle gromadzą się w przestrzeniach pozakomórkowych tkanek1. Każda choroba charakteryzuje się określonym białkiem prekursorowym, które ulega zmianie konformacyjnej tworząc wysoce uporządkowane, stabilne fibryle białkowe2,3. Bardziej współczesna definicja fibryli amyloidowych obejmuje teraz fibryle gromadzące się w środowisku komórkowym. Ostatnio zidentyfikowano wiele układów funkcjonalnych, które wykorzystują strukturę amyloidową w celu zapewnienia stabilności, adhezji, a nawet przechowywania informacji. Pomimo szerokiej gamy struktur białkowych, które mogą samorzutnie łączyć się w fibryle amyloidowe, wszystkie one mają wspólną strukturę krzyżową4. Ta krzyżowa aranżacja została po raz pierwszy opisana przez Astbury dla białka białka kurzego jaja5, a później dalej wyjaśniona przez Geddesa dla jedwabiu krzyżowego6. W tej architekturze białka, fibryle składają się z pasm β, które biegną prostopadle do osi fibryli, a następnie układają się w arkusze β, które łączą się za pośrednictwem łańcuchów bocznych, tworząc to, co później nazwano zaciski steryczne7. To tworzy bardzo stabilną organizację utrzymywaną za pomocą wiązań wodorowych biegnący równolegle do włókna, obok oddziaływań hydrofobowych, elektrostatycznych i polarnych poprzez łańcuchy boczne8.
Wczesne badania strukturalne wykorzystywały dyfrakcję rentgenowską na włóknach do badania struktury fibryli amyloidowych, gdzie fibryle były ustawiane i orientowane w celu utworzenia pakietu fibryli amyloidowych, które mogły być umieszczone w wiązce rentgenowskiej dyfraktometru9,10. Wygenerowano ogólną strukturę fibryli amyloidowych, aby pasowała do wzorców dyfrakcyjnych z kilku fibryli amyloidowych wyodrębnionych z ludzkich tkanek chorobowych lub wyhodowanych in vitro4,, a to dostarczyło podstawy dla dalszych opisów strukturalnych11. W ostatnich latach postępy w rezonansie magnetycznym stanu stałego (ssNMR), mikrokrystalicznej dyfrakcji rentgenowskiej oraz kriogenicznej mikroskopii elektronowej (CryoEM) dostarczyły szczegółowych informacji atomowych dotyczących struktury krzyżowej11. Jednak metoda dyfrakcji rentgenowskiej na włóknach pozostaje ważna i użyteczna, dostarczając informacji dotyczących powtarzającej się organizacji białek. Ponadto, w niektórych przypadkach informacje dotyczące dłuższego zasięgu porządku mogą być dostępne. Podstawowo, dyfrakcja rentgenowska na włóknach jest często stosowana do potwierdzenia obecności fibryli amyloidowych utworzonych z różnych białek, a wzór krzyżowy jest jednym z głównych wymagań dla klasyfikacji złożonego włókna jako amyloidu12.
Tutaj opisujemy metodologię stosowaną do przygotowania fibryli amyloidowych i ich ustawienia do zbierania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich na włóknach. Ponadto, dostarczamy szczegółów, w jaki sposób dane dyfrakcyjne mogą być dalej analizowane w celu wygenerowania modelu strukturalnego, jego przewidywanego wzoru dyfrakcyjnego i porównania z danymi dyfrakcyjnymi z fibryli uzyskanych ex-vivo.

<table><tbody><tr><td>0.7 mm diameter X-ray&nbsp; kwarcowych kapilar szkła&nbsp;</td><td>GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany</td><td>Q-07-001-80</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilark 1,5 mm borosilicate</td><td>Harvard appatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)</td><td>BS4 30-0074</td><td>przykład, dostępny u innych producentów</td></tr><tr><td>Protein crystallography X-ray diffractometer</td><td>Różne</td><td></td><td>Różne producentów</td></tr></tbody></table>

amyloid i architektura krzyżowa beta

Amyloid and the Cross-Beta Architecture

Fibrile amyloidowe składają się z nieprawidłowo złożonego, samouzbrajanego białka zorganizowanego w dobrze określoną, powtarzalną strukturę. Są dobrze znane ze swojej ważnej roli w chorobach nieprawidłowego złożenia białek, w tym chorobie Alzheimera i cukrzycy typu 2, w których nierozpuszczalne fibrile amyloidowe osadzają się w tkankach. Ponadto stwierdzono, że odgrywają ważną funkcjonalną rolę w wielu organizmach, zapewniając wytrzymałość, rusztowanie i ochronę. Pierwsze modele strukturalne amyloidów opierały się na danych z dyfrakcji promieni X z paczek wyrównane fibrili amyloidowych. Wynikiem tego były wczesne modele ogólnej struktury krzyżowej-β, która została zastąpiona przez bardziej szczegółową analizę dyfrakcji z wysoce zorientowanych i półkrystalicznych próbek, co pozwoliło na uzyskanie szczegółów organizacji peptydów w powtarzalną architekturę. Skupiliśmy się na opisywaniu metod określania podstawowej architektury tych fibrili i opisaliśmy wspólne cechy fibrili amyloidowych z różnych źródeł patogennych, funkcjonalnych i syntetycznych. Opisujemy przygotowanie próbek, gromadzenie danych i następującą analizę danych w celu uzyskania modelu struktury, który można porównać z danymi eksperymentalnymi.

Przykład CcbMet24: Rysunek 1 przedstawia mikroskopowe zdjęcia elektronowe, na których widać wysoką gęstość fibril amyloidowych na siatce odpowiedniej do przygotowania próbki do badań rentgenowskich. Rysunek 2 opisuje różne tekstury, które można uzyskać z włóknistych próbek, takich jak pęczek włókien (Rysunek 2A), dysk (Rysunek 2B), mat/folia (<str...

Błony amyloidowe są formowane przez liczne białka, a powstałe włókna mają strukturę "krzyżowego arkusza β". Opisujemy tutaj, jak próbki włókien amyloidowych mogą być przygotowywane do dyfrakcji rentgenowskiej włókien i jak wzory mogą być analizowane.

Amyloid i architektura krzyżowa beta

Amyloid fibrils are made up of a misfolded, self-assembled protein organised into a well-defined, repetitive structure. They are well known for their ...

Nasze badania wykorzystują dyfrakcję promieni X na włóknach do zbadania struktury włókien amyloidowych krzyżowych beta i jej organizacji molekularnej. Ten protokół wykorzystuje dyfrakcję promieni X na włóknach do potwierdzenia krzyżowych wzorców beta i wyjaśnienia architektur włókien. Ten protokół umożliwia analizę strukturalną włókien amyloidowych od potwierdzenia organizacji krzyżowej beta do wyjaśnienia dalszych szczegółów molekularnych.Aby rozpocząć, wyrównaj włókna białkowe lub peptydowe, aby uzyskać pęczek, którego osie włókien są idealnie wszystkie równoległe. Roztop wosk z świeczki na płycie grzewczej, aż się upłynni. Używając szkła tnącego, wytnij 1-milimetrowe kapilary ze szkła borokrzemowego na długość około 2-3 centymetrów.Krótko zanurz wycięte kapilary w ciekłym wosku. Następnie zasysz wosk z świeczki dzięki działaniu kapilarnemu do około 1-2 milimetrów wewnątrz kapilary. Teraz użyj plastyliny, aby przymocować uszczelnione kapilary poziomo wewnątrz naczynia Petriego.Zachowaj odstęp 0,5-2 milimetrów między wypełnionymi woskiem końcami kapilarów. Za pomocą pipety ostrożnie zawieś kroplę 10 mikrolitrów roztworu włókien między wypełnionymi woskiem końcami dwóch kapilarów. Przykryj naczynie Petriego, aby chronić próbkę przed kurzem i pozwól im odparować przez noc.Następnie uszczelnij płytkę, aby pomóc w utrzymaniu kontrolowanego środowiska schnięcia. Aby wyrównać włókna amyloidowe w szklanej kapillarze, przymocuj strzykawkę 1-mililitrową z gumowym wężem do szerokiego końca silicyzowanej szklanej kapillary o średnicy 0,7 milimetra. Zasysz 2-3 centymetry zawiesiny włókien do kapillary.Uszczelnij jeden koniec kapillary za pomocą stopionego wosku i pozostaw drugi koniec otwarty, aby umożliwić odparowanie. Ułóż kapillarę pionowo i pozwól jej wyschnąć, aż uformuje się wysuszony dysk. Aby wyrównać włókna jako matę lub cienką warstwę, umieść próbkę o wysokiej koncentracji włókien na szklanej szklance i przykryj przed wysuszeniem na powietrzu przez 24 godziny.Ostrożnie zamontuj pęczek włókien na głowicy goniometru i ustal go tak, aby promień X przechodził przez pęczek. Jeśli używasz próbki z matą włókien, ustal ją tak, aby promień X przechodził przez krawędź maty. Zbadaj próbkę pod mikroskopem optycznym wyposażonym w krzyżowy polaryzator, aby obserwować dwójłomność.Umieść próbkę na promieniu X w oparciu o to, czy jest to pęczek włókien, mata czy dysk. Zbierz wzór dyfrakcji przy użyciu sprzętu do promieni X lub promieniowania synchrotronowego. Aby wykonać analizę danych, wczytaj plik do oprogramowania do analizy wzorów dyfrakcji CLEARER.Przejdź do Wzoru Dyfrakcji i Ustawienia Dyfrakcji, aby wprowadzić ustawienia dyfrakcji, w tym rozmiar piksela, źródło promieni X i odległość od próbki do detektora. Kliknij Przetwarzanie Obrazu i Obróć, aby obrócić obraz dyfrakcji tak, aby merydian był pionowy. Użyj modułu centralizacji, przechodząc do Wzoru Dyfrakcji i klikając na Center Image, aby scentralizować obraz.Zdefiniuj osie merydianu i równika. Zapisz scentralizowany obraz do dalszej analizy. Następnie określ odpowiedni kąt wzdłuż merydianu i równika.Kliknij Wzorzec Dyfrakcji, a następnie moduł Radialnie Średnia, aby wygenerować wykres pozycji sygnału dyfrakcji. wobec intensywności. Przejdź do modułu Peak Find z menu Wzorzec Dyfrakcji, aby zmierzyć i automatycznie wydać sygnał dyfrakcji.Dostosuj szerokość wyszukiwania szczytu, aby wykryć prawdziwe sygnały bez szumów. Użyj opcji zoomu i pomiaru, aby zweryfikować wynik sygnału dyfrakcji za pomocą wyszukiwania szczytów. Zbadaj potencjalne wymiary komórki elementarnej za pomocą modułu Optymalizacji Komórki Elementarnej.Wprowadź wstępne oszacowania na podstawie silnych sygnałów równikowych i określ minimalne i maksymalne indeksy dla wyszukiwania komórek. Oblicz potencjalne wymiary komórki elementarnej i porównaj przewidywane pozycje sygnału dyfrakcji z obserwowanymi odbiciami. Wybierz komórkę elementarną, która najlepiej pasuje do danych i próbki.Aby zbudować modele molekularne, stwórz układy 3D peptydów w konfiguracji arkusza beta, która pasuje do określonej komórki elementarnej. Upewnij się, że wszystkie składniki związane z symetrią są zawarte. Następnie kliknij Symulację Dyfrakcji, a następnie Struktury i Generator Łańcucha Struktury i załaduj model PDB.Przypisz oś włókna i oś wiązki, wprowadź wymiary komórki elementarnej, a następnie sprawdź, czy nie ma zderzeń sterycznych. Przejdź do Symulacji Dyfrakcji i kliknij Symulację Dyfrakcji Włóknistej, aby wczytać współrzędne PDB do modułu Symulacji Dyfrakcji Włóknistej. Wprowadź kierunek osi włókna, orientację wiązki, wymiary komórki elementarnej, ustawienia źródła promieni X i detektora, a następnie kliknij Symuluj, aby uruchomić symulację.Upewnij się, że oś wiązki jest prostopadła do osi włókna. Następnie przejdź do Pliku

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Protokół opisuje eksperymentalne metody uzyskiwania stabilnego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I poprzez potencjalne β podstawienia 2-mikroglobuliny (β2m) od różnych gatunków. Przeprowadzono porównanie strukturalne MHC I stabilizowanego β homologicznym i heterologicznym 2 m.

Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

W artykule przedstawiono protokół przetwarzania danych wirusów grypy obrazowanych za pomocą tomografii krioelektronowej oraz późniejszego uśredniania glikoproteiny hemaglutyniny subtomogramem. Protokół ten obejmuje proces krok po kroku, od wstępnego przetwarzania obrazu po ostateczne udoskonalanie modelu.

Określanie struktury hemaglutininy w rozdzielczości subnanometrowej na podstawie tomografii krioelektronowej wirusów grypy

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Poznaj metody dyfrakcji promieniowania X włókien do badania struktury amyloidów i ich organizacji molekularnej. Protokół ten umożliwia analizę architektury fibryl z potwierdzeniem organizacji krzyżowo-beta.

Amyloid i architektura krzyżowa beta

Przeglądaj więcej filmów