Name: Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj skalowalny protokół ekspansji komórek CAR-T i CIK w urządzeniach G-Rex zgodnych z GMP. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność i funkcjonalność komórek przy minimalnej interwencji użytkownika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Konstrukcja CAR została dostarczona w ramach MTA przez St. Jude Children's Research Hospital. Prace te zostały wsparte przez grant ScaleReady G-Rex 2025; Uniwersytet w Padowie - SOMMAGGIO_BIRD24_01; Fundacja AIRC pod programem 5x1000 2019 - ID. 22759; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Badania te otrzymały fundusze "Ricerca Corrente" od włoskiego Ministerstwa Zdrowia na pokrycie kosztów publikacji. Figury zostały stworzone za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 9 i BioRender.com.

<ol><li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">NK cells for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).</li>
<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+cytokine-induced+killer+cells+overcome+CAR-T+cell+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits.</a> Front Immunol. 14, 1229540(2023).</li>
<li>Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((30+years+of+CIK+cell+therapy%3A+Recapitulating+the+key+breakthroughs+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective.</a> J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).</li>
<li>Bayatipoor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NKT+cells+in+cancer+immunotherapy-from+bench+to+bed%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed.</a> Med Oncol. 40, 29(2022).</li>
<li>Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+by+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy by γδ T cells.</a> Science. 386, 6717(2024).</li>
<li>Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+melanoma%3A+A+viable+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option.</a> J Immunother Cancer. 6, 102(2018).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+The+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+world+of+TCR-T+cell+trials+against+cancer%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review.</a> Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).</li>
<li>Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).</li>
<li>Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors%3A+The+paradigm+of+cytokine-induced+killer+%28CIK%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).</li>
<li>Palmerini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-free+protocol+for+the+ex+vivo+expansion+of+cytokine-induced+killer+cells+using+gas-permeable+static+culture+flasks%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks.</a> Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).</li>
<li>Pietà, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+therapeutic+strategy+for+B-cell+malignancies+that+combines+obinutuzumab+and+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells.</a> J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).</li>
<li>Pievani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+capability+of+CD3%2BCD56%2B+CIK+cells%2C+a+T-cell+subset+that+acquires+NK+function+and+retains+TCR-mediated+specific+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity.</a> Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).</li>
<li>Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+cytokine-induced+killer+cell+activity+by+CD16+engagement+with+clinical-grade+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies.</a> OncoImmunology. 5, e1199311(2016).</li>
<li>Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+and+unmodified+cellular+approaches+to+enhance+graft+versus+leukemia+effect%2C+without+increasing+graft+versus+host+disease%3A+The+use+of+allogeneic+cytokine-induced+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells.</a> Front Immunol. 15, 1459175(2024).</li>
<li>Rotte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+correlation+for+CAR-T+cells%3A+A+systematic+review+of+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies.</a> J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).</li>
<li>Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+update+of+the+international+registry+on+cytokine-induced+killer+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy.</a> J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).</li>
<li>Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+expansion+in+bioreactors%3A+Upgrading+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy.</a> J Biol Eng. 15, 13(2021).</li>
<li>Smith, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+expansion+in+a+Xuri+Cell+Expansion+System+W25%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25.</a> Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).</li>
<li>Ludwig, J., Hirschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+process+optimization+for+large-scale+CAR+T+expansion+using+the+G-Rex+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform.</a> Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).</li>
<li>Vera, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J Immunother. 33, 305-315 (2010).</li>
<li>Bajgain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+production+of+suspension+cells+using+the+G-Rex+%26%2334%3BM%26%2334%3B+series%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex &#34;M&#34; series.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).</li>
<li>Talleur, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+CD27-depleted+cells+in+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy.</a> Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).</li>
<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
</ol>

Protokół ten określa wdrożenie wydajnej i skalowalnej platformy do generowania dwóch różnych produktów ACT, mianowicie komórek CAR-T i CIK, pochodzących z PBMC wykorzystujących systemy hodowli G-Rex. Wdrożyliśmy funkcjonalne i fenotypowe testy dowodu koncepcji, aby zweryfikować skalowalność podejścia. Wykazaliśmy, że zarówno fenotyp, jak i aktywność rozszerzonych komórek są utrzymywane podczas skalowania, co zapewnia odpowiedniość systemu do zastosowań badawczych i bezpośredniego przekładu klinicznego. Rzeczywiście, udało nam się wykazać, że zarówno komórki CAR-T, jak i CIK mogą być efektywnie rozszerzane z wysoką wydajnością komórek, przy jednoczesnym zachowaniu funkcjonalnego fenotypu efektora oraz silnej cytotoksyczności specyficznej dla antygenów w różnych hodowlanych urządzeniach.
W połączeniu z technologią membran przepuszczalnych przez gaz urządzeń hodowlanych, protokół ten prowadzi do szybszej kinetyki rozszerzalności, ogranicza ręczną obsługę i umożliwia stałe wysokie plony między dawcami. Te cechy sprawiają, że protokół jest wysoce powtarzalny i mniej pracochłonny w porównaniu ze standardowymi systemami hodowli20,21, które często wymagają wymiany wielu mediów oraz zwiększonego ryzyka utraty i zanieczyszczenia komórek.
Ponadto protokół ten umożliwia płynne przejścia między skalami produkcyjnymi: od małych otwartych systemów (G-24, odpowiedni do badań przedklinicznych i przesiewowy, na przykład konstrukcji CAR, kombinacji cytokinowych lub zmienności dawcy) do większych systemów otwartych (G-6M, do walidacji przed-GMP), a ostatecznie do większych systemów zamkniętych (do produkcji GMP). Jak opisano w niniejszym badaniu, przejście od małych do większych systemów otwartych wymaga jedynie proporcjonalnych korekt objętości i wejścia komórek względem rozmiaru urządzenia, co stanowi istotną przewagę praktyczną. Podobnie, jedyną implementacją potrzebną do przejścia z systemów otwartych na zamknięte dla produkcji GMP, a tym samym do adaptacji protokołu G-6M do produkcji GMP na dużą skalę, jest wykorzystanie odpowiednich odczynników klasy GMP oraz urządzeń zamkniętych (G-10M-CS o powierzchni 10 cm2, odpowiadającej pojedynczemu odwiertu G-6M, lub G-100M-CS o powierzchni 100 cm², odpowiadający otwartemu odpowiednikowi G-100M) bez dalszych modyfikacji samego protokołu. Te zamknięte urządzenia różnią się od swoich otwartych odpowiedników integracją sterylnych połączeń rur do automatycznego zarządzania mediami, które współpracują z pompą do obsługi cieczy (GatheRex), tworząc całkowicie zamknięte środowisko. To podejście zamkniętego systemu eliminuje ręczną wymianę nośników i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia, co czyni je idealnym dla środowisk produkcyjnych zgodnych z GMP, gdzie sterylność i powtarzalność są kluczowe. Warto zauważyć, że skalowalność stanowi kluczową cechę łączącą wczesne etapy odkrywania z translacją kliniczną, szczególnie w środowiskach akademickich lub wczesnych biotechnologicznych z ograniczonymi zasobami.
Dalsze wdrożenie tego protokołu w kierunku pełnej zgodności z GMP powinno uwzględnić przejście z mediów zawierających FBS na formuły bezseryjne/ksenogeno, zgodnie z aktualnymi trendami regulacyjnymi FDA i EMA, aby wyeliminować zmienność między partiami, wyeliminować potencjalne ryzyko zanieczyszczenia ksenogenicznego oraz zwiększyć zgodność z przepisami27.
Co więcej, minimalna interwencja wymagana przez proponowany system rozbudowy stanowi idealną platformę do wdrożenia wielowymiarowego profilowania fenotypowego28 poprzez redukcję artefaktów wywołanych procedurą, które mogłyby zakłócić analizę fenotypową podczas procesów produkcyjnych. Dodatkowo, poza komórkami CAR-T i CIK, system może być wysoce adaptowalny do innych populacji limfocytów oraz zmodyfikowanych komórek odpornościowych, co zwiększa jego zastosowanie w rozwoju immunoterapii29,30.
Chociaż protokół jest solidny i nie wymaga modyfikacji, kilka kroków jest szczególnie istotnych dla sukcesu. Dla ekspansji komórek CIK kluczowe jest odpowiednie wyznaczenie czasu dodawania cytokin, aby zapewnić optymalną różnicację i ekspansję. W przypadku komórek CAR-T transdukcja powinna nastąpić 24 godziny po aktywacji, aby zmaksymalizować wydajność, a lentiwirusowe alikwoty powinny być rozmrażane tylko raz, ponieważ powtarzające się cykle zamarzania i rozmrażania znacząco obniżają efektywność transdukcji31.
Zmienność biologiczna między pierwotnymi przygotowaniami komórkowymi naturalnie przyczynia się do różnic w tempie rozrostu i aktywności funkcjonalnej, odzwierciedlając różnorodność dawców. Ta nieunikniona i wewnętrzna zmienność może być skutecznie zarządzana poprzez równoległe rozszerzenia od wielu dawców, zapewniając solidne i powtarzalne wyniki w różnych eksperymentach.
Podsumowując, protokół ten umożliwia szybkie, skalowalne i niezawodne rozszerzanie funkcjonalnych limfocytów efektorowych bezpośrednio z PBMC, oferując elastyczność zarówno w badaniach na wczesnej etapie, jak i w translacji klinicznej na dużą skalę. System ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek i modyfikacji genetycznych, zapewniając wszechstronną platformę do rozwoju immunoterapii.

Terapia komórkami adopcyjnymi (ACT) stała się ważnym filarem zaawansowanych terapii w leczeniu nowotworów. Podejście to opiera się na podawaniu ex vivo rozszerzonych produktów komórkowych w celu osiągnięcia skuteczności przeciwnowotworowej1. Do tej pory w ACT wykorzystano wiele typów komórek, od podejść antygenowo-specyficznych, np. naturalnego zabójcy (NK)2, zabójcy indukowanego cytokinami (CIK)3,4, naturalnego zabójcy T (NKT)5 lub γδ T6, po wysoce specyficzne i spersonalizowane komórki, takie jak limfocyty infiltrujące guzy (TILs)7 oraz inżynieryjne terapie komórkowe, np. chimeryczne receptory antygenowe (CAR)1, Komórki receptorów 8 i T (TCR) 9,10.
Komórki CAR-T to genetycznie zmodyfikowane komórki T powstające w wyniku transdukcji wirusowej ex vivo , aby wyrazić syntetyczny receptor odpornościowy, zaprojektowany do rozpoznawania konkretnego celu molekularnego. Struktura CAR składa się z antygenowo-specyficznego przeciwciała fragmentu zmiennego o zmiennej zmienności (scFv) w połączeniu z wewnątrzkomórkowymi domenami sygnalizacyjnymi, w tym łańcuchem TCRζ oraz cząsteczkami kostymulującymi. Po zaangażowaniu antygenów domena wewnątrzkomórkowa dostarcza sygnały aktywacyjne sprzyjające proliferacji limfocytów T i aktywności przeciwnowotworowej11.
Komórki CIK to heterogeniczna populacja aktywowanych limfocytów T, które nabywają ekspresję CD56 podczas ekspansji ex vivo z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub krwi pępowinowej (UCB)12. To rozszerzenie obejmuje stymulację interferonem γ (IFN-γ), przeciwciałem monoklonalnym przeciw CD3 oraz interleukiną-2 (IL-2), po czym następuje hodowla w IL-2 przez 14 dni. Komórki CIK funkcjonalnie przypominają zarówno komórki NK, jak i T, wykazując aktywność przeciwnowotworową zarówno poprzez mechanizmy niezależne od kompleksu tkankowego (MHC) i zależneod tego typu 13,14,15,16. Te właściwości pozwalają komórkom CIK być wykorzystywane zarówno w środowiskach terapeutycznych allogenicznych, jak i autologicznych, przy minimalnym ryzyku choroby przeszczepu kontra-gospodarza (GvHD)17.
W praktyce klinicznej zarówno terapie komórkowe CAR-T, jak i CIK wymagają podawania dużej liczby komórek. Komórki CAR-T są podawane w dawce 50-200 milionów dawek na pacjenta18 lat. Podobnie komórki CIK są zazwyczaj podawane w dawkach do 10 miliardów komórek na infuzję, przy czym pacjenci często otrzymują wiele wlewów w zależności od protokołu leczenia19. Tradycyjne metody hodowli komórkowej z użyciem kolb lub płyt są nieefektywne, czasochłonne i wymagają częstego przepuszczania, co uniemożliwia dużą ekspansję i zwiększa ryzyko skażenia. Zautomatyzowane lub półautomatyczne systemy wykorzystujące hodowle workowe lub bioreaktory pozwalają na dużą skalę ekspansji, ale mają ograniczenia, np. naprężenia ścinające, konieczność regulacji gęstości i częstej perfuzji medium20,21, a także obsługa jednej partii naraz, co prowadzi do wysokich kosztów zarówno w kontekście akademickim, jak i przemysłowym. W tej trudnej sytuacji alternatywą jest urządzenie o szybkim rozszerzaniu przepuszczalnym dla gazów (G-Rex), statyczna metoda hodowli wyposażona w membranę krzemową na dnie odwiertu, która zapewnia efektywną wymianę tlenu i zwiększanie wysokości zbiorników, umożliwiając dużą pojemność średniej objętości. System wspiera wzrost komórek bez wymiany medium lub regulacji gęstości22,23. Systemy G-Rex-M wykazały skalowalność do 5000 mL i są kompatybilne z automatycznymi systemami pobierania, zapewniając platformę wolną od zanieczyszczeń i zamkniętą hodowlę, którą łatwo przekładać z środowiska akademickiego na kliniczną do opracowywania zaawansowanych produktów leczniczych (ATMPs)24.
W opisanej procedurze wykorzystaliśmy zalety i cechy urządzeń G-Rex, aby zoptymalizować protokół rozbudowy zarówno komórek CAR-T, jak i CIK. Wykazaliśmy, że oba typy komórek można efektywnie rozszerzać i skalować, utrzymując spójny fenotyp i profil funkcjonalny w różnych systemach hodowli. Schematyczny przegląd protokołu rozbudowy zarówno dla komórek CIK, jak i CAR-T przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołów rozbudowy komórek CAR-T i CIK z wykorzystaniem urządzeń hodowli G-24 lub G-6M. Komórki CAR-T i CIK są rozszerzane z izolowanych PBMC od dnia 0. W celu rozbudowy komórek CAR-T PBMC są stymulowane w pierwszym dniu przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, genetycznie modyfikowane w dniu 2, a następnie hodowane suplementacją hIL-7 i hIL-15 co 3-4 dni, z końcowym pobraniem do testów funkcjonalnych w dniu 9. W formacie G-6M suplementacja cytokin jest ograniczona do 2. dnia, bez konieczności dalszego karmienia cytokiny przez cały okres hodowli. W celu rozszerzenia komórek CIK PBMC są stymulowane pierwszego dnia rhIFN-γ a drugiego dnia przeciwciałem anty-CD3 i rhIL-2, które następnie podaje się co 3-4 dni. W przypadku G-24 wymagana jest zmiana medium równocześnie z suplementacją cytokiną. Komórki CIK są pobierane 14 dnia do dalszych testów funkcjonalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

<table><tbody><tr><td>Błyskotliwy bufor barwny</td><td>BD Biosciences</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała CD28, antyludzkie</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-375</td><td>Klon 15E8</td></tr><tr><td>Przeciwciała CD3, antyludzkie</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-387</td><td>Klon OKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>740147</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD314 APC (NKG2D)</td><td>Biolegenda</td><td>320808</td><td>Klon 1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>563875</td><td>Klon SK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>563429</td><td>Klon HI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>Biolegenda</td><td>318306</td><td>Klon HCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555543</td><td>Klon FREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BD Biosciences</td><td>562428</td><td>Klon RPA-T8</td></tr><tr><td>Zestaw do Proliferacji CellTrace Violet Cell</td><td>ThermoFisher naukowy</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylsulfotlenek (DMSO)</td><td>ThermoFisher naukowy</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosforanowa Buforowana sól fizjologiczna (D-PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Tablica E 16</td><td>Agilent</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodu (FBS), wartość</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Naprawialna plama żywotności 780 (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24 studni, płyta i płyta 24;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6M Well Plate&nbsp;</td><td>Wilson Wolf</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES</td><td>Lonza</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>Jego przeciwciało</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>Album ludzki 20%</td><td>CSL Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane IL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Linia komórkowa raka piersi &nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór fizjologiczny (0,9% chlorku sodu)</td><td>Monico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Linia komórkowa chłoniaka Burkitta;</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IFN-gamma</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany IL-2 (Proleukina)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>Invitrogen</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>Instytut Pamięci Roswell Park 1640 (RPMI-1640)</td><td>Euroklon</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>Stabilna L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie Trypan-Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence analiza komórek w czasie rzeczywistym</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Bezsurowiczne pośrednik komórkowy hematopoetycznej</td><td>Lonza</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez car-t i cytokiny w urządzeniach skalowalnych gmp

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

Terapie komórkami adopcyjnymi (ACT) szybko się rozwijały w ostatnich latach, odgrywając kluczową rolę w immunoterapii nowotworowej i znacząco wpływając na wyniki leczenia. Kluczowym etapem w rozwoju terapii komórkowej, zarówno na etapie przedklinicznym, jak i klinicznym, jest proces produkcji. Konwencjonalne metody hodowli statycznej wymagają częstej manipulacji komórkową i często są ograniczone przez zmniejszoną wymianę gazów oraz dostarczanie składników odżywczych, co może obniżać wydajność i fenotyp komórek. Przedstawiamy tutaj krok po kroku, powtarzalny i skalowalny protokół ekspansji ex vivo dwóch produktów ACT, mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz Cytokine-Induced Killer (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex). Urządzenia G-Rex zostały specjalnie zaprojektowane, aby zwiększyć wymianę składników odżywczych i wspierać hodowle o wysokiej gęstości przy minimalnej ingerencji użytkownika. Wśród różnych podejść ACT, komórki CAR-T wykazały niezwykłe sukcesy w leczeniu nowotworów hematologicznych, umożliwiając szybki rozwój od badań eksperymentalnych do zastosowań klinicznych. Oprócz komórek CAR-T, komórki CIK były również szeroko stosowane w badaniach klinicznych ze względu na charakterystyczny fenotyp oraz brak działań niepożądanych związanych z leczeniem oraz choroby przeszczepu przeciwko gospodarzowi (GvHD). Protokół ten określa kluczowe kroki techniczne dla obu typów komórek, zaczynając od izolacji i zasiewania komórek jednojądrowych krwi obwodowej (PBMC). W skrócie, PBMC są stymulowane przeciwciałami anty-CD3/CD28, po czym następuje transdukcja lentiwirusowa w celu rozszerzenia komórek CAR-T, lub interferon-γ (IFN-γ), przeciwciało przeciwCD3 oraz interleukina 2 (IL-2) w celu uzyskania komórek CIK. Cytometria przepływowa jest stosowana do monitorowania żywotności i fenotypu komórek, a w celu potwierdzenia potencjału terapeutycznego produktu komórkowego i potwierdzenia skalowalności podejścia wykonywane są testy funkcjonalne. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi praktyczne rozwiązanie do produkcji dużej liczby komórek efektorowych w warunkach przedklinicznych, ułatwiając zastosowanie kliniczne w kilku populacjach komórek odpornościowych. Wreszcie, oferuje skalowalne rozwiązanie do produkcji ogniw efektorowych o wysokiej wydajności.

Opisany tutaj protokół zapewnia efektywny i solidny przepływ pracy dla ex vivo rozszerzania i inżynierii ogniw efektorowych z izolowanych PBMC, mianowicie komórek CAR-T i CIK. Metoda ta wymaga minimalnej manipulacji komórkami i wykorzystuje zdolność wymiany gazów urządzeń G-Rex, zapewniając lepszą dostępność składników odżywczych i natlenienie w porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli statycznej23,24. Kluczową zaletą tego protokołu jest jego inherentna skalowalność od małych urządzeń 24-dołkowych (G-24), odpowiednich do badań przedklinicznych, po większe urządzenia 6M (G-6M), kompatybilne z potrzebami translacyjnymi lub klinicznymi produkcyjnymi, bez konieczności stosowania jakichkolwiek zmian w protokole poza skalowaniem proporcjonalnym.
Korzystając z tego protokołu, zarówno komórki CAR-T, jak i CIK zostały pomyślnie rozbudowane równolegle z zdrowych dawców PBMC w formatach G-24 i G-6M, jak opisano w sekcjach 2-4. Pod koniec okresu hodowli oba typy komórek wykazywały dużą ekspansję fałdową i żywotność, z porównywalną proliferacją między dwoma formatami urządzeń (Rysunek 2, Tabela Uzupełniająca 1, Tabela Uzupełniająca 2), co podkreśla powtarzalność protokołu w różnych skalach hodowlanych.
Aby zweryfikować skalowalność urządzeń hodowlanych, komórki efektorowe zostały dodatkowo scharakteryzowane fenotypowo i funkcjonalnie. Dla komórek CD19 CAR-T zidentyfikowaliśmy ekspresję CAR i oceniliśmy podzbiory CD4+ i CD8+, zauważając przewagę komórek CD19 CAR+ CD8+ T (Rysunek 3A-B, Tabela Uzupełniająca 1). Dla komórek CIK oceniliśmy częstość populacji T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) i CIK (CD3+CD56+) (Rysunek 3D), a także ekspresję receptora aktywującego NKG2D (Rysunek 3E, Tabela Uzupełniająca 2). Ponadto zaobserwowaliśmy ogólnie porównywalne fenotypy i ekspresję specyficznych markerów populacyjnych pomiędzy formatami hodowli G-24 i G-6M zarówno dla komórek CAR-T, jak i CIK. Status różnicowania zarówno produktów komórkowych CD19 CAR-T, jak i CIK został przeanalizowany za pomocą barwienia CD62L i CD45RA (Rysunek 3C-F, Tabela Uzupełniająca 1, Tabela Uzupełniająca 2), co wykazało podobne fenotypy pamięci i efektorów między komórkami hodowanymi w formatach G-24 i G-6M. Wyniki te pokazują, że skalowanie procesu nie narusza integralności fenotypowej ani statusu różnicowania populacji rozszerzonych komórek efektorowych.
Na koniec, aby ocenić moc funkcjonalną, zastosowaliśmy testy cytotoksyczności specyficzne dla celu. Zarówno komórki CD19 CAR-T, jak i CIK rozszerzające się w obu urządzeniach wykazywały silną aktywność cytolityczną, potwierdzając zachowanie właściwości funkcjonalnych w różnych skalach (Rysunek 4). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wspierają przydatność rozszerzonych produktów do dalszych zastosowań w modelach przedklinicznych oraz potencjalnie testach klinicznych.
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Proliferacja i żywotność komórek CD19 CAR-T i CK. Komórki CAR-T (n = 5) i komórki CIK (n = 6) rozwinięte z PBMC na płytkach G-24 i G-6M zostały zebrane odpowiednio w dniu 9 i 14 ekspansji, aby przeprowadzić liczenie komórek oraz ocenę wzrostu fałdów (A-C) oraz procentu (B-D) komórek żywotnych. Histogramy reprezentują średnią ekspresję ± odchyleniu standardowym (SD), a kropki wskazują pojedynczych dawców (patrz Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2 dla wartości indywidualnych). Dane analizowano za pomocą dwustronnego testu t-t z wieloma parami (A-C) lub testu rangi Wilcoxona z dopasowanymi parami (B-D), z korekcją Holm-Sidak dla wielu porównań (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Ocena fenotypu komórek CD19 CAR-T i CIK rozszerzonych w urządzeniach G-24 i G-6M. Ekspresja cząsteczek CAR w komórkach CD19 CAR-T (n = 5) została przeanalizowana za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny (A) efektywności transdukcji w protokołach ekspansji G-24 i G-6M, a także ekspresji (B) CD4+/CD8+ oraz (C) podpopulacji naiwnych/pamięci w podzbiorze CD3+CAR+. Fenotyp komórek CIK objętości (n = 6) został przeanalizowany za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania (D) procentu CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) i T (CD3+CD56-), a także ekspresji (E) NKG2D oraz (F) naiwnej/pamięciowej podpopulacji w podzbiorze CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naiwna (CD45RA+CD62L+), pamięć centralna (CM, CD45RA-CD62L+), pamięć efektorowa (EM, CD45RA-CD62L-) oraz pamięć efektorowa CD45RA (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramy reprezentują średnią ekspresję ± SD, a kropki wskazują pojedynczych dawców (patrz Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2 dla wartości indywidualnych). Dane analizowano za pomocą dwustronnego testu t-test wieloparowy (B-C-D-F) lub dwustronnego testu rangi dopasowanego Wilcoxona (A-E), z korekcją Holm-Sidak dla wielu porównań (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Ocena cytotoksyczności komórek CD19 CAR-T i komórek CIK. (A) Specyficzną lizę komórek CD19 CAR-T (pomarańczowych, n = 5) lub nietransdukowanych (UTD) (szarych, n = 5) przeciwko chłoniakowi Burkitta Raji (jako model linii komórkowej zawiesiny) wykonano za pomocą 6-godzinnego testu zabijania opartego na cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono jako średnią specyficzną lizę ± SD. (B) Cytotoksyczność komórek CIK hodowanych w G-24 (jasnoniebieski, n = 7) lub G-6M (ciemnoniebieski, n=6) w porównaniu z linią komórkową raka piersi MCF-7 (jako model linii adherentnej) była monitorowana co 15 minut przez 24 godziny za pomocą analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnio-specyficzną lizę ± SEM. Dane zostały przeanalizowane testem Mann-Whitney, korekcją Holm-Sidak pod kątem wielu porównań (*p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Strategia bramowania używana do analiz cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wykresy ilustrujące strategie bramkowe dla (A) charakteryzacji fenotypowej komórek CAR-T i (B) komórek CIK oraz (C) testu cytotoksyczności opartego na barwnikach fluorescencjowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Wzrost, żywotność i fenotyp hodowli komórek CD19 CAR-T od poszczególnych dawców. Dla każdego dawcy pokazano całkowitą liczbę komórek, wzrost fałdów, żywotność oraz charakterystykę fenotypową komórek T CD19-CAR pobranych 9 dnia hodowli w urządzeniach G-24 i G-6M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Wzrost, żywotność i fenotyp hodowli komórek CIK od poszczególnych dawców. Dla każdego dawcy pokazano całkowitą liczbę komórek, wzrost fałdów, żywotność oraz charakterystykę fenotypową komórek CIK pobranych w 14. dniu hodowli w urządzeniach G-24 i G-6M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

Opisujemy protokół G-Rex dla efektywnego i skalowalnego rozszerzania produktów terapii komórek adopcyjnych, w tym komórek CAR-T i CIK. Głównym wyzwaniem jest stworzenie protokołu wspierającego kultury o wysokiej gęstości, przy jednoczesnym zapewnieniu minimalnej ingerencji użytkownika i solidnej skalowalności klinicznej. Na początek ponownie zawiesij 2 razy 10 do mocy 6 świeżo izolowanych jednojądrowych komórek krwi obwodowej w 2 mililitrach kompletnej pożywki hodowlowej, uzupełnionej o 5% FBS, zwanej CCMF.Przenieś zawieszenie do studni statku hodowlanego G-Rex z 24 odwiertami. Dodaj 4 mikrolitry przeciwciał przeciw CD3 oraz 20 mikrolitrów przeciwciał przeciw CD28 bezpośrednio do każdego dołka, aby aktywować limfocyty T i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po nocnej stymulacji pobierz i policz aktywowane komórki T za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue do oceny żywotności, oblicz 1 razy 10 do mocy 6 żywotnych aktywowanych komórek do zasiewki dla każdej dołki naczynia hodowlanego G-Rex.Przełóż komórki do probówki i wiruj w 300 g przez 5 minut. Następnie przygotuj medium transdukcyjne dla każdego otworu, łącząc wymaganą objętość wektora lentiwirusowego z 5 mikrolitrami roztworu zapasowego 8 miligramów na mililitr siarczanu protaminy. Stosuj podłoże CM z dodatkiem 5% FBS i bez penicyliny lub streptomycyny, aby zwiększyć całkowitą objętość do 0,8 mililitra na dołek.Następnie ponownie zawiesić osadzone komórki w 0,8 mililitra przygotowanego medium transdukcyjnego i przenieść zawiesinę do nowej studni naczynia hodowlanego G-Rex. Wykonaj ten sam zabieg dla nietransdukowanego stanu kontrolnego, unikając dodawania wektora lentiwirusowego. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy użyciu 5% dwutlenku węgla.Drugiego dnia zwiększ objętość hodowli do łącznie 8 mililitrów na dołek, dodając 7,2 mililitra świeżego CCMF uzupełnionego ludzką interleukiną-7 i interleukiną-15. Następnie, 5. dnia, odśwież podłoże hodowlane, usuwając 6 mililitrów podłoża kondycjonowanego z każdego dołku, nie naruszając komórek na dnie. Zastąpić go 6 mililitrami świeżego CCMF zawierającego ludzką interleukinę-7 i interleukinę-15.W 9. dniu delikatnie usuń i wyrzuć 5 mililitrów kondycjonowanego medium z każdego dołku. Używając pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, ponownie zawiesij ogniwa CAR-T w pozostałych 3 mililitrach medium i przenieś je do rurki o pojemności 15 mililitrów. Policz komórki CAR-T i sprawdź ich żywotność za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue.Nasiono 1 razy 10 do mocy 6 świeżo izolowanych obwodowych komórek monojądrowych krwi na każdą jamkę naczynia hodowlanego G-24 w 8 mililitrach CCM uzupełnionym rekombinowanym ludzkim interferonem gamma. Inkubuj naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Pierwszego dnia, po 22 do 24 godzinach, należy dodać 4 mikrolitry przeciwciał przeciwCD3 bezpośrednio do każdego dołka oraz 4 mikrolitry rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2.Inkubuj komórki ponownie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla. Następnie w dniach 5, 9 i 13 usuwaj 6 mililitrów podłoża kondycjonowanego z każdego dołku, nie naruszając osiadłych komórek. Zamień go na 6 mililitrów świeżego CCM z dodatkiem rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2.W 14. dniu delikatnie usuń i wyrzuć 5 mililitrów kondycjonowanego medium z każdego dołku. Ponownie zawiesij komórki zabójcze indukowane cytokinami w pozostałych 3 mililitrach pożywki i przenieś je do rurki o pojemności 15 mililitrów. Oceń całkowitą liczbę komórek i żywotność za pomocą testu wykluczającego Trypan Blue.W przypadku ekspansji komórek CAR-T aktywuj komórki monojądrowe krwi obwodowej w dniu 0 oraz transdukcję lentiwirusową w dniu 1, jak pokazano wcześniej. Zachowaj wszystkie stężenia i gęstości siewu, ale skaluj wszystkie objętości, aby dopasowały format urządzenia G-6M. Drugiego dnia podnieś całkowitą objętość hodowli w każdym dołku do 100 mililitrów przy użyciu podłoża CCMF, oblicz i dodaj ludzką interleukinę-7 oraz ludzką interleukinę-15, aby uzyskać końcowe stężenia 10 nanogramów na mililitr każda.Dziewiątego dnia usuń około 90 mililitrów pożywki z każdego dołku za pomocą pipety serologicznej. Ponownie zawiesijcie komórki CAR-T, pozostałe 10 mililitrów pożywki, a zawiesinę komórkową przenieśli do probówki o pojemności 15 mililitrów do kolejnych testów. W przypadku ekspansji komórek CIK wykonaj zasiewanie komórek jednojądrowych krwi obwodowej w dniu 0 zgodnie z opisanym wcześniej protokołem rozszerzania komórek CIK.Pierwszego dnia podnieś całkowitą objętość hodowli do 100 mililitrów przy użyciu CCM i dodaj rekombinowane ludzkie przeciwciała interleukiny-2 oraz przeciwciała antyCD3. Co 3 do 4 dni uzupełniaj każdy dołek rekombinowaną ludzką interleukiną-2 w końcowym stężeniu 500 jednostek międzynarodowych na mililitr, nie zmieniając podłoża. Czternastego dnia usuń około 90 mililitrów pożywki z każdego dołku za pomocą pipety serologicznej.Na koniec należy ponownie zawiesić komórki zabójcze indukowane cytokinami w pozostałych 10 mililitrach podłoża i przenieść je do probówki o mocy 15 mililitrów do dalszych badań. Zarówno komórki CD19 CAR-T, jak i CIK, które rozrastały się równolegle z zdrowych dawców krwi obwodowej monojądrowych w urządzeniach G-24 i G-6M, wykazywały dużą ekspansję fałdową i żywotność z porównywalną proliferacją między tymi dwoma formatami. Dla komórek CD19 CAR-T ekspresja CAR oraz dodatnie podzbiory CD4 i CD8 były porównywalne w urządzeniach G-24 i G-6M.W populacji komórek CIK w całości częstotliwość populacji T, NK i CIK oraz ekspresja receptora aktywującego NKG2D były równe na różnych skalach. Profil różnicowania komórek CD19 CAR-T i CIK, w tym podpopulacji naiwnych, pamięci centralnej, efektorowej oraz efektorowej pamięci CD45RA pozytywnej, był podobny między formatami rozszerzania G-24 i G-6M. Komórki CD19 CAR-T rozszerzały się zarówno w urządzeniach G-24, jak i G-6M, wykazując silną aktywność cytolicką przeciwko komórkom docelowym chłoniaka Burkitta, potwierdzając funkcjonalną zachowanie na dużą skalę.Komórki CIK hodowane w urządzeniach G-24 i G-6M wykazały silną cytotoksyczność wobec komórek docelowych raka piersi MCF-7 z nakładającymi się krzywymi lizy na przestrzeni 24 godzin. Nasz protokół G-Rex pokonuje złożone przeszkody skalowania, umożliwiając płynne i proporcjonalne przejście produkcji produktów komórkowych z przedklinicznej do klinicznej. Nasz protokół jest wysoce powtarzalny i mniej pracochłonny niż standardowe przedkliniczne systemy hodowli komórek, co prowadzi do stałych wysokich wydajności u dawców.Rozwijamy terapię komórkami adopcyjnymi do zastosowań klinicznych, standaryzując protokół i umożliwiając łatwiejsze zastosowanie translacyjne dla pacjentów.

efficient-rapid-generation-car-t-cytokine-induced-killer-cells-gmp

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Tutaj prezentujemy protokół do genetycznej edycji komórek CAR-T za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Wykorzystanie CRISPR/Cas9 do wyeliminowania GM-CSF w komórkach CAR-T

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Szczegółowy protokół jest dostępny dla użycia technologii CRISPR/Cas9 w celu osiągnięcia wysoce efektywnego docelowego wkręcania dużych, multicistronicznych konstruktów w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pośrednictwem homologii (HMEJ) szlaku naprawy DNA. Limfocyty T zmodyfikowane za pomocą tego protokołu adaptowalnego do cGMP utrzymują doskonałą ekspansję komórek, cytotoksyczność i produkcję cytokin.

Inżynieria niewirusowa pierwotnych ludzkich limfocytów T poprzez ukierunkowaną integrację dużych matryc DNA za pośrednictwem homologii

Poznaj skalowalny protokół ekspansji komórek CAR-T i CIK w urządzeniach G-Rex zgodnych z GMP. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność i funkcjonalność komórek przy minimalnej interwencji użytkownika.

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

Przeglądaj więcej filmów