In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Nasza praca pokazuje, jak VCP lub p97 działa jako cytosolowy obrońca przed wieloma różnymi patogenami. To otwiera potencjał VCP lub p97 do zastosowań terapeutycznych i strategii bioinżynierii. Oprócz rutynowej biochemii, stosuje się mikroskopię superrozdzielczą, kriogeniczną EM, kriogeniczną ET, aby ustalić, jak te efektory gospodarza organizują się na patogenie, by je zniszczyć.

Na początek uprawiaj zapalenie płuc typu Streptococcus w ciągu nocy w sześciu szczepach serotypu dwa w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenku węgla w podłożu drożdżowym Todd Hewitt. Zaszczep jedną część nocnej hodowli w 10 części świeżego medium drożdżowego Todd Hewitt i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż gęstość optyczna w 600 nanometrach osiągnie 0,4. Następnie wymieszaj 900 mikrolitrów hodowli zapalenia płuc paciorkowca z 600 mikrolitrami 50% glicerolu i przechowuj zapas glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie rozmroz świeży zapas zapalenia płuc paciorkowca z temperatur od minus 80 stopni Celsjusza i całkowicie zaszczep go do pięciu mililitrów podłoża drożdżowego Todd Hewitt. Weź około 10 do mocy siedmiu komórek zapalenia płuc z paciorkowcem. Aby dokładnie przemyć komórki, ponownie zawiesi bakterie w buforze reakcji i wiruj w temperaturze 21 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Ponownie zawiesić granulkę z lizatem komórek ssaków 549. Następnie dodaj oczyszczoną ubikwitynę i jeden milimolowy adenozynotrifosforan i inkubuj mieszaninę przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Następnie przemywamy bakterie raz buforem reakcyjnym zawierającym jeden molowy mocznik, a następnie dwa kolejne przemycia tylko z buforem reakcji.

Napraw bakterie za pomocą 1% paraformaldehydu. Po utrwaleniu inkubuj komórki PBS, zawierającym jeden miligram na mililitr glicyny przez 15 minut. Następnie myj dwa razy PBS.

Przygotuj mieszaninę reakcji, łącząc ubikwitynę z innymi wymaganymi składnikami w buforze reakcji. Dostosuj całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej do 100 do 150 mikrolitrów. Ponownie zawiesić bakterie w mieszance reakcji zawierającej enzym ubikwityny i inkubować zawiesinę przez dwie godziny w temperaturze 27 stopni Celsjusza.

Po trzykrotnym przemyciu bakterii buforem reakcji zawierającym mocznik, utraż je 1% paraformaldehydem. Po utrwaleniu inkubuj komórki PBS, zawierającym jeden miligram na mililitr glicyny przez 15 minut. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 3% BSA przez godzinę w 27 stopniach Celsjusza i dwukrotnie myj próbkę PBS.

Ponownie zawiesić bakterie ubikwitynowane w roztworze przeciwciał pierwotnych, przygotowanych w wyższych stężeniach niż zwykle stosowane w testach immunofluorescencyjnych. Następnie inkubuj przez godzinę w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Po dwukrotnym umyciu bakterii PBS, ponownie zawiesi je w odpowiadającym przeciwciału wtórnym sprzężonym z Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 555.

Następnie odlew około 10 do 20 mikrolitrów oznaczonej próbki bakteryjnej na szklaną szkiełkę i wymieszaj od 5 do 10 mikrolitrów medium montażowego z DAPI lub bez. Przyłóż na próbkę klapkę i użyj bibuły, aby wysączyć nadmiar płynów. Połącz sześć mikromolowych VCP p97 z jednym mikromolowym NPLOC4 i jednym mikromolowym UFD-1.

Dostosuj objętość mieszaniny reakcyjnej do około 90 mikrolitrów, używając buforu reakcyjnego, i inkubuj na lodzie przez dwie godziny. Następnie należy dodać jeden do dwóch milimolowych adenozynatrifosforanów do mieszaniny reakcyjnej zawierającej p97 UFD-1, NPLOC4. Następnie połącz to z 10 do mocy siedmiu ubikwitynowanych komórek zapalenia płuc paciorkowca i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Bezpośrednio po zabiegu pobierz 10-mikrolitrową aliquotę z mieszaniny reakcji i wykonaj seryjne rozcieńczenie. Umieść 10 do 20 mikrolitrów każdej rozcieńczonej dawki na płytkach do infuzji serca mózgu. Oceń jednostki tworzące kolonie między punktami zerowymi a dwiema godzinami.

Oblicz procent żywotności bakterii, dzieląc dwugodzinne CFU przez zero godzin CFU i mnożąc przez 100. Istotną ubikwitancję paciorkowca pneumoniae zaobserwowano przy leczeniu lizatem komórek ssaków lub odtworzonym układem enzymów E-1, E-2, E-3. Sygnał ubikwitynacji był nieobecny w grupie kontrolnej i znacznie się zmniejszał po ekspozycji ubikwitynowanego streptococcus pneumoniae na OTUB1, co potwierdza modyfikację poliubikwityny sprzężonej z K48.

Analiza profilu linii wykazała pełne nakładanie się sygnałów ubikwityny i bakteryjnych, potwierdzając ich przestrzenną współlokalizację. Rekonstrukcja trójwymiarowa potwierdziła przestrzenne nakładanie się sygnałów ubikwityny i paciorkowca pneumoniae. Dziki typ p97 w połączeniu z jego koczynnikami, UFD1 i NPLOC4, obniżał żywotność bakterii do 10 do 20% po dwóch godzinach, niezależnie od tego, czy ubikwitynacja była przeprowadzana za pomocą lizatu komórkowego, czy oczyszczonego systemu enzymatycznego.

Nie zaobserwowano spadku żywotności bakterii po pominięciu ubikwitynacji, gdy p97 był inaktywowany termicznie lub przy użyciu katalistycznie nieaktywnego p97, E57 8Q, co potwierdza, że zarówno ubikwitynacja, jak i aktywny p97 są niezbędne do zabijania bakterii. Nasze badanie otwiera drzwi do tego, jak ligazy ubikwityny gospodarza E3 modyfikują różne patogeny oraz badają mechanizmy efektorowe usuwające zagrożenia zakaźne. Następnie chcemy zbadać, jak regulować p97 lub VCP, a następnie skonstruować je, aby zwiększyć jego działanie antybakteryjne.