Name: Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj standaryzowaną metodę pobierania próbek płynu łzowego za pomocą nici fenolowych czerwonych do lipidomiki nieukierunkowanej. Protokół LC-MS/MS umożliwia identyfikację ponad 1300 gatunków lipidów z niską zmiennością międzyobiektową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez inicjatywę InnoHK oraz rząd Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu oraz Centrum Badawcze SHARP Vision na Hongkońskim Uniwersytecie Politechnicznym. Autorzy z wdzięcznością dziękują również za wsparcie techniczne ze strony University Research Facility in Chemical and Environmental Analysis (UCEA) oraz University Research Facility in Life Sciences (ULS) Hongkońskiego Politechniki.

Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (IRB) Hongkońskiego Politechnika. Uczestnicy udzielili pisemnej świadomej zgody przed udziałem w badaniu. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Zbieranie ludzkiego płynu łzowego na bazie fenolowej czerwonej nici (PRT)
<ol>
	<li>Noś rękawiczki i dezynfekuj stanowisko pracy, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek.</li>
	<li>Upewnij się, że paczka PRT jest zapieczętowana i nie jest przeterminowana, zanim ją otworzysz.</li>
	<li>Trzymaj nić za koniec naprzeciwko zgiętego haczyka. Zawsze unikaj dotykania wygiętej części PRT.</li>
	<li>Poproś badanego, aby spojrzał na górny kierunek nosa.</li>
	<li>Delikatnie opuścić dolną powiekę badanego i włóż PRT z wygiętym hakiem umieszczonym w dolnej spojówce skroniowej podbródkowej, blisko zewnętrznej kantusa oka badanego (Rysunek 2).</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Pozycja czerwonej nici fenolowej podczas zbierania łz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<ol start="6">
	<li>Poproś badanego, aby delikatnie zamknął oczy i lekko pochylił głowę do przodu, aby zapobiec dotykowi skóry twarzy przez PRT. UWAGA: Wchłonięta łza stopniowo indukuje czerwony front barwnikowy, wskazujący na próbkowany obszar PRT ze względu na pH-wrażliwą czerwień fenolową. Aby zapewnić wystarczającą ilość płynu łzowego do analizy lipidomicznej, zaleca się pobranie objętości łzowej równoważnej 50 mm PRT, zazwyczaj zakończonej w ciągu 2 minut.</li>
	<li>Delikatnie opuszczaj dolną powiekę badanego i wyciągnij próbkowany PRT. Unikaj dotykania obszaru próbkowania.</li>
	<li>Zapisz długość pobranego obszaru PRT i przenieś PRT do nowej probówki za pomocą sterylnych kleszczy. UWAGA: Jeśli długość próbkowanego PRT wynosi <50 mm, prosimy o odpoczynek przez 1-3 minuty i powtórzenie pobierania tym samym okiem. Przenieś każdą próbkę PRT do osobnej probówki.</li>
	<li>Odpowiednio oznacz i zakręć probówki.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść rękawiczki i kleszcze metanolem oraz czyste papierowe chusteczki, aby usunąć resztki łez lub zanieczyszczenia, a następnie pozwól im wyschnąć.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.2-1.10 dla drugiego oka.</li>
	<li>Zamknąć probówki parafilmem i natychmiast przechować ją w temperaturze -20°C do tymczasowego przechowywania lub -80°C do przechowywania długoterminowego. Unikaj niepotrzebnych cykli zamrożenia i rozmrażania oraz chroń próbkowany PRT przed światłem.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie próbkowanego PRT
<ol>
	<li>Przed obróbką PRT umyć mikronożyczki metanolem.</li>
	<li>Usuń wygięty koniec haka (czyli pierwsze 3 mm) PRT (rysunek 3).</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Wygląd fizyczny nici fenolowej (PRT). (A) Nieużywany PRT z wygiętym końcem haczyka. (B) Użyto PRT z przeciętym wyznaczonym fragmentem i pobranym do ekstrakcji lipidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<ol start="3">
	<li>Pokrój próbkowany obszar PRT (czyli obszar powyżej przedniej części barwnika fenolowego) na kawałki o grubości 2 mm i przełóż je do czystej mikrowirówki o pojemności 1,5 mL odpornej na rozpuszczalnik organicznej.</li>
</ol>
3. Dwufazowa separacja MTBE/metanol do ekstrakcji lipidów z pobranego PRT
UWAGA: MTBE i metanol są łatwopalne i lotne. Używaj w dobrze wentylowanym miejscu lub w okapie wyparowym. Unikaj otwartych płomieni i iskier. Noś rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Myj ręce po dotyku.
<ol>
	<li>Umieść próbki w lodzie.</li>
	<li>Do każdej próbki i wiru dodaj 232 μL metanolu lodowatego (klasy MS) przez 15 sekund.</li>
	<li>Sonikuj próbki w wstępnie schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez 15 minut.</li>
	<li>Do każdej próbki i wiru należy dodać 774 μL MTBE (klasy HPLC) oraz 194 μL wody dejonizowanej do każdej próbki i wiru na 15 sekund. Uzyskany stosunek objętości MTBE:metanol:woda w próbce powinien wynosić 4:1,2:1 (v/v/v).</li>
	<li>Ponownie sonikatuj próbki w wstępnie schłodzonej ultradźwiękowej czystce przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubuj próbkę w termomieszaczu przez 8 godzin w temperaturze 4 °C, z potrząsaniem z prędkością 1200 obr./min.</li>
	<li>Pozwól mieszance stać w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Wiruj powstałe mieszaniny w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po wirowaniu mieszaniny są rozdzielane na dwie fazy (rysunek 4). UWAGA: Po zakończeniu separacji fazowej zbadaj próbkę pod kątem dwóch odrębnych warstw: górna faza organiczna (bogata w MTBE) powinna wyglądać na przezroczystą z lekką mleczną nieprzezroczystością, natomiast dolna faza wodna wykazuje żółte zabarwienie wynikające z obecności wskaźnika fenolu czerwonego. Kontynuuj tylko wtedy, gdy te charakterystyki fazowe są zaobserwowane, jak pokazano na Rysunku 4.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Separacja fazowa ekstrakcji lipidów z użyciem MTBE-metanol-wody: górna faza organiczna i dolna faza wodna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<ol start="10">
	<li>Ostrożnie pobrać 700 μL górnej frakcji organicznej zawierającej lipidy i przenieść ją do schłodzonej nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Niższą fazę wodną zawierającą pozostałości MTBE i metanolu należy odrzucić jako niebezpieczne odpady chemiczne. Zbieraj odpady w oznaczonych, szczelnie zamkniętych pojemnikach i utylizuj je zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych oraz lokalnymi przepisami. Nie wlewaj rozpuszczalników do odpływu.</li>
	<li>Susz ekstrakty lipidowe za pomocą chłodzonego koncentratora SpeedVac przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. UWAGA: Aby zapewnić całkowite wyschnięcie, okresowo sprawdzaj suchość próbki od 2 godzin. Przedłuż czas schnięcia w miarę potrzeby, aż próbki całkowicie wyschną.</li>
	<li>Przechowuj suszone ekstrakty lipidowe w temperaturze -20 °C do przechowywania krótkoterminowego lub w -80 °C do przechowywania długoterminowego.</li>
</ol>
4. Rekonstrukcja wyodrębnionego lipidu łzowego do analizy LC-MS/MS
<ol>
	<li>Suszone ekstrakty lipidowe rekonfunduj 50 μL zimnej mieszaniny metanolu (MS) i chloroformu (HPLC) jako rozpuszczalnika (1:1, v/v) jako rozpuszczalnika (1 μL rozpuszczalnika na 1 mm użytego PRT), a następnie sonifikuj w schłodzonym ultradźwiękowym czyszczadle przez 15 minut.</li>
	<li>Wirówka odtworzonych ekstraktów lipidowych w dawce 14 000 × g i 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przelej 40 μL supernatantu do szklanej fiolki z autosamplerem z zamontowaną szklaną wkładką.</li>
	<li>Szczelnie zakręć fiolkę bezszczelinową przegrodą otwartą i przygotować do analizy LC-MS/MS.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie próbek przez LC-MS/MS
<ol>
	<li>W chromatografii cieczowej ustaw temperaturę komory kolumny i próbki odpowiednio na 50 °C i 4 °C.</li>
	<li>Przy każdym wstrzyknięciu załaduj 5 μL próbki na kolumnę LC w fazie odwrotnej (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) i frakcjonuj lipidy z przepływem 0,3 mL/min w 24-minutowym gradiencie separacji.<ol>
		<li>Stosuj fazę mobilną A składającą się z mieszaniny acetonitrylu (klasa MS) w stosunku 60:40: wody (v/v) z 5 mM formiatu amonu (klasa MS) i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego (klasa MS) oraz fazy mobilnej B zawierającej izopropanol 90:10 (klasa MS):acetonitrylu (v/v) z 5 mM formiatu amonu i 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Użyj następującego gradientu: 0-2 min: 40% B; 2-2,5 min: 40% B; 2,5-3 min: 58% B; 3-18 min: 99% B; 18-20 min: 99% B; 20-20,1 min: 40% B; 20,1-24 min: 40% B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W spektrometrze mas Orbitrap ustaw napięcie natryskowe na +3,5 kV dla trybu dodatniego lub -2,5 kV dla trybu ujemnego.</li>
	<li>Sreguluj przepływ gazu w otoczce do 45 Arb, a przepływ gazu pomocniczego do 10 Arb.</li>
	<li>Ustaw przepływ gazu zamiatającego na 2 Arb.</li>
	<li>Ustaw temperaturę rurki przenoszącej jony na 300 °C, a temperaturę waporyzatora na 320 °C.</li>
	<li>Użyj trybu pozyskiwania danych zależnego od danych (DDA).</li>
	<li>Dla MS1 ustaw rozdzielczość na 120 000, zakres skanowania na 100-2000 m/z, standardowy cel AGC, czas automatycznego wtrysku, dynamiczne wykluczenie na 6 s, a próg intensywności na 5,0e4.</li>
	<li>Dla MS2 ustaw rozdzielczość na 15 000, zakres automatycznego skanowania, standardowy cel AGC, czas wtrysku dynamicznego, okno izolacji przy 1,6 m/z, typ energii zderzenia jako dysocjacja kolizyjna o wyższej energii (HCD) oraz znormalizowaną energię kolizji (NCE) do wartości stopniowych 15, 30 i 40.</li>
	<li>Analizuj surowe dane za pomocą oprogramowania LipidSearch lub innych kompatybilnych platform.</li>
</ol>

<ol><li>Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+film+lipid+layer+thickness%3A+Measurement+techniques%2C+normative+values+and+alteration+in+ocular+surface+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases.</a> Curr Eye Res. , (2025).</li>
<li>Ambaw, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+tear+lipid+mediator+as+a+biomarker+of+inflammation+for+meibomian+gland+dysfunction+and+ocular+surface+diseases%3A+Standard+operating+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures.</a> Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).</li>
<li>Sheppard, J. D., Nichols, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease+associated+with+meibomian+gland+dysfunction%3A+Focus+on+tear+film+characteristics+and+the+therapeutic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape.</a> Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).</li>
<li>Lam, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+analysis+of+human+tear+fluid+reveals+structure-specific+lipid+alterations+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome.</a> J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).</li>
<li>Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+meibum+and+tear+lipid+composition+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Differences in meibum and tear lipid composition and conformation.</a> Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).</li>
<li>Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+polarity+gradient+formed+by+%CF%89-hydroxy+lipids+in+tear+film+prevents+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease.</a> eLife. 9, 53582(2020).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+profiles+revealed+alterations+in+patients+with+meibomian+gland+dysfunction+after+exposure+to+intense+pulsed+light%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light.</a> Front Neurol. 13, 827544(2022).</li>
<li>Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+role+of+specific+tear+film+lipids+connected+to+dry+eye+syndrome%3A+A+study+on+o-acyl-%CF%89-hydroxy+fatty+acids+and+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters.</a> Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).</li>
<li>Khanna, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+lipidomics+approaches+in+human+tears%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review.</a> Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).</li>
<li>Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+tear+proteomic+profile+in+ocular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Changes in tear proteomic profile in ocular diseases.</a> Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).</li>
<li>Bertram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Schirmer+strip+wetness+on+volume+absorbed%2C+volume+recovered%2C+and+total+protein+content+in+canine+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears.</a> Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).</li>
<li>Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+human+tear+fluid+biomarkers+specific+for+ocular+and+systemic+diseases+in+the+context+of+3p+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine.</a> EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).</li>
<li>Gijs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+sample+handling+effects+on+tear+fluid+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels.</a> Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).</li>
<li>Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+study+of+phenol+red+thread+as+a+novel+non-invasive+tear+sampling+technique+for+proteomics+studies%3A+Comparison+with+two+commonly+used+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods.</a> Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).</li>
<li>Barmada, A., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+sample+collection+and+processing+impacts+on+fiber-based+tear+fluid+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+phenol+red+thread+test+in+a+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Validation of the phenol red thread test in a Chinese population.</a> BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).</li>
<li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li>
<li>Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Folch%2C+Bligh-Dyer%2C+and+Matyash+sample-to-extraction+solvent+ratios+for+human+plasma-based+lipidomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies.</a> Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).</li>
<li>Lam, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+characterization+of+human+tear+fluid+collected+using+different+techniques+unravels+the+presence+of+novel+lipid+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles.</a> J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).</li>
<li>Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+acceptability+of+tear+collection+in+the+primary+healthcare+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Optom+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting.</a> Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).</li>
<li>Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+extraction+methods-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid extraction methods-a review.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).</li>
<li>Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+lipidomic+analysis+of+human+tears%3A+A+new+approach+for+quantification+of+o-acyl-omega+hydroxy+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids.</a> Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).</li>
<li>Köfeler, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+good+practice+in+MS-based+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Recommendations for good practice in MS-based lipidomics.</a> J Lipid Res. 62, 100138(2021).</li>
<li>Ulmer, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+efforts+to+improve+lipid+stability+during+sample+preparation+and+standardization+efforts+to+ensure+accuracy+in+the+reporting+of+lipid+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements.</a> Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).</li>
<li>Sens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+sample+handling+standardization+for+reliable+measurement+of+metabolites+and+lipids+in+LC-MS-based+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom+Adv+Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research.</a> J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).</li>
<li>Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+fractionated+extraction+method+for+the+comprehensive+analysis+of+metabolites%2C+lipids%2C+and+proteins+from+a+single+sample%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample.</a> J Vis Exp. (124), e55802(2017).</li>
<li>Fong, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tear+film+biomarkers+in+the+diagnosis+and+management+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Taiwan+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease.</a> Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).</li>
<li>Sanroque-Muñoz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear-derived+extracellular+vesicles+as+diagnostic+biomarkers+for+ocular+and+neurodegenerative+diseases%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Extracell+Vesicles+Circ+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges.</a> Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).</li>
<li>Vera-Montecinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+tear+proteomics+with+data+independent+acquisition+enables+biomarker+discovery+in+allergic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions.</a> Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Zalety pobierania łez i ekstrakcji lipidów na bazie PRT Workflow lipidomics łez oparty na PRT przedstawiony tutaj zapewnia minimalnie inwazyjną i praktyczną metodę pobierania próbek do kompleksowego profilowania lipidów łz. W porównaniu z paskami Schirmera, które wymagają długotrwałego kontaktu i większych objętości próbek, próbkowanie PRT jest szybkie, można wykonać w ciągu 2 minut, jest dobrze tolerowane przez różne populacje, w tym te o zmniejszonej objętości łez lub zwiększonej czułości oczu, a ...

Błona łzawiąca jest najbardziej zewnętrzną barierą chroniącą powierzchnię oka przed patogenami i utrzymującą homeostazę ocznu 1,2, natomiast warstwa lipidowa w warstwie łzowej jest kluczowym elementem zapobiegającym parowaniu łez i utrzymującym stabilność błony łzowej 3,4. Zaburzenia w składzie lipidów łzowych zostały powiązane z różnymi chorobami oczu, w tym suchością oka (DED), dysfunkcją gruczołów Meiboma (MGD) oraz alergicznym zapaleniem spojówek 5,6,7,8. W rezultacie szczegółowa charakterystyka lipidomiki łzowej stała się kluczowym i trendowym kierunkiem badań dla bardziej kompleksowego zrozumienia molekularnych patologii leżących u podstaw tych schorzeń ocznych9.
Chociaż podejście lipidomiczne łzowe ma duże znaczenie kliniczne, kluczowym wyzwaniem w lipidomice łez jest ustanowienie ustandaryzowanego, powtarzalnego procesu zbierania i analizy. Obecne metody pobierania próbek łez, paski Schirmera i mikrokapilarna rurka, każda z nich mają swoje specyficzne ograniczenia. Paski Schirmera mają dużą powierzchnię kontaktu z powierzchnią oka, co często powoduje podrażnienie oczu i pęknięcia odruchowe 9,10. Dla porównania, pobieranie mikrocelarnych rurek jest silnie zależne od techniki operatora i może dawać niespójne wyniki, gdy wykonuje się to przez różne osoby11. Dodatkowo, niewłaściwe użycie tych narzędzi do pobierania próbek może również wiązać się z ryzykiem uszkodzenia powierzchni oka. Te ograniczenia mogą zagrozić dokładności i powtarzalności danych w dalszej części 12,13. Ponadto metody pobierania łez wymagające skomplikowanych procedur obsługi mogą ograniczać ich dostępność i standaryzację w różnych laboratoriach i placówkach klinicznych. Dlatego pilnie potrzebne jest ustanowienie nieinwazyjnego, solidnego i powtarzalnego procesu zbierania i przetwarzania łez, który pozwoli zachować natywny profil lipidowy łz.
Najnowsze badania podkreśliły przydatność fenolowej czerwonej nici (PRT) w dalszych analizach procesów LC-MS/MS w zastosowaniach proteomicznych i metabolomicznych 14,15. PRT oferuje wrodzone zalety jako narzędzie do zbierania łez. Jego cienka struktura, minimalnie inwazyjny charakter oraz prosta procedura próbkowania mogły minimalizować złożoność techniczną i zmniejszać zmienność zależną od operatora, jednocześnie będąc dobrze tolerowanym przez większość uczestników14,16. Jednak ustandaryzowany sposób pracy specyficzny dla analizy lipidomii łez opartej na PRT nie został jeszcze ustalony.
Protokół ten wprowadza zintegrowany workflow dla powtarzalnej lipidomiki łz: przyjazną użytkownikowi metodę zbierania łez opartą na PRT, dostosowaną do analizy lipidów, zoptymalizowany protokół ekstrakcji lipidów z eteru metylowego tert-butylowego (MTBE)/metanolu z określonymi stosunkami rozpuszczalnika do próbki i kontrolami przechowywania17,18, oraz zmodyfikowaną metodę identyfikacji lipidów wykorzystującą wysokorozdzielczość LC-MS/MS. To standaryzowane podejście umożliwia spójne profilowanie lipidomiczne łz, umożliwiające dalsze odkrywanie biomarkerów i charakteryzację chorób. Ponadto jest szczególnie dobrze dopasowany do osób o niskiej objętości łez lub obniżonej tolerancji na odczucia ciała obcego (Rysunek 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd workflow oparty na Phenol Red Thread (PRT) dla lipidomiki łez u ludzi. Płyn łzowy jest pobierany od osób stosujących podejście PRT, co umożliwia regularne pobieranie próbek przy minimalnym dyskomfortie. Przetwarzanie próbek obejmuje sekwencyjną ekstrakcję dwufazową MTBE/metanolu, stężenie pośredniczone metodą SpeedVac oraz rekonstrukcję ekstraktów lipidowych łzowych do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Profile lipidomiczne są następnie pozyskiwane za pomocą LC-MS/MS i poddawane adnotacjom oraz identyfikacji za pomocą oprogramowania LipidSearch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl (ACN), stopień LC-MS</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1005</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC CSH C18 Kolumna</td><td>Waters Corporation</td><td>186005297</td><td>130 & Aring;, 1,7 & mikro; m, 2,1 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Format amonowy, klasa LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55674</td><td></td></tr><tr><td>Szklana fiolka z automatycznym próbkowaniem</td><td>Well Rich Scientific</td><td>2ML-9-V1002</td><td>2 mL przezroczystego szkła 12*32mm płaska podstawa 9-425 fiolki z gwintem śrubowym i etykietą (Z podkładką do pisania)</td></tr><tr><td>Niebieska 9-425 otwarta żebrowana śruba i nakrętka;</td><td>Well Rich Scientific</td><td>9-SP1003</td><td>z 9mm, białym PTFE/czerwonym silikonowym septą 1mm</td></tr><tr><td>Chloroform, klasa HPLC</td><td>Reagenty Duksan</td><td>1271</td><td></td></tr><tr><td>Elektrony Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA) i Klasa LC-MS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Szklana mikro-wkładka</td><td>Well Rich Scientific</td><td>2ML-N2002</td><td>250 &mikro; Wkładka L, przezroczyste szkło, stożkowa podstawa z polisprężyną, rozmiar: 5,8*28,5 mm</td></tr><tr><td>Izopropanol, klasa LC-MS</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1162</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie LipidSearch</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30879</td><td>Wersja 5</td></tr><tr><td>Metanol,&nbsp; Klasa LC-MS</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1115</td><td></td></tr><tr><td>Nić fenolowa czerwona &nbsp; (PRT)</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd</td><td>20192160086</td><td></td></tr><tr><td>Chłodzenie w wirówce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Chłodnicze koncentratory odśrodkowe CentriVap i chłodnice CentriVap</td><td>Labconco</td><td>16108335</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki z nakrętką</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butylowy eter metylowy (MTBE), stopień HPLC</td><td>Reagenty Duksan</td><td>1070</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid MS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSN05-10001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy środek do czyszczenia</td><td>Crest Ultrasonic</td><td>P500D-45</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Benchmark</td><td>BV1003</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Phenol Red Thread-based Sampling Procedure for Untargeted Tear Fluid Lipidomics in Biomarker Discovery

Lipidy łzowe są kluczowe dla stabilności filmu łzowego i zdrowia powierzchni oka. Zmiany w składzie łez mogą być związane z chorobami oczu i ogólnoustrojowymi, takimi jak dysfunkcja gruczołów Meiboma i dyslipidemia. Profilowanie lipidów łzowych może pomóc w odkrywaniu biomarkerów w diagnostyce i leczeniu chorób. Jednak powszechne metody pobierania łez mają wyraźne ograniczenia: paski Schirmera często powodują podrażnienia i dyskomfort oczu ze względu na duży kontakt z powierzchnią oka, podczas gdy pobieranie mikronaczyń z mikrokapilar może powodować niską powtarzalność ze względu na zmienność operatora, zwłaszcza gdy wykonuje się to przez różne osoby. Te ograniczenia mogą ograniczyć dokładność i spójność danych lipidomicznych. Badanie to wprowadza minimalnie inwazyjną metodę pobierania próbek opartą na fenolowej czerwonej nici (PRT) zoptymalizowaną pod kątem lipidomiki łz. Cienka struktura PRT minimalizuje ryzyko podrażnień oczu i umożliwia szybkie oraz delikatne zbieranie łez. Ta przyjazna dla użytkownika i łatwa w wykonaniu metoda jest odpowiednia dla osób o zmniejszonej objętości łez lub niższej tolerancji na odczucia ciała obcego, a także umożliwia bardziej powtarzalne pobieranie próbek poprzez zmniejszenie zmienności zależnej od operatora. Lipidy łzowe zebrane przez PRT zostały wyekstrahowane za pomocą zoptymalizowanego protokołu separacji fazowej metanol/metyl tert-butyl (MTBE) i przeanalizowane za pomocą wysokorozdzielczego LC-Orbitrap-IQX MS/MS za pomocą oprogramowania LipidSearch. Workflow zidentyfikował ponad 700 unikalnych gatunków lipidów łzowych, z których każdy charakteryzuje się specyficznymi jonami produktów pochodzącymi z kwasów tłuszczowych. Wyniki te wskazują, że próbkowanie oparte na PRT zapewnia solidne odzyskiwanie lipidów do analizy lipidomicznej łz. To minimalnie inwazyjne i powtarzalne podejście stanowi praktyczną platformę dla klinicznych i eksperymentalnych badań nad lipidami łzowymi. Ostatecznie może to również ułatwić odkrywanie biomarkerów i monitorowanie chorób.

Pobrano próbki łez złożone od 16 zdrowych ochotników podczas trzech niezależnych wizyt w odstępie dwóch tygodni (R1, najstarsza partia; R2, R3 pobierane kolejno dwa tygodnie po każdej). Korzystając z LipidSearch z rygorystycznymi kryteriami (tj. stosunek sygnału do szumu ≥100, stopień C lub wyższy oraz intensywność jonów ≥30 000), zidentyfikowaliśmy odpowiednio 773, 890 i 1 025 unikalnych gatunków lipidowych w R1-R3 (Rysunek 5A). Dodatni tryb jonów zidentyfikował 1 302 gatunki lipidów z 26,0...

Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Tear lipids are crucial for tear film stability and ocular surface health. Changes in tear composition could be associated with ocular and systemic ...

Opracowaliśmy bardziej ustandaryzowaną, łatwą w użyciu metodę opartą na niciach fenolowych czerwonych, aby pomóc uzyskać powtarzalne profile lipidomiczne łz do przyszłego odkrywania biomarkerów łz. Obecnym wyzwaniem jest to, że paski Schirmera drażnią, podczas gdy kapilary wykazują zmienność operatorów w zbieraniu łez. Utrudnia to eksperymentalne raportowanie i porównania między badaniami.Na początek załóż rękawiczki i dokładnie zdezynfekuj stanowisko pracy, aby zapobiec skażeniu próbki. Trzymaj nić fenolowo-czerwonej za koniec naprzeciwko zgiętego haczyka, uważając, by nie dotykać wygiętego obszaru haczyka. Poproś badanego, by skierował wzrok w górny kierunek nosa.Następnie delikatnie opuszczam dolną powiekę badanego i wprowadzam nić fenolowo-czerwoną z haczykiem umieszczonym w dolnej spojówce skroniowej niedźwigni, blisko zewnętrznego kąta oka. Teraz poproś badanego, by delikatnie zamknął oczy i lekko pochylił głowę do przodu, aby zapobiec kontaktu z czerwienią fenolową na skórze twarzy. Ponownie opuścić dolną powiekę badanego i delikatnie usunąć nić fenolową czerwieni, unikając kontaktu z badanym obszarem.Zapisz długość pobranego czerwonego obszaru. A za pomocą sterylnych kleszczy przeniesiono PRT do nowej probówki. Teraz poprawnie oznacz i zatkaj probówkę.Jeśli długość próbki jest mniejsza niż 50 milimetrów, poproś badanego o odpoczynek przez jedną do trzech minut, a następnie powtórz pobieranie płynu łezowego tym samym okiem. Każdą nowo pobraną PRT umieść w osobnej probówce. Używając metanolu i czystych chusteczek papierowych, dokładnie umyj rękawiczki i kleszcze, aby usunąć wszelkie ślady łez lub zanieczyszczenia.Następnie pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Wszystkie probówki z próbkami zatwórz parafilmem i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza dla tymczasowego przechowywania lub w minus 80 stopniach Celsjusza dla długotrwałego przechowywania. Przed obróbką czerwonych nici fenolowych najpierw umyj mikronożyczki i kleszcze metanolem.Odetnij wygięty koniec haczyka mniej więcej na pierwsze trzy milimetry od każdej czerwonej nici fenolowej. Pokrój obszar pobrany do frontu barwnika fenolowego na dwa milimetry i zbierz je czystą, organiczną mikrowirówką o pojemności 1,5 mililitra, odporną na rozpuszczalnik organiczną. Usuń wygięty koniec haka i niepożądany obszar PRT.Umieszczaj próbki na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę przed ekstrakcją. Następnie dodaj 232 mikrolitry metanolu o jakości lodowatej spektrometrii masowej do każdej próbki i wiru przez 15 sekund, aby dokładnie wymieszać. Sonikuj próbki w schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez 15 minut.Następnie do każdej próbki dodano 774 mikrolitry metyl-tert-butyloeteru o jakości HPLC oraz 194 mikrolitry wody dejonizowanej. Ponownie zacznij przez 15 sekund, aby dokładnie wymieszać rozpuszczalniki. Sonikuj próbki ponownie w wstępnie schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez kolejne 15 minut.Po sonakacji inkubuj próbki w ThermoMixerze ustawionym na cztery stopnie Celsjusza z potrząsania z prędkością 1 200 obrotów na minutę przez osiem godzin. Następnie pozostaw w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wiruj mieszanki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po wirowaniu upewnij się, że mieszaniny są widocznie rozdzielone na dwie wyraźne fazy ciekłe. Ostrożnie zebrać 700 mikrolitrów górnej fazy organicznej zawierającej lipidy i przenieść je do schłodzonej nowej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozbądź się dolnej fazy wodnej, która zawiera resztki metyloterter-butylu i metanolu, jako niebezpieczne odpady chemiczne.Susz ekstrakty lipidowe za pomocą chłodzonego koncentratora SpeedVac ustawionego na cztery stopnie Celsjusza przez cztery godziny. Następnie przechowywać wysuszone ekstrakty lipidowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania krótkoterminowego lub w minus 80 stopniach Celsjusza dla przechowywania długoterminowego. Przygotuj mieszaninę rozpuszczalnika metanolu i chloroformu, mieszając metanol z chloroformem w proporcji objętościowej jeden do jednego.Rekonstytuuj wysuszone ekstrakty lipidowe przy użyciu 50 mikrolitrów lodowato zimnej mieszaniny rozpuszczalnika metanolowo-chloroformowego. Sonikować zrekonstytuowany roztwór w wstępnie schłodzonej ultradźwiękowej czyszczarce przez 15 minut. Następnie odtworzone ekstrakty lipidowe w wirówce 14 000 g i czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Ostrożnie przelej 40 mikrolitrów powstałego supernatantu do fiolki z autosamplerem wyposażoną w szklaną wkładkę. Szczelnie zakręć fiolkę nieszczelinową przegrodą otwartą na górze, aby przygotować ją do analizy tandemowej spektrometrii masowej w chromatografii cieczowej. Stosując rygorystyczne kryteria, zidentyfikowano 773, 890 i 1 025 unikalnych gatunków lipidów odpowiednio w grupach replikujących jeden, replikuj dwa oraz replikuj trzy grupy próbek.Dodatni tryb jonowy zidentyfikował 1 302 gatunki lipidowe z identyfikacją 26% stopnia A, 13,2% stopnia B oraz 60,8% stopnia C. Tryb jonów ujemny zidentyfikował 257 gatunków lipidowych z około 8,2% stopnia A, 22,9% stopnia B i 68,9% stopnia C. Pomimo różnic związanych z przechowywaniem, na wszystkich trzech zestawach próbnych konsekwentnie identyfikowano 394 unikalne gatunki lipidowe.Współczynnik zmienności międzyosobowej w trakcie trzech wizyt wyniósł 21,5% w trybie dodatnim i 31,3% w trybie ujemnym. Protokół ten rozwiązuje brak standaryzowanego workflow do powtarzalnej analizy lipidomicznej łz, co może zwiększyć porównywalność między badaniami. Nasza metoda oparta na PRT minimalizuje podrażnienia, umożliwia szybkie zbieranie łez i zmniejsza zmienność operatora.Nasze przyszłe badania będą weryfikować biomarkery lipidomiczne łzowe w dużych kohortach oraz integrować multiomikę dla spersonalizowanej diagnostyki.

phenol-red-thread-based-sampling-procedure-for-untargeted-tear-fluid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Ten film ilustruje test multipleksowy oparty na koralikach do analizy cytokin w ludzkich łzach. Metoda ta pozwala na jednoczesną analizę wielu cytokin z jednej próbki, zapewniając zwiększoną czułość do badania odpowiedzi immunologicznych w różnych stanach patofizjologicznych.

Test oparty na kulkach multipleksowych do analizy cytokin w próbkach ludzkich łez

Analiza cytokin filmu łzowego pomaga w badaniu różnych chorób oczu. Testy multipleksowe oparte na kulkach są proste i czułe oraz umożliwiają testowanie wielu celów w próbkach o małych objętościach. W tym miejscu opisujemy protokół profilowania cytokin filmu łzowego za pomocą testu multipleksowego opartego na kulkach.

Test multipleksowy oparty na kulkach do analizy profili cytokin łzowych

Ten artykuł przedstawia modułowy protokół dla lipidomiki tkankowej i transkryptomiki oraz lipidomiki osocza w mysich modelach chorób neurologicznych ukierunkowanych na lipidy leżące u podstaw stanu zapalnego i aktywności neuronalnej, lipidy błonowe, dalsze przekaźniki oraz enzymy/receptory kodujące mRNA leżące u podstaw funkcji lipidów. Przedstawiono procedury pobierania próbek, przetwarzania próbek, ekstrakcji i kwantyfikacji.

Lipidomika i transkryptomika w chorobach neurologicznych

Lipidomika oparta na spektrometrii mas typu shotgun dostarcza czuły ilościowy obraz szerokiego spektrum klas lipidów jednocześnie w jednym pomiarze z różnych tkanek gryzoni.

Lipidomika tkanek gryzoni

Ten protokół opisuje metodę pobierania próbek łez za pomocą pasków Schirmera oraz zintegrowany ilościowy przepływ pracy do odkrywania nieinwazyjnych biomarkerów białka łez. Proces przygotowania próbki do wychwytywania zawiesiny umożliwia szybkie i niezawodne przygotowanie próbki do rozdarcia oraz analizę spektrometryczną mas, co skutkuje wyższą wydajnością odzyskiwania peptydów i identyfikacją białek niż standardowe procedury w roztworze.

Przygotowanie próbki zatrzymującej zawiesinę białek do proteomiki łez metodą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

W tym artykule opisano protokół pobierania i wykrywania miR-15a z łez jako nowego narzędzia diagnostycznego retinopatii cukrzycowej.

MiR-15a pochodzący z łez egzosomowy jako nowe narzędzie diagnostyczne retinopatii cukrzycowej

Identyfikacja biomarkerów RNA i białek z łez w modelach mysich jest bardzo obiecująca dla wczesnej diagnostyki różnych chorób. Manuskrypt ten zawiera kompleksowy protokół optymalizacji skuteczności i efektywności izolacji mRNA i białek z łez myszy.

Optymalizacja zbierania łez u myszy do analizy mRNA i białek

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.

Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

Poznaj standaryzowaną metodę pobierania próbek płynu łzowego za pomocą nici fenolowych czerwonych do lipidomiki nieukierunkowanej. Protokół LC-MS/MS umożliwia identyfikację ponad 1300 gatunków lipidów z niską zmiennością międzyobiektową.

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów (Wideo) | JoVE Journal

Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów

Przeglądaj więcej filmów