Procedura pobierania próbek oparta na niciach fenolowych czerwonych dla lipidomiki nieukierunkowanego płynu łzowego w odkrywaniu biomarkerów
December 12th, 2025
Protokół ten opisuje unikalny protokół kliniczny pobierania próbek ludzkiego płynu łezowego za pomocą czerwonych nici fenolowych oraz workflow oparty na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS) w celu odkrycia profilu lipidomicznego łz. Prosta metoda bifazowej separacji metyloter-butyloeteru (MTBE)/metanolu umożliwia szybką ekstrakcję lipidów łzowych z wysoką odbudową i odkryciem biomarkerów łz.
Opracowaliśmy bardziej ustandaryzowaną, łatwą w użyciu metodę opartą na niciach fenolowych czerwonych, aby pomóc uzyskać powtarzalne profile lipidomiczne łz do przyszłego odkrywania biomarkerów łz. Obecnym wyzwaniem jest to, że paski Schirmera drażnią, podczas gdy kapilary wykazują zmienność operatorów w zbieraniu łez. Utrudnia to eksperymentalne raportowanie i porównania między badaniami.
Na początek załóż rękawiczki i dokładnie zdezynfekuj stanowisko pracy, aby zapobiec skażeniu próbki. Trzymaj nić fenolowo-czerwonej za koniec naprzeciwko zgiętego haczyka, uważając, by nie dotykać wygiętego obszaru haczyka. Poproś badanego, by skierował wzrok w górny kierunek nosa.
Następnie delikatnie opuszczam dolną powiekę badanego i wprowadzam nić fenolowo-czerwoną z haczykiem umieszczonym w dolnej spojówce skroniowej niedźwigni, blisko zewnętrznego kąta oka. Teraz poproś badanego, by delikatnie zamknął oczy i lekko pochylił głowę do przodu, aby zapobiec kontaktu z czerwienią fenolową na skórze twarzy. Ponownie opuścić dolną powiekę badanego i delikatnie usunąć nić fenolową czerwieni, unikając kontaktu z badanym obszarem.
Zapisz długość pobranego czerwonego obszaru. A za pomocą sterylnych kleszczy przeniesiono PRT do nowej probówki. Teraz poprawnie oznacz i zatkaj probówkę.
Jeśli długość próbki jest mniejsza niż 50 milimetrów, poproś badanego o odpoczynek przez jedną do trzech minut, a następnie powtórz pobieranie płynu łezowego tym samym okiem. Każdą nowo pobraną PRT umieść w osobnej probówce. Używając metanolu i czystych chusteczek papierowych, dokładnie umyj rękawiczki i kleszcze, aby usunąć wszelkie ślady łez lub zanieczyszczenia.
Następnie pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Wszystkie probówki z próbkami zatwórz parafilmem i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza dla tymczasowego przechowywania lub w minus 80 stopniach Celsjusza dla długotrwałego przechowywania. Przed obróbką czerwonych nici fenolowych najpierw umyj mikronożyczki i kleszcze metanolem.
Odetnij wygięty koniec haczyka mniej więcej na pierwsze trzy milimetry od każdej czerwonej nici fenolowej. Pokrój obszar pobrany do frontu barwnika fenolowego na dwa milimetry i zbierz je czystą, organiczną mikrowirówką o pojemności 1,5 mililitra, odporną na rozpuszczalnik organiczną. Usuń wygięty koniec haka i niepożądany obszar PRT.
Umieszczaj próbki na lodzie, aby utrzymać niską temperaturę przed ekstrakcją. Następnie dodaj 232 mikrolitry metanolu o jakości lodowatej spektrometrii masowej do każdej próbki i wiru przez 15 sekund, aby dokładnie wymieszać. Sonikuj próbki w schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez 15 minut.
Następnie do każdej próbki dodano 774 mikrolitry metyl-tert-butyloeteru o jakości HPLC oraz 194 mikrolitry wody dejonizowanej. Ponownie zacznij przez 15 sekund, aby dokładnie wymieszać rozpuszczalniki. Sonikuj próbki ponownie w wstępnie schłodzonym ultradźwiękowym czystku przez kolejne 15 minut.
Po sonakacji inkubuj próbki w ThermoMixerze ustawionym na cztery stopnie Celsjusza z potrząsania z prędkością 1 200 obrotów na minutę przez osiem godzin. Następnie pozostaw w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wiruj mieszanki w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po wirowaniu upewnij się, że mieszaniny są widocznie rozdzielone na dwie wyraźne fazy ciekłe. Ostrożnie zebrać 700 mikrolitrów górnej fazy organicznej zawierającej lipidy i przenieść je do schłodzonej nowej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozbądź się dolnej fazy wodnej, która zawiera resztki metyloterter-butylu i metanolu, jako niebezpieczne odpady chemiczne.
Susz ekstrakty lipidowe za pomocą chłodzonego koncentratora SpeedVac ustawionego na cztery stopnie Celsjusza przez cztery godziny. Następnie przechowywać wysuszone ekstrakty lipidowe w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania krótkoterminowego lub w minus 80 stopniach Celsjusza dla przechowywania długoterminowego. Przygotuj mieszaninę rozpuszczalnika metanolu i chloroformu, mieszając metanol z chloroformem w proporcji objętościowej jeden do jednego.
Rekonstytuuj wysuszone ekstrakty lipidowe przy użyciu 50 mikrolitrów lodowato zimnej mieszaniny rozpuszczalnika metanolowo-chloroformowego. Sonikować zrekonstytuowany roztwór w wstępnie schłodzonej ultradźwiękowej czyszczarce przez 15 minut. Następnie odtworzone ekstrakty lipidowe w wirówce 14 000 g i czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.
Ostrożnie przelej 40 mikrolitrów powstałego supernatantu do fiolki z autosamplerem wyposażoną w szklaną wkładkę. Szczelnie zakręć fiolkę nieszczelinową przegrodą otwartą na górze, aby przygotować ją do analizy tandemowej spektrometrii masowej w chromatografii cieczowej. Stosując rygorystyczne kryteria, zidentyfikowano 773, 890 i 1 025 unikalnych gatunków lipidów odpowiednio w grupach replikujących jeden, replikuj dwa oraz replikuj trzy grupy próbek.
Dodatni tryb jonowy zidentyfikował 1 302 gatunki lipidowe z identyfikacją 26% stopnia A, 13,2% stopnia B oraz 60,8% stopnia C. Tryb jonów ujemny zidentyfikował 257 gatunków lipidowych z około 8,2% stopnia A, 22,9% stopnia B i 68,9% stopnia C. Pomimo różnic związanych z przechowywaniem, na wszystkich trzech zestawach próbnych konsekwentnie identyfikowano 394 unikalne gatunki lipidowe.
Współczynnik zmienności międzyosobowej w trakcie trzech wizyt wyniósł 21,5% w trybie dodatnim i 31,3% w trybie ujemnym. Protokół ten rozwiązuje brak standaryzowanego workflow do powtarzalnej analizy lipidomicznej łz, co może zwiększyć porównywalność między badaniami. Nasza metoda oparta na PRT minimalizuje podrażnienia, umożliwia szybkie zbieranie łez i zmniejsza zmienność operatora.
Nasze przyszłe badania będą weryfikować biomarkery lipidomiczne łzowe w dużych kohortach oraz integrować multiomikę dla spersonalizowanej diagnostyki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje standaryzowaną metodę pobierania próbek ludzkiej cieczy łzowej za pomocą czerwonych wątków fenolowych, mającą na celu poprawę powtarzalności w badaniach lipidomiki cieczy łzowej. Proces obejmuje chromatografię cieczową tandemową spektrometrię mas (LC-MS/MS) do ekstrakcji i analizy lipidów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Badania kliniczne
Tło
- Obecne metody pobierania łez często prowadzą do podrażnienia lub zmienności.
- Standaryzacja jest kluczowa dla niezawodnego odkrywania biomarkerów.
- Czerwone wątki fenolowe oferują mniej inwazyjną alternatywę dla pobierania łez.
- LC-MS/MS zapewnia solidną platformę do analizy lipidomiki.
Cel badania
- Ustanowić powtarzalną metodę profilowania lipidomiki cieczy łzowej.
- Minimalizować zmienność operatora i poprawiać porównywalność między badaniami.
- Fascynować przyszłymi badaniami nad biomarkerami lipidowymi w cieczy łzowej.
Stosowane metody
- Pobieranie próbek łez za pomocą czerwonych wątków fenolowych.
- Ekstrakcja lipidów metodą dwufazowową separację.
- Analiza gatunków lipidów za pomocą LC-MS/MS.
- Przechowywanie próbek w kontrolowanych temperaturach dla stabilności.
Główne wyniki
- Identyfikacja ponad 1 300 gatunków lipidów w trybie jonów dodatnich.
- Konsekwentna identyfikacja 394 unikalnych gatunków lipidów w próbkach.
- Zmienność międzyosobnicza zmielona na poziomie 21,5% w trybie dodatnim.
- Metoda poprawia powtarzalność i porównywalność badań lipidomiki.
Wnioski
- Metoda czerwonych wątków fenolowych zmniejsza podrażnienie i zmienność.
- Standaryzowany proces poprawia niezawodność analizy lipidomiki cieczy łzowej.
- Przyszłe badania skupiają się na walidacji biomarkerów lipidowych w większych grupach badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
