Name: Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metody biochemicznej analizy białka GFAP i jego mutacji związanych z chorobą Aleksandra. Protokół obejmuje oczyszczanie białek, analizę tworzenia filamentów i modyfikacji potranslacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) za dostarczenie szczurów R237H, które są znane z okazji. Sugestie i wsparcie prof. Albee Messinga (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) w tym badaniu są bardzo doceniane. Prace te były wspierane grantami Ministerstwa Nauki i Technologii (111-2320-B-007-008 oraz 112-2320-B-007-006 dla N.-H. L. i M.-D.P.). Dziękujemy również BioTEM z Narodowego Uniwersytetu Tsing Hua (MOST-104-2731-M-007-002) za wykorzystanie sprzętu w tym badaniu.

Zwierzęta użyte w tym badaniu to szczury modelu AxD z mutacją knock-in R237H11. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Wydziału Nauk o Życiu i Medycynie na Narodowym Uniwersytecie Tsing Hua (NTHU IACUC Approval No. 109088 i 111060) oraz zgodnie z wytycznymi Podręcznika Rolniczego dotyczącego opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Oczyszczanie rekombinowanego GFAP z bakterii (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przetransformuj szczep pLysS E. coli BL21(DE3) wektorem pET 23b zawierającym cDNA WT lub mutanta GFAP.</li>
	<li>Hodować bakterie w 1 L medium Luria-Bertani uzupełnionym o 100 μg/mL ampicyliny i 34 μg/mL chloroamfenikolu w temperaturze 37 °C do OD600 ~0,2.</li>
	<li>Dodaj izopropylowy β-D-1-tiogalaktopyranozyd (IPTG, 0,5 M) do końcowego stężenia 0,5 mM, aby wywołać ekspresję GFAP w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Pobieraj bakterie przez wirowanie w stężeniu 6 371 xg przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bakteria lizowa w 50 mL buforu TEN (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) uzupełniona 0,2 mM fluorkiem phnenylmetanesulfonylowo-fluorowym (PMSF) poprzez homogenizację w homogenizatorze Dounce.</li>
	<li>Wiruj w wirówce bakteryjne lizaty bakteryjne w stężeniu 22 045 xg przez 20 minut w 4 °C, a następnie wyciągaj granulek w buforze Triton X-100 (TEN z 1% (v/v) Triton X-100).</li>
	<li>Po wirowaniu w tych samych warunkach należy wyciągnąć powstały granulek w buforze o wysokiej zawartości soli (TEN z 1% (v/v) Triton X-100 i 1,5 M KCl).</li>
	<li>Po wirowaniu w tych samych warunkach przemyj granulkę buforem TEN.</li>
	<li>Rozpuść ostatni granulat w 10 mL buforu mocznika (8 M mocznika, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA i 0,2 mM PMSF) przez mieszanie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirówka pobiera mocznik w ilości 80 000x g w ultrawirówce stołowej w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Do frakcji rozpuszczalnej w moczniku dodaj polietyleiminę (1% (v/v)) do końcowego stężenia 0,06% (v/v) i inkubuj na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować w 80 000 xg w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie dializować frakcję supernatantu względem buforu A (6 M mocznika, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Ładuje się dializy na kolumnę jonizy CM-Sepharozo, wstępnie wyważoną w buforze A w systemie chromatografii NGC.</li>
	<li>Białka eluty o gradientie liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze A przez 1 godzinę z przepływem 1 mL/min.</li>
	<li>Frakcje zawierające GFAP w puli i dializują na buforze B (6 M mocznika, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA).</li>
	<li>Ładuje się dializy na kolumnę wymiany anionowej wstępnie wyrównaną w buforze B. Białka elutyczne o gradientzie liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze B przez 1 godzinę z przepływem 1 mL/min.</li>
	<li>Przeanalizuj ułamki kolumny za pomocą barwienia SDS-PAGE i błękitu Coomasie. Zbieraj te zawierające oczyszczony GFAP i przechowuj w temperaturze -80 °C. UWAGA: Liza bakteryjna może być ułatwiona przez kilka cykli zamrożenia i rozmrażania. Końcowe stężenie polietyleniminy nie powinno przekraczać 0,06% (v/v), powyżej którego wytrącają się także białka. Podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi, takimi jak PMSF i β-merkaptoetanol, kluczowe jest zawarcie jasnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz instrukcji dotyczących utylizacji odpadów niebezpiecznych. PMSF jest wysoce toksyczne i może powodować podrażnienia skóry, oczu oraz dróg oddechowych. Przygotuj roztwory PMSF świeżo w okapie i unikaj bezpośredniego kontaktu. Używaj β-merkaptoetanolu w dobrze wentylowanym miejscu, ponieważ emituje silne, toksyczne opary.</li>
</ol>
2. Montaż in vitro i test sedymentacyjny (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Rozcieńczony oczyszczony WT lub mutant GFAP do 0,3 mg/mL w 6 M moczniku w buforze o niskiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA i 14,4 mM β-merkapethanol).</li>
	<li>Dializuj próbki przy niskosolnym buforze zawierającym 4 M, a następnie 2 M mocznika przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbki dializować przy niskim poziomie soli bez mocznika przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dializuj próbki na buforze montażowym (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl i 14,4 mM β-merkapetanolu) w temperaturze pokojowej przez 12-16 godzin.</li>
	<li>Przelej mieszaniny montażowe na górę poduszki sacharozowej zawierającej 0,2 mL sacharozy 0,85 M w buforze montażowej.</li>
	<li>W teście sedymentacji o wysokiej prędkości wiruj mieszaniny w stężeniu 80 000x g przez 20 minut w 20 °C za pomocą stołowej mikro-ultrawirówki.</li>
	<li>Skoncentruj niezłożony GFAP w frakcji supernatantowej poprzez wytrącenie metanolu/chloroformu15. Ponownie zawiesz wytrącanie w 0,2 mL buforu próbki Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (w/v) siarczanu sodu dodecylowego (SDS), 12,5% (v/v) gliceroli, 0,01% (w/v) błękitu bromofenolowego oraz 355 mM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Ponownie zawiesij złożony GFAP w ułamku granulatu w buforze próbek Laemmli.</li>
	<li>Zarówno frakcje supernatantu, jak i granulek przeprowadź na żelu elektroforezy SDS (SDS-PAGE) o stężeniu 10% (w/v) i barw 10 mL błękitu Coomassie.</li>
	<li>W testie sedymentacyjnym o niskiej prędkości mieszaniny wirówki składają się w 3000 xg przez 5 minut w temperaturze 20 °C za pomocą wirówki stołowej.</li>
	<li>Dodaj 0,2 mL buforu próbki Laemmliego do nieagregowanych form GFAP w ułamku supernatantowym.</li>
	<li>Ponownie zawiesz zagregowany GFAP bezpośrednio w frakcji granulek w buforze próbkowym Laemmli w objętości proporcjonalnej do udziału supernatantu.</li>
	<li>Analizuj zarówno frakcje supernatantu, jak i pelletów za pomocą 10% (w/v) żelu SDS-PAGE, a następnie barwienia na błękit Coomassie. UWAGA: Metanol i chloroform to toksyczne rozpuszczalniki, które mogą powodować poważne skutki zdrowotne. Unikaj kontaktu ze skórą i wdychania. Ostrożnie obchodz się z okapem, aby zapobiec rozlaniom.</li>
</ol>
3. Negatywne barwienie i mikroskopia elektronowa (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Rozładowanie świecące z miedzianych siatek Formvar/pokrytych węglem przez 45 sekund przy napięciu 20 mA w systemie czyszczenia wyładowania żarowego.</li>
	<li>Dostarcz mieszanki montażowe na siatkę wyładowaną żarowością i pozwól próbkom przywiązać się do folii wsparcia przez 60 sekund.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu, sprowadzając krawędź siatki kawałkiem papieru do wsiąkniania.</li>
	<li>Przemywaj kratki wodą destylowaną, a następnie bejcuj 20 μL 1% (w/v) octana uranilu przez 60 sekund.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu do bejcowania i pozwól kratce wyschnąć na powietrzu przez 30 sekund.</li>
	<li>Zbadaj siatki pod mikroskopem transmisyjnym H-7600 (TEM) w trybie wysokiej rozdzielczości przy napięciu przyspieszającym 100 kV. UWAGA: Rozładowanie siatek w parowniku próżniowym przed dodaniem próbki białka poprawia adsorpcję próbki do siatki. Octan uranylu to radioaktywny i wysoce toksyczny związek chemiczny powszechnie stosowany w mikroskopii elektronowej do negatywnego barwienia. Obsługa tego odpadu wymaga ścisłego przestrzegania protokołów bezpieczeństwa oraz instrukcji dotyczących utylizacji odpadów niebezpiecznych, aby zminimalizować ryzyko narażenia dla personelu i środowiska. Przygotowuj roztwory octana uranilu wyłącznie w okapu, aby zapobiec wdychaniu cząstek lub oparów unoszących się w powietrzu.</li>
</ol>
4. Modyfikacja oksydacyjna (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Rozcieńczaj GFAP do 0,3 mg/mL w 6 M moczniku w buforze o niskiej zawartości soli (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA i 14,4 mM β-merkapethanu) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Dializuj na niskosolonym buforze zawierającym 4 mln mocznika przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Delikatnie mieszaj bufor za pomocą mieszadła magnetycznego, aby utrzymać równomierny rozkład i zapobiec gradientom stężenia.</li>
	<li>Po 2,5 godzinie przenieś błonę dializyjną do buforu niskosolnego zawierającego 2 M mocznika na kolejne 2,5 godziny w temperaturze pokojowej, zapewniając delikatne mieszanie przez cały proces.</li>
	<li>Dializuj przy niskim stężeniu soli bez mocznika w 4 °C przez 18 godzin.</li>
	<li>Próbki zdializowane należy podawać 10 mM H202przez 15 minut, a następnie stosować 10 lub 100 mM ditiotreitolu (DTT) przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Analizuj próbki białek standardowym 10% (w/v) SDS-PAGE bez β-merkapethanolu i barw 10 mL Coomassie Blue. UWAGA: Przy stosowaniu H2O2 należy obchodzić się z nim ostrożnie, ponieważ jest silnym czynnikiem utleniającym i może powodować oparzenia. Noszenie środków ochrony osobistej, aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami. DTT może powodować podrażnienia skóry, oczu i układu oddechowego. Podczas pracy z DTT i H202niezbędne jest przestrzeganie odpowiednich protokołówbezpieczeństwa, aby zminimalizować ryzyko.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie GFAP z mózgu szczurów AxD (rysunek 4A,B)
<ol>
	<li>Ekstrakt tkanek mózgowych za pomocą 10 mL buforu TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl i 5 mM EDTA) za pomocą homogenizatora Douce.</li>
	<li>Mózg w wirówce homogenizuje się w stężeniu 76 000x g w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyodrębnia powstały osad 10 mL buforu Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).</li>
	<li>Wirować w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyciągać powstały pellet za pomocą 10 mL buforu sacharozowego (0,85 M sacharozy i 0,5% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).</li>
	<li>Wirować w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie wyciągać powstały pellet za pomocą 10 ml buforu o wysokiej jakości soli (1,5 M KCl i 0,5% (v/v) Triton X-100 w buforze TEN).</li>
	<li>Wiruj w 76 000 xg w 4 °C przez 20 minut, a następnie ekstrahuj ostatni pellet za pomocą 10 mL buforu mocznika (8 M mocznika, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 5 mM EDTA).</li>
	<li>Pobierz frakcję supernatantu i dializuj na buforze kolumny Q (6 M mocznika, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA i 14,4 mM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Załaduj dializy na kolumnę anionową w systemie chromatograficznym NGC.</li>
	<li>Elutuj związane białko z gradientem liniowym 0-0,5 M NaCl w buforze Q z przepływem 1 mL/min.</li>
	<li>Frakcja zawierająca GFAP w basenie i dializuj na buforze kolumny S (6 M mocznika, 20 mM MES, pH 6 i 14,4 mM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Należy zastosować dializy do kolumny wymiany kationowej, a następnie eluować białka związane z liniowym gradientem 0-1 M NaCl w buforze S z przepływem 1 mL/min.</li>
	<li>Przeanalizuj eludowane frakcje za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie na niebieski oraz zbieraj te zawierające oczyszczony GFAP.</li>
</ol>
6. Analiza ubikwitynacji GFAP przez immunoblotting (Rysunek 4C)
<ol>
	<li>Uruchom oczyszczony GFAP na żelu SDS-PAGE 10% (z w/v).</li>
	<li>Przenieś białka z żelu do błony nitrocelulozowej.</li>
	<li>Zablokuj błonę, inkubując ją 10 mL 3% (w/v) procerum bydła w soli fizjologicznej z buforem Tris (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) zawierającej 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubuj błonę 5 μL anty-GFAP i 5 μL przeciwciał przeciwciał pierwotnych przeciwciał antyubikwityny, rozcieńczonych w 5 mL TBST w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj błonę trzy razy metodą TBST.</li>
	<li>Inkubuj błonę 5 μL przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi, rozcieńczonych w 5 mL TBST, w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Umyj błonę trzy razy metodą TBST.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą systemu detekcji obrazu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Przeanalizuj in vitro montaż natywnych GFAP za pomocą TEM i testów sedymentacyjnych (Rysunek 5), stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 2.1–2.13 oraz 3.1–3.6.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten ustanawia kompleksowe ramy eksperymentalne dla biochemicznej charakterystyki GFAP i jego mutantów związanych z chorobą. Dzięki zapewnieniu niezawodnego i ustandaryzowanego podejścia, ta metoda jest cennym zasobem, który poszerza naszą wiedzę o biologicznych rolach GFAP i jego patologicznych implikacjach, szczególnie w kontekście AxD. W tej sekcji omawiamy kilka kluczowych aspektów protokołu, w tym potencjalne modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów, ograniczenia metody, jej znaczenie w porównaniu z i...

Choroba Alexandra (AxD) to zaburzenie genetyczne powstałe w wyniku dominujących mutacji w genie kodującym kwaśne białko włókniste gleja (GFAP)1, białko typu III pośredniego filamentu (IF), występujące głównie u dojrzałych astrocyta. AxD charakteryzuje się upregulacją GFAP2, reaktywną astrogliozą3 oraz nagromadzeniem włókien Rosenthala, które są inkluzjami białkowymi zbudowanymi głównie z GFAP wraz z powiązanymi białkami, takimi jak αB-krystallina4 i ubikwityna5. Mutacje w genie GFAP zakłócają prawidłowy układ filamentu6, prowadząc do nieprawidłowej agregacji, indukcji komórkowych odpowiedzi stresowych7 oraz dalszej destabilizacji poprzez nieprawidłowe modyfikacje posttranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja8, oksydacja9 oraz ubikwitynacja10.
Pomimo centralnej roli GFAP w patologii AxD, mechanizmy molekularne, dzięki którym mutantny GFAP zakłóca składanie filamentów, sprzyja agregacji i wywołuje stres komórkowy, pozostają słabo poznane. Ta luka w wiedzy utrudnia rozwój terapii celowanych w celu zwalczania agregacji i toksyczności GFAP. Badanie właściwości biochemicznych GFAP i jego wariantów związanych z AxD jest kluczowe dla odkrycia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw postępu choroby. Jednak skłonność GFAP do agregacji oraz jego zmienione zachowanie składowe w wariantach chorobowych stanowią unikalne wyzwania dla analizy eksperymentalnej. Kontrolowane badania biochemiczne wymagają oczyszczonego GFAP, pozyskiwanego z modeli zwierzęcych lub poprzez ekspresję rekombinowaną, aby zbadać wpływ mutacji AxD na składanie, agregację i modyfikacje patologiczne filamentu.
Eksperymentalne podejścia przedstawione w tym badaniu oferują kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. Na przykład, choć modelekomórkowe 11 i badania immunohistochemiczne12 dostarczają cennych informacji na temat ekspresji i lokalizacji GFAP, często nie oddają precyzyjnych mechanizmów biochemicznych składania i agregacji filamentów ze względu na złożoność środowisk komórkowych. Dla porównania, opisane tutaj metody, takie jak testy montażu filamentów in vitro , analizy sedymentacji oraz charakteryzacja PTM, umożliwiają kontrolowane badania właściwości biochemicznych GFAP i jego wariantów związanych z chorobą. Te podejścia pozwalają badaczom analizować zachowanie składania i agregacji filamentu w uproszczonym systemie, ułatwiając identyfikację molekularnych mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji GFAP. Wcześniejsze badania wykazały użyteczność takich technik biochemicznych do analizy białek IF, w tym desmin13 i keratyn14, podkreślając ich przydatność w badaniach GFAP.
Dodatkowo, manuskrypt ten dostarcza informacji pomagających czytelnikom ocenić, czy opisane metody są odpowiednie dla ich konkretnych zastosowań. Naukowcy zainteresowani badaniami biochemicznych właściwości GFAP, jego zachowań montażowych (PTM) uznają te techniki za szczególnie przydatne do badania wariantów związanych z chorobą i ich patologicznych skutków. Integrując te podejścia biochemiczne z innymi systemami eksperymentalnymi, takimi jak badania komórkowe czy modele zwierzęce, naukowcy mogą uzyskać pełniejsze zrozumienie dysfunkcji GFAP w AxD i innych powiązanych astrocytopatiach.
Głównym celem tej metody jest przedstawienie eksperymentalnych podejść do analizy biochemicznej GFAP i jego wariantów związanych z AxD, w tym technik oczyszczania białek, testów montażu filamentów in vitro , analiz sedymentacji oraz charakteryzacji PTM. Metody te dostarczają kluczowych informacji na temat molekularnych podstaw dysfunkcji GFAP w AxD, torując drogę do rozwoju terapii. Ponadto zastosowanie tych technik eksperymentalnych poszerzy nasze zrozumienie biochemii GFAP w AxD i przyczyni się do szerszego rozwoju badań IF.

<table><tbody><tr><td>30% roztwór akrylamidu/Bis 37,5:1</td><td>Biorad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciw GFAP</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyubikwityna</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>Klon FK2</td></tr><tr><td>Wirówka XP Avanti J-26S</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroamfenikol</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sephrose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Coomassie Blue</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>Siatka miedziana</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX Micro ultracentrfuge</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator douncy</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>UR</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>Szczep pLysS E. coli BL21(DE3)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HiRes S</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HiTrap Q</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Agar)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Broom)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Honeywell</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>System chromatografii NGC</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima XE-90</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>poliehtyleneimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirnik S55S</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirnik S80AT3</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 kozy antymysze IgG&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 kozy antykrólikowe IgG&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy H-7700)</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranilu</td><td>Nauki o mikroskopie elektronowym &nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>Honeywell</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

Białko kwaśne włókniste glejowo (GFAP) jest kluczowym białkiem włókna pośredniego, kluczowym dla utrzymania integralności strukturalnej i funkcji astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym. Mutacje w GFAP są główną przyczyną choroby Alexandra (AxD), rzadkiej i często śmiertelnej choroby neurodegeneracyjnej, charakteryzującej się podwyższeniem poziomu GFAP oraz nagromadzeniem GFAP w postaci włókien Rosenthala. Przedstawiamy tutaj kompleksowy zestaw eksperymentalnych podejść do biochemicznej charakterystyki GFAP i jego wariantów wywołujących chorobę. Dzięki optymalnej ekspresji i zaawansowanym technikom oczyszczania osiągnęliśmy wysokie wydajności i czystość zarówno białek GFAP typu dzikiego, jak i mutanta. Do oceny wpływu mutacji patogennych na składanie filamentów, rozpuszczalność i agregację zastosowano testy biochemiczne. Dodatkowo badaliśmy rolę aberrancyjnych modyfikacji posttranslacyjnych w agregacji GFAP oraz ich wpływ na właściwości filamentów. Prace te poszerzają nasze zrozumienie roli GFAP w AxD i stanowią podstawę do opracowywania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na dysfunkcje GFAP. Ponadto przedstawione tutaj metodologie stanowią cenne narzędzia do badania biochemicznych konsekwencji mutacji GFAP oraz do rozwoju interwencji w zaburzeniach związanych z GFAP.

Aby zbadać, jak mutacje powodujące AxD wpływają na właściwości montażowe GFAP, wyprodukowaliśmy białka rekombinowane u bakterii, wykorzystując system ekspresji oparty na PET. Szczegółowo opisujemy protokoły wyrażania i oczyszczania GFAP, używając WT GFAP jako przykład. Po indukcji IPTG (Rysunek 1A, ścieżka 2), GFAP został oczyszczony w trzyetapowym procesie obejmującym przygotowanie ciała inkluzyjnego (Rysunek 1B) oraz chromatografię jonową, użyciem kolumny CM (...

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

Moje badania koncentrowały się na zmianach GFAP w dotkniętych astrocytach oraz na tym, jak ich dysfunkcja prowadzi do choroby Alexandra. Dzielimy się łatwymi do zrozumienia metodami badania GFAP. Wersje GFAP związane z chorobą są trudniejsze do badania, ponieważ nie składają się prawidłowo, mają tendencję do zlepiania się i mają nietypowe modyfikacje.Na początek umieść pręty formowe z wyładowania żaru oraz miedziane kratki pokryte węglem w systemie czyszczenia wyładowania żarowego. Czyść kratki przez 45 sekund przy 20 miliamperach. Dostarcz mieszanki montażowe na naładowaną siatkę z glottis (naładowaną krątką).Usuń nadmiar płynu, sprowadzając krawędź siatki kawałkiem papieru do wsiąkniania. Następnie myj kratki wodą destylowaną. Przebarw siatkę 20 mikrolitrami octana 1% pisuaru przez 60 sekund.Usuń nadmiar roztworu do bejcowania i pozwól kratce wyschnąć na powietrzu przez 30 sekund. Zbadaj przygotowane siatki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego w trybie wysokiej rozdzielczości przy napięciu przyspieszającym 100 kilowoltów. Pobierz tkanki mózgowe od szczurów choroby Alexandra, używając homogenizatora deuce, zawierającego 10 mililitrów buforu 10.Wiruj mózg homogenizuje się w temperaturze 76 000 G przy czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Następnie kolejno ekstrahuję powstały pellet za pomocą 10 mililitrów buforu Triton X-100, buforu sacharozowego, buforu o wysokiej jakości soli i buforu mocznika. Zbierz frakcję supernatantu i zdializuj ją w buforze kolumny Q.Teraz załaduj zdializowaną próbkę na kolumnę wymiany anionów w systemie chromatografii NGC. Eluć związane białka za pomocą liniowego gradientu od 0 do 0,5 molowego chlorku sodu w buforze Q z przepływem jednego mililitra na minutę. Zgrupuj białko kwaśne glialne włókniste zawierające frakcje i dializuj je w buforze kolumny S.Następnie zastosuj zdializowaną próbkę do kolumny wymiany kationowej i eluuj związane białka przy użyciu liniowego gradientu od 0 do 1 molowego chlorku sodu w buforze S z przepływem jednego mililitra na minutę. Przeanalizuj ułamki uciekanych według strony SDS i barwienia Coomssie'ego na niebieski. Zbieraj frakcje zawierające oczyszczone białko kwaśne włókniste glejowe.GFAP typu dzikiego tworzył jednolite włókna o średnicy 10 nanometrów in vitro, podczas gdy mutant R239H produkował gęste struktury agregowane, podczas wirowania o niskiej prędkości większość dzikich GFAP pozostała w supernatancie, podczas gdy większość Gfap R239H znajdowała się w frakcji granulek. Podczas wirowania wysokoprędkościowego niemal cały dziki typ GFAP i R239H GFAP znaleziono w frakcjach granulek, co potwierdza efektywną sedymentację. Po obróbce nadtlenkiem wodoru, dziki typ GFAP utworzył wiele pasm o wysokiej masie cząsteczkowej, które zostały zredukowane do monomerów przez DTT.W braku stresu oksydacyjnego R239H GFAP utworzył pasmo o masie cząsteczkowej około 180 kilodaltonów, co wymagało wysokiego stężenia ditiotreitolu do przekształcenia w formę monomerową. Ilościowa analiza potwierdziła, że wyższy odsetek Gfap R239H pozostał w postaci o wysokiej masie cząsteczkowej w porównaniu do GFAP typu dzikiego. Immunoblotting potwierdził, że natywne GFAP z mózgu szczura R237H jest ubiquitinowany, co potwierdzają nakładające się sygnały GFAP i ubikwityny.Mikroskopia elektronowa wykazała, że GFAP z mózgu szczura choroby Alexandra nie tworzy filamentów. W wirowaniu o niskich prędkościach większość GFAP z mózgów szczurów choroby Alexandra pozostawała w supernatancie, podczas gdy podczas wirowania o dużej prędkości osadzał się w frakcji granulek. Ilościowa analiza potwierdziła przesunięcie rozkładu GFAP z supernatantu na pellet pomiędzy wirowaniem niskich i szybkich.Wciąż brakuje nam jasnego obrazu tego, jak mutantyczny GFAP zmienia filamenty, pobudza agregację i uszkadza komórki. Nasz protokół bezpośrednio bada te mechanizmy. Opracowaliśmy ustandaryzowaną metodę oczyszczania zarówno normalnego, jak i mutacyjnego GFAP, co znacznie ułatwia badanie tego białka i jego roli w chorobach.Protokół ten usprawnia przygotowanie normalnego i mutantowego GFAP, aby wyjaśnić, jak składanie, agregacja i modyfikacje filamentu przyczyniają się do choroby Alexandra.

experimental-approaches-for-biochemical-analysis-glial-fibrillary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Przedstawione tutaj są dwie metody, które mogą być używane indywidualnie lub w połączeniu do analizy wpływu beta-amyloidu na strukturę skrzepu fibryny. W zestawie znajduje się protokół tworzenia skrzepu fibrynowego in vitro, a następnie metody zmętnienia skrzepu i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Analiza nieprawidłowości w strukturze skrzepu fibryny wywołanych przez β-amyloid za pomocą spektroskopii i skaningowej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół swobodnego pośredniego testu immunofluorescencyjnego na odcinkach biopsji skóry, który pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby wariantów konformacji alfa synukleiny związanej z chorobą Parkinsona i wielu białek obwodowego układu nerwowego.

Celowanie w agregaty alfa synukleiny w obwodowych włóknach nerwowych skóry za pomocą swobodnego testu immunofluorescencji

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Poznaj metody biochemicznej analizy białka GFAP i jego mutacji związanych z chorobą Aleksandra. Protokół obejmuje oczyszczanie białek, analizę tworzenia filamentów i modyfikacji potranslacyjnych.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Przeglądaj więcej filmów