Name: Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj protokół głębokiego obrazowania całokomórkowego SMLM z wykorzystaniem DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów. Ta metoda umożliwia superrozdzielcze badania struktur komórkowych bez konieczności stosowania niestandardowej optyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane przez Human Frontier Science Program Organization (HFSP) poprzez interdyscyplinarne stypendium podoktorskie dla CZ (LT0025/2023-C) oraz Engineering and Physical Sciences Research Council wspierających M.T. (EP/R513143/1 i EP/W524335/1) oraz O.P.L.D (EP/R513143/1 i EP/T517793/1). S.S również uznaje Royal Society poprzez stypendium Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 oraz DHF\R\251006). Prace te były również wspierane przez granty Inicjatywy Chana Zuckerberga (2023-321188) oraz BBSCR (BB/Y513064/1) dla S.S.

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do oświadczenia.

Mikroskopia fluorescencyjna o superrozdzielczości przełamała barierę dyfrakcyjną, znacząco poprawiając rozdzielczość przestrzenną. Jednak jego powszechne zastosowanie w badaniach biologicznych napotyka ciągłe wyzwania. Co istotne, kompromisy między FOV, rozdzielczością i głębokością penetracji utrudniają optymalizację wszystkich trzech czynników jednocześnie. Wyzwania te zostały rozwiązane poprzez wykorzystanie połączonych możliwości SMLM oraz obrotowej mikroskopii dyskowej konfokalnej, wzmocnionej przez optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). Integrując matryce mikrosoczewek ze standardową konfiguracją SDC, co umożliwił komercyjny system SDC-OPR, zwiększono zbieranie fotonów, a efektywny rozmiar otworka zmniejszono, co doprowadziło do znacznej poprawy rozdzielczości. W porównaniu ze standardowym SDC, system SDC-OPR wykazał wyraźną poprawę mocy rozdzielczości, skutecznie rozróżniając cechy oddzielone o 10 nm14 w płaszczyźnie ogniskowej, podczas gdy standardowy SDC mógł rozróżnić tylko odległości większe niż 20 nm11. Ta zwiększona zdolność rozdzielczości podkreśla korzyści z przeniesienia fotonu do osiągania separacji na skalę molekularną. Konkretnie, precyzja lokalizacji bocznej poniżej 2 nm została osiągnięta w płaszczyźnie ogniskowej (z = 0 μm), przy czym precyzja boczna pozostawała poniżej 10 nm na głębokościach do 9 μm, w połączeniu z wysoce adaptacyjnym kątem widzenia 53 × 53 μm² lub 76 × 76 μm². Nawet przy dużym polu widzenia 211 × 211 μm² system zapewniał imponującą średnią precyzję lokalizacji w płaszczyźnie wynoszącą 9,5 nm. Wyniki te podkreślają zdolność systemu do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w całych komórkach.
Jeśli chodzi o reakcje sprzężenia dla różnych stosowanych przeciwciał, protokół musi być ściśle przestrzegany, aby zapewnić optymalny stosunek przeciwciał do DNA. Przekroczenie tego stosunku może obniżyć precyzję lokalizacji i negatywnie wpłynąć na pomiary ilościowe, takie jak te wykonywane w qPAINT25. Dlatego kluczowe jest zweryfikowanie stosunku za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis, co zapewnia ostateczny stosunek 1:1 między DNA a przeciwciałem.
Kluczowym krokiem w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów mikrotubul o wysokiej rozdzielczości jest właściwa fiksacja. Konwencjonalne metody fiksacji, oparte wyłącznie na wysokim stężeniu PFA, często zakłócają struktury mikrotubul. Zamiast tego, stosowanie glutaraldehydu (GA) samodzielnie lub w połączeniu z PFA znacząco poprawia zachowanie strukturalne26,27.
Dla optymalnego obrazowania niezbędny jest obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA), aby zmaksymalizować zbieranie fotonów na jedno zdarzenie pojedynczej cząsteczki. W komercyjnym systemie SDC-OPR moc lasera jest celowo niższa niż w konwencjonalnych mikroskopach TIRF używanych w SMLM, aby zminimalizować fotobielenie próbek. Chociaż DNA-PAINT eliminuje problemy z fotobieleniem i teoretycznie może stosować wyższą moc lasera, obecne systemy komercyjne nakładają ograniczenia, wymagając dłuższego czasu naświetlania w porównaniu do oświetlenia TIRF. Ponadto, ponieważ oświetlenie w SDC-OPR jest konfokalne, cząsteczki nie są ciągle wzbudzane podczas ekspozycji. W rezultacie konieczne są dłuższe czasy naświetlania względem ciągłego oświetlenia TIRF; W tym badaniu zastosowano czas ekspozycji wynoszący 300 ms. Jednak w zależności od wymagań rozdzielczości danego eksperymentu, można zastosować krótsze czasy całkowania (np. 150-200 ms) przy minimalnej utracie rozdzielczości28.
Optymalizacja stężenia nici obrazującego jest kluczowym krokiem, aby zapewnić, że sygnały pojedynczych cząsteczek pozostają dobrze rozdzielone, jednocześnie generując wystarczającą liczbę lokalizacji do dokładnej rekonstrukcji. Ta regulacja jest analogiczna do standardowych akwizycji SMLM, gdzie równowaga między gęstością zdarzeń a nakładaniem się sygnałów jest starannie kontrolowana. Optymalna koncentracja obrazowania powinna być dostosowana do każdego konkretnego celu. Na przykład dla mikrotubul zaleca się początkowe stężenie nici obrazującej poniżej 1 nM, z dostosowaniem w razie potrzeby.
Utrzymanie stabilnej ostrości podczas długotrwałych akwizycji jest kluczowe, ponieważ dryf osiowy (z) nie może być skorygowany w postprocessingu. Dryf boczny (xy) można skompensować za pomocą markerów RCC lub fiducjalnych. W tym układzie system Perfect Focus (PFS) mikroskopu zapewnia stabilność ostrości przez wiele godzin obrazowania.
Podsumowując, integracja SMLM z SDC-OPR zapewnia potężną platformę do obrazowania o wysokiej rozdzielczości głęboko wewnątrz całych komórek, pokonując tradycyjne kompromisy między rozdzielczością, głębokością i FOV. Jednak aby w pełni wykorzystać możliwości systemu, niezbędna jest skrupulatna uwaga na warunki eksperymentalne, od koniugacji i utrwalania przeciwciał po ustawienia akwizycji i przetwarzanie danych. Każdy krok, od przygotowania próbki po korektę dryfu, odgrywa kluczową rolę w uzyskaniu wiarygodnych i precyzyjnych danych. Dzięki starannej optymalizacji protokołów to podejście oferuje solidne i wszechstronne rozwiązanie do obrazowania ilościowego, nanoskalowego w złożonych próbkach biologicznych. Protokół ten ma pomóc społeczności w wdrażaniu mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki oraz w uzyskaniu superrozdzielczych obrazów z planów próbek, do których trudno uzyskać dostęp przy użyciu konwencjonalnego oświetlenia TIRF lub HILO. Oba cele są realizowane za pomocą komercyjnie dostępnych mikroskopów, które zwykle znajdują się w mikroskopach na całym świecie.
W kontekście innych i przyszłych zastosowań metoda ta ma zastosowanie zarówno do próbek całych komórek, jak i do bardziej złożonych próbek tkanek na większych głębokościach obrazowania, co wykazano w poprzednich badaniach14. W przeciwieństwie do metod wymagających fizycznego sekcjonowania, technika ta umożliwia obrazowanie wolumetryczne nienaruszonych tkanek, zachowując rodzimą architekturę i minimalizując artefakty wprowadzane przez fizyczne sekcjonowanie. Zastosowanie mniejszych sond powinowactwa, takich jak nanociała, dodatkowo zwiększa penetrację tkanek w porównaniu z przeciwciałami pełnej długości, umożliwiając bardziej jednolite oznakowanie w gęstych próbkach. Takie podejście otwiera drzwi do badania organizacji komórkowej i rozkładu cząsteczek in situ z wyższą dokładnością. Poza tymi zastosowaniami strategia umożliwia także wysokoprzepustowe przesiewanie nanostruktur i zespołów biomolekularnych, umożliwiając systematyczne badania heterogeniczności i funkcji strukturalnej. Ponadto najnowsze osiągnięcia w DNA-PAINT doprowadziły do samogaszenia sond obrazujących, opartych na interakcjach barwnik-gasnik lub barwnik-barwnik 29,30,31, które skutecznie obniżają sygnały tła, zwiększają intensywność fluorescencji i zwiększają rozdzielczość przestrzenną, umożliwiając szybsze tempo pozyskiwania. Integracja tych sond fluorogenicznych z ramami SDC-OPR ma potencjał dalszego zwiększenia zarówno szybkości, jak i rozdzielczości obrazowania. Połączenie tych osiągnięć z mocnymi stronami systemu SDC-OPR mogłoby rozszerzyć jego zastosowanie na bardziej złożone próbki biologiczne, ustanawiając platformę jako elastyczne narzędzie do szczegółowego mapowania struktur komórkowych i molekularnych w szerokiej gamie tkanek.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM)1 to rodzina technik superrozdzielczości, które osiągają rozdzielczość na skali nanoskali poprzez rozdzielanie emisji pojedynczych fluoroforów w czasie i lokalizację ich z dużą precyzją. Udane SMLM wymaga wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR) do wykrywania zdarzeń pojedynczych cząsteczek, co tradycyjnie ograniczało jego zastosowanie do układów optycznych zapewniających intensywną, lokalną wzbudzę. Najczęściej spotykane konfiguracje to mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznej (TIRF)2 oraz oświetlenie optyczne z dużym nachyleniem laminowanej folii optycznej (HILO)3. TIRF redukuje fluorescencję tła poprzez tworzenie pola unikającego, które selektywnie pobudza fluorofory w odległości kilku nanometrów od pokrywy, tłumiąc tym samym nieostre oświetlenie. Jednak to ograniczenie sprawia, że TIRF nie nadaje się do obrazowania głębszych struktur biologicznych, takich jak organelle sięgające do domeny zewnątrzkomórkowej. Mikroskopia HILO zapewnia większą głębokość penetracji, umożliwiając obrazowanie kilkuset nanometrów powyżej szkła podłoża. Odbywa się to kosztem zmniejszonego pola widzenia (FOV)4 oraz nierównego oświetlenia przy coraz wyższych płaszczyznach, co ogranicza zastosowanie w większych strukturach komórkowych. W ostatnich latach techniki mikroskopii świetlnej (LSM), takie jak lattice light sheet 5,6,7 oraz jednoobiektywowa mikroskopia oświetleniowa jednopłaszczyznowa (soSPIM)8, rozszerzyły SMLM o obrazowanie wolumetryczne i tkankowe. Poprzez kształtowanie wiązki wzbudzającej w cienkie, ustrukturyzowane arkusze światła, LSM osiąga optyczne przekroje przy zmniejszonym tle i fototoksyczności. SoSPIM rejestruje płaszczyzny ogniskowe prostopadłe do osi detekcji w jednej ekspozycji, umożliwiając szybkie obrazowanie objętościowe z niemal izotropową rozdzielczością. Aplikacja soSPIM wykazała 3D SMLM w całych komórkach i małych organellach (głębokość >20 μm) z izotropową rozdzielczością do 40 nm orazminimalnym tłem poza ostrością 9. Pomimo swoich mocnych stron, metody te zazwyczaj wymagają przezroczystych próbek, specjalistycznej optyki i złożonego wyrównania, a także pozostają wrażliwe na aberracje optyczne i rozpraszanie w grubszych próbkach.
Mikroskopia konfokalna oferuje alternatywę poprzez odrzucanie światła nieostrego za pomocą otworu przed detektorem, połączonego z lustrzami ultrazkumawiającymi10. Ta możliwość optycznego przecinkowania umożliwia obrazowanie głębokie objętościowe z wysokim SNR. W szczególności mikroskopia obrotowa dyskowa konfokalna (SDC) łączy szybkość i szerokokątne wykrywanie konwencjonalnego obrazowania z możliwością sekcjonowania systemów punktowego. W konwencjonalnym SDC osiąga się to poprzez zastosowanie obracającego się dysku z równoległymi otworkami, często połączonego z wyrównaną matrycą mikrosoczewek. Mikrosoczewki zbierają znaczną część emitowanej fluorescencji i skupiają ją przez otworki, co zmniejsza sygnał tła. Ta konfiguracja zapewnia szybkie przekrojowanie optyczne bez potrzeby specjalistycznej optyki czy dodatkowego przygotowania do montażu próbki, co czyni ją solidnym wyborem, który można łatwo zaimplementować i zoptymalizować do głębokiego przechwytu obrazu SMLM11.
W tym badaniu zastosowano konfokalny skaner CSU-W1 z obrotowym dyskiem wyposażonym w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). W przeciwieństwie do standardowego SDC, SDC-OPR wprowadza drugą matrycę mikrosoczewek, która projektuje emitowane fotony na komplementarny wzór dziurki12, aby ograniczyć rozpraszanie i odzyskać fotony, które w innym przypadku zostałyby odrzucone. To przesunięcie fotonu skutecznie wyostrza funkcję rozpraszania punktu (PSF), zwiększając rozdzielczość boczną ponad konwencjonalne SDC, jednocześnie odrzucając światło nieostre13. Konkretnie, matryca mikrosoczewek SDC-OPR przekierowuje fotony poza osią do ich najbliższych punktów początkowych, skutecznie zwiększając wykrytą jasność fluorescencji w porównaniu ze standardowym SDC. Ponadto korzyści z rozdzielczości SDC-OPR można wzmocnić poprzez dekonwolucję obrazu. Iteracyjne algorytmy dekonwolucyjne doprecyzownie udoskonalają PSF, redukują tło i poprawiają stosunek sygnału do tła bez konieczności zmiany konfiguracji optycznej. To połączone podejście daje znaczącą przewagę w zakresie precyzji lokalizacji w porównaniu ze standardowym SDC dla eksperymentów lokalizacji pojedynczych cząsteczek14.
Przedstawiono tutaj solidny i powtarzalny protokół mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki z użyciem obrotowego mikroskopu dyskowego konfokalnego wyposażonego w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). To podejście łączy precyzję DNA-PAINT na skalę nanoskalową z prędkością, kątem pola widzenia i głębokością penetracji obrazowania dysku obrotowego. DNA-PAINT, adaptacja akumulacji punktów do obrazowania topografii nanoskalowej (PAINT)15, opiera się na tymczasowej hybrydyzacji fluorescencyjnie oznakowanych "nici" obrazujących się z komplementarnymi "dokującymi" nici zakotwiczonymi w celach molekularnych. Te odwracalne zdarzenia wiązania generują stochastyczne sygnały fluorescencji, które można precyzyjnie zlokalizować, umożliwiając wysokorozdzielczą rekonstrukcję ultrastruktury komórkowej. DNA-PAINT umożliwia użycie wysoce fotostabilnych fluoroforów, zapewnia kinetykę regulowania wiązania do precyzyjnej kontroli warunków obrazowania oraz łagodzi fotobielenie poprzez ciągłe uzupełnianie nici fluorescencyjnychobrazujących 16.
Aby zapewnić powtarzalność i swoistość, podejście opiera się na niestandardowych sprzężeniach DNA-przeciwciała, które łączą nici dokujące z przeciwciałami wtórnymi. Przedstawiono szczegółowe kroki przygotowania próbki, w tym koniugację przeciwciał z DNA, aby wspierać solidne wyniki eksperymentalne. Protokół jest weryfikowany na dobrze scharakteryzowanych strukturach komórkowych, takich jak jądrowe kompleksy porowe (NPC)17 oraz mikrotubule w próbkach stałych, co stanowi punkt odniesienia do oceny dokładności rekonstrukcji. Zmiany rozdzielczości, określane za pomocą precyzji lokalizacji jako pośredniego, są dodatkowo oceniane w zależności od FOV i głębokości obrazowania.
Ponadto efektywność tego procesu dla obrazowania multipleksowanego jest demonstrowana za pomocą Exchange-PAINT18, strategii umożliwiającej sekwencyjną wizualizację wielu celów z tym samym barwnikiem i jednym źródłem laserowym opartym na DNA-PAINT. Workflow Exchange-PAINT jest stosowany do wielokolorowego obrazowania mitochondriów, mikrotubul i NPC w tej samej próbce.
Razem protokół ten dostarcza kompleksowych wskazówek i kluczowych notatek dotyczących adaptacji dotyczących konjugacji przeciwciał i DNA, przygotowania próbki, warunków obrazowania oraz analizy danych, umożliwiając badaczom wykonywanie powtarzalnego obrazowania DNA-PAINT na SDC-OPR. Poprzez rozszerzenie obrazowania o wysokiej rozdzielczości poza ograniczenia głębokości i widzenia charakterystyczne dla podejść opartych na TIRF, metoda ta poszerza zastosowanie SMLM na szeroki zakres kontekstów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy kwas</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Troloks</td></tr><tr><td>3,4-dihydroksybenzoowy kwas &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60 razy; Obiektyw Apo NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA kolumna odsalania spinowego zawierająca żywicę wykluczającą rozmiar &nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Kolumny odsolania Zeba Spin dla kroku 2.4</td></tr><tr><td>Akcutaza – Enzym Cell Detachment Medium</td><td>Komórka Promocyjna</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaka sdAb (1H1) anty-GFP w połączeniu z niestandardowym DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Masywna fotonika</td><td>Produkt niestandardowy</td><td>Anty-GFP nanobody dla Drosophili</td></tr><tr><td>Alpaka sdAb (1H1) anty-GFP w połączeniu z DNA</td><td>Masywna fotonika</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anty-GFP - F3</td><td>Anty-GFP nanobody dla NUP</td></tr><tr><td>Antyalfa tubulina (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>Masywna fotonika</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Stożkowa rurka odśrodkowa 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa rurka odśrodkowa 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop SDC-OPR</td></tr><tr><td>Odsalanie kolumn spinowych Sephadex G-25 (żywica wykluczająca rozmiar do oczyszczania DNA) &nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marka: Cytiva. Kolumny G-25 dla kroku 2.5</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Serum bydlęce płodowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimid-PEG2-sukcinimidyl &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Media 5A McCoya</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-morfolino)etansulfonowy kwas)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówkowe 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Rurki mikrowirówki 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis mikroobjętościowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-JEDEN-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki 90 nm -Złoto</td><td>Cytodiagnostyka</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CMOS Orca Fusion-BT</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (1x roztwór)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehydu (z metanolem), bez metanolu</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Chlorek potasu &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-Dioksydenaza &nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>Sód &nbsp; Wodorotlenek</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało TOM20</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton &nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtra odśrodkowego ultrafiltracyjnego, 100 kDa MWCO</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Producent: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Zjeżdżalnia 8 studni Wysokie szklane dno</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Suwak VI 0,5 Szklane dno</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą dna-paint na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczątkowa (SMLM) umożliwia obrazowanie struktur komórkowych na nanoskalę, ale zazwyczaj ogranicza się do obrazowania w pobliżu pokrywy ze względu na ograniczenia całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz oświetlenia wysoko nachylonego i optycznego (HILO). Przedstawiono tutaj protokół wykorzystujący obrotowy dyskowy mikroskop konfokalny wyposażony w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR) do przeprowadzania SMLM w całych komórkach. Metoda ta umożliwia wysokoprecyzyjne obrazowanie pojedynczych cząsteczek w całej objętości komórki, wykorzystując akumulację punktów DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT) bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy skomplikowanych schematów oświetlenia. Protokół zawiera krok po kroku przewodnik po konfiguracji komercyjnie dostępnego obrotowego mikroskopu dyskowego (np. CSU-W1 SoRA) do obrazowania SMLM, w tym parametry akwizycji zoptymalizowane pod kątem obrazowania głębokiego. Opisano kroki przygotowania próbek do oznaczania celów wewnątrzkomórkowych sondami sprzężonymi z DNA do wykonania obrazowania DNA-PAINT, w tym strategie wielokolorowego obrazowania kilku celów. Po akwizycji obrazu następuje lokalizacja i rekonstrukcja pojedynczych cząsteczek przy użyciu standardowych pakietów oprogramowania. Omawiane są również kluczowe kwestie minimalizujące tło, optymalizację rozdzielczości bocznej oraz zapewnienie jakości obrazowania na całej głębokości komórki. Ten dostępny protokół pozwala badaczom na wykonywanie głębokiego, całokomórkowego SMLM przy użyciu standardowego sprzętu konfokalnego, rozszerzając zakres pytań biologicznych możliwych do rozwiązywania obrazowania pojedynczątkowym poza obszary bliskie błonie.

Aby zademonstrować możliwości obrazowania superrozdzielczości systemu SDC-OPR (rysunek 1A), jego rozdzielczość w płaszczyźnie oceniono poprzez eksperymenty obrazowania DNA-PAINT (rysunek 1B) na jądrowych kompleksach porowych (NPC), które stanowią biologiczną strukturę referencyjną17. Rysunek 1C przedstawia reprezentatywny obraz DNA-PAINT SDC-OPR nukleoporiny 96 (Nup96), oznaczonej monomerycznie wzmocnionym zielonym fluorescencyjnym białkiem (mEGFP) i oznakowanej DNA-sprzężonymi nanociałkami anty-GFP, w komórkach U2OS. Powiększone panele ujawniają podstrukturę NUP, a Rysunek 1D pokazuje pary białek Nup96 (oznaczone strzałkami) zgodne z oczekiwaną 8-krotną symetrią porów jądrowych. Na Rysunku 1E odległość euklidesową między parami Nup96 została zmierzona przez ich wyrównanie i narysowanie histogramu przekroju poprzecznego sumowanego obrazu (n = 16 par). Analiza wykazała separację szczyt-pik o długości (13 ± 2) nm (rysunek 1E), co zgadza się z wynikami modeli EM oraz obrazowania HILO i TIR23. Każde dopasowanie szczytu wykazywało odchylenie standardowe 4 nm, potwierdzając wysoką precyzję lokalizacji (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) osiągniętą przy użyciu DNA-PAINT na SDC-OPR. Co istotne, ta precyzja była utrzymywana na całym obszarze 53 × 53 μm², co jest wyjątkowe dla systemów opartych na konfokalach.
Aby zademonstrować zdolność do obrazowania wielokolorowego, Nup96, mitochondria i mikrotubule w komórkach U2OS zostały oznaczone DNA do pozyskiwania za pomocą Exchange-PAINT18. Technika ta wykorzystuje ortogonalne nici DNA sprzężone z jednym fluoroforem, co pozwala na wzbudzanie wszystkich celów tym samym źródłem laserowym (rysunek 2A). Zamiast jednocześnie pobierać sygnały, rozdziela je na kolejne rundy obrazowania, co ułatwia prostą integrację z dowolnym komercyjnym systemem SDC-OPR. Rysunek 2B przedstawia Nup96 na niebiesko oznaczony nanociałem anty-GFP, mitochondria na czerwono z wtórnym przeciwciałem przeciw-TOM20 oraz mikrotubule na zielono z pierwotnym przeciwciałem przeciw α-tubulinie. Warto zauważyć, że znakomita precyzja lokalizacji pojedynczych cząsteczek uzyskana dla obrazowania jednokolorowego Nup96 została zachowana na wszystkich celach w eksperymencie wielocelowym, co dało wartości precyzji lokalizacji 3,9 nm dla NPC, 4,0 nm dla α-tubuliny oraz 3,3 nm dla mitochondriów (Rysunki 2B , panele 1, 2 i 3).
Do obrazowania o dużym polu widzenia mikrotubule w komórkach HeLa były obrazowane przy użyciu różnych powiększeń dostępnych w systemie SDC-OPR, połączonych z różnymi ustawieniami binningu kamery, aby utrzymać rozmiary pikseli w zakresie od 78 nm do 108 nm (Rysunek 3). Rysunek 3A przedstawia cytoszkielet mikrotubuli 10 komórek HeLa, z kolorami symbolizującymi precyzję lokalizacji. Przy powiększeniu 1× średnia precyzja lokalizacji jest zauważalnie gorsza w porównaniu do większych powiększeń (Rysunek 3B-D), a zaobserwowana jest większa zmienność. Wynika to z mniejszej gęstości mocy lasera w porównaniu z większym polem widzenia, gdzie widoczny staje się profil oświetlenia Gaussa, prowadzący do obniżonej precyzji w kierunku krawędzi pola widzenia. Niemniej jednak, osiągnięcie średniej precyzji lokalizacji 9,5 nm na rozległym polu widzenia 211 × 211 μm² jest imponujące dla systemów opartych na konfokalach i umożliwia badania heterogeniczności biologicznej o wysokiej rozdzielczości.
Wreszcie, możliwość obrazowania całych komórek jest demonstrowana poprzez uzyskanie obrazów DNA-PAINT sieci mikrotubul w stałych komórkach HeLa o objętości konfokalnej ~500 nm grubości i 1 μm kroku z, przy użyciu największego powiększenia systemu (4×, 53 × 53 μm² FOV). Rysunek 4A przedstawia obrazy rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek dla każdej płaszczyzny z, wraz z odpowiednią precyzją lokalizacji i wartościami NeNA. Dodatkowo, na rysunku 4C przedstawiono trójwymiarową wizualizację kolorową sieci mikrotubul w komórce HeLa. Wraz ze wzrostem głębokości liczba wykrytych fotonów maleje z powodu rozpraszania i aberracji optycznych, co skutkuje obniżeniem precyzji lokalizacji zarówno dla precyzji lokalizacji wyprowadzonej z dolnej granicy Cramér-Rao (CRLB) (rysunek 4A, po prawej), jak i tych obliczonych za pomocą metryki NeNA. Mimo to wysoki poziom zbierania fotonów możliwy przez system SDC-OPR umożliwia σSMLM ≤ 10 nm dla głębokości obrazowania do 9 μm przy wąskim rozkładzie. Rzeczywiście, dwuściankowe struktury mikrotubul włóknistych były wyraźnie rozróżnione na różnych głębokościach: w pobliżu granicy pokrywy z komórką, w pośrednich pozycjach osiowych oraz na górze komórki, z odległością szczyt-pik między 30 nm a 40 nm (rysunek 4C), co jest zgodne z podanymi wartościami24. Wyniki te podkreślają zdolność SDC-OPR do dostarczania obrazów o wysokiej rozdzielczości na dużych obszarach widzenia i na całej wysokości komórek.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Mikroskopia lokalizacyjna w płaszczyźnie różnych próbek komórek oraz wielokolorowe obrazowanie superrozdzielcze. (A) Schemat systemu konfokalnego Wirującego Dysku z optycznym przydziałem fotonów (SDC-OPR), z matrycą mikrosoczewek zaprojektowaną w celu maksymalizacji zbierania fotonów. (B) Schemat DNA-PAINT: Fluorescencyjne znakowane nici DNA, zwane niciami obrazującymi, tymczasowo hybrydydują z komplementarnymi sekwencjami DNA (nici dokujące ), które są zakotwiczone w przeciwciało/nanoniku, który celuje w interesujące białko. Te krótkotrwałe zdarzenia wiązania generują sygnały fluorescencyjne, które pojawiają się jak stochastyczne miganie. (C) Reprezentatywny obraz DNA-PAINT w systemie SDC-OPR z wykorzystaniem 4× powiększenia NPC komórek U2OS. Możliwość wysokiej rozdzielczości jest widoczna w wkładzie, gdzie poszczególne postacie NPC są wyraźnie rozstrzygnięte. (D) DNA-PAINT wzmocniony SDC-OPR umożliwia wizualizację pojedynczych NPC, gdzie białe strzałki podkreślają charakterystyczne pary białek Nup96 w architekturze porów. (E) Rozkład pomiarów odległości między dimery Nup96 (n=16 par) w ramach pojedynczych jednostek symetrii NPC. Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Zamiana PAINT na obrazowanie wielokolorowe za pomocą mikroskopu SDC-OPR. (A) Schemat Exchange-PAINT trzech celów obrazowanych kolejno. Trzy cele białkowe zostały oznaczone jako przeciwciała funkcjonalizowane przez DNA, fragmenty Fab lub nanociała. Nici obrazowania Cy3B były obrazowane sekwencyjnie według typu nici z krokami płukania między rundami obrazowania. (B) Trójkolorowe obrazowanie Exchange-PAINT komórek U2OS za pomocą mikroskopii SDC-OPR z użyciem powiększenia 4×, pokazujące mikrotubule (czerwone; oznaczone DNA-sprzężoną anty-α-tubuliną), mitochondria (zielone; nanociałka ukierunkowane na TOM20 DNA), oraz NPC (niebieski; Nup96 oznaczony tagiem mEGFP z nanociałami DNA anty-GFP). Pasek skali: 5 μm. Region przybliżony podkreśla zwiększoną rozdzielczość uzyskaną w systemie SDC-OPR, koncentrując się na (1) mitochondriach, (2) mikrotubulach oraz (3) NUP. Paski skalowe = 1 μm. Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie DNA-PAINT w dużych FOV na mikroskopie SDC-OPR. Obrazy DNA-PAINT mikrotubul (oznakowanie anty-α-tubulinowe) uzyskane przy wielu powiększeniach: (A) 1× powiększeniu i 1 binningu (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2,8× i 2 binningach (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× powiększeniu i 4 binningach (FOV 53 × 53 μm²). Kolor reprezentuje precyzję lokalizacji od 0 do 16 nm w przypadku powiększenia 1x i 0-4 nm w pozostałych. (D) Precyzja lokalizacji mierzona w różnych odległościach (w μm) od środka pola pola dla powiększeń 1× (czerwony), 2,8× (żółty) i 4× (zielony). Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie DNA-PAINT całej komórki. (A) Po lewej. Obrazowanie mikrotubul objętościowych w komórkach HeLa za pomocą DNA-PAINT wykonane za pomocą SDC-OPR przy powiększeniu 4×, pokazując przekroje osiowe od z = 0 do 9 μm (kroki 1 μm). Każda płaszczyzna pokazuje pozycję z , precyzję lokalizacji oraz metrykę NeNA. Pręty skalowe: 5 μm (xy). Racja. Precyzja lokalizacji kontra głębokość penetracji dla wszystkich płaszczyzn. (B) 3D renderowania sieci mikrotubul na tej samej komórce HeLa co w (A). Kolor oznacza głębokość penetracji od 0 do 9 μm. (C) Powiększone zdjęcia podświetlonych małych obszarów z każdej głębokości penetracji zaznaczone w (A). Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Nasz protokół wykorzystuje DNA-PAINT na obrotowym dyskowym mikroskopie konfokalnym z optycznym przesunięciem fotonów, aby pokonać ograniczenia głębokości. DNA-PAINT osiąga obecnie niezwykle wysoki poziom rozdzielczości dzięki multipleksom i możliwościom ilościowym, przewyższając inne techniki SMLM, takie jak PALM i STORM. Na początek użyj wirującego dysku konfokalnego systemu wyposażonego w optyczną jednostkę do przypisywania fotonów oraz kamerę sCMOS.Uruchom system na 30 minut przed obrazowaniem, włączając mikroskop, kamerę i lasery. Potem uruchom komputer. Poczekaj, aż oprogramowanie NIS-Elements w pełni się załaduje.Teraz wybierz odpowiedni tryb obrazowania w NIS-Elements, wybierając SoRa Spinning Disk przed ustawieniem parametrów akwizycji. Wybierz obiektyw Apo z aperturą numeryczną 1.49 60x, aby zmaksymalizować wykrywanie zdarzeń pojedynczych cząsteczek. Następnie wybierz odpowiednie powiększenie na podstawie obiektywu, ustawień aparatu i próbki.Dostosuj odpowiednio zgięcie aparatu, aby dopasowało go do wybranego powiększenia. Ustaw czas naświetlania do pobierania DNA-PAINT. Teraz skonfiguruj długość fali lasera, moc lasera i koło filtrujące zgodnie ze spektrum barwnika obrazu.Aby zarejestrować moc lasera po obiektywie, umieść skalibrowany czujnik mocy lasera na stopniu mikroskopu blisko płaszczyzny próbki i zapisz zmierzoną moc. Następnie nałóż kroplę oleju immersyjnego na czysty obiektyw olejowy 60x Apo z aperturą numeryczną 1.49. Przymocuj przygotowaną próbkę komórek immunobarwionych na scenie mikroskopu za pomocą adaptera stóp, aby zminimalizować dryf.Przełącz się na tryb jasnego pola i skup się na płaszczyźnie szkła, używając nanocząsteczek jako odniesienia. Następnie aktywuj System Perfect Focus, aby utrzymać ostrość podczas akwizycji. Przy aktywnym systemie Perfect Focus tymczasowo zmień wzbudzenie na zielony kanał białkowy fluorescencjonalny, aby zidentyfikować optymalną płaszczyznę ogniskową.Używaj niskiej mocy lasera podczas tego etapu. Zdefiniuj nazwę eksperymentu i ścieżkę zapisu. Zaznacz pole czasowe, aby ustawić interwał, czas trwania i liczbę pętli.Ustaw przedział na No Delay i wprowadź liczbę pętli odpowiadającą łącznej liczbie klatek. Upewnij się, że pole PFS na dole jest zaznaczone. Wróć do wcześniej zdefiniowanych ustawień wzbudzeń SoRa i naciśnij Run Now.Uzyskaj od 15 000 do 20 000 klatek dla pierwszego białka, używając czasu integracji 300 milisekund. Do analizy obrazów załaduj rozłączony stos obrazów do modułu lokalizowanego Picasso. Wybierz Analizuj, a następnie Parametry z paska menu i wprowadź parametry specyficzne dla kamery zgodnie ze specyfikacją producenta.Następnie ustaw długość boków pudełka na siedem, aby zoptymalizować precyzję lokalizacji pojedynczej cząsteczki. Wybierz odpowiednią minimalną wartość gradientu netto i włącz podgląd, aby wizualizować wykryte lokalizacje. Dostosuj próg gradientu, aby zminimalizować wykrywanie tła.Teraz wybierz Analizuj, a następnie Lokalizuj, aby rozpocząć identyfikację i dopasowanie punktu we wszystkich klatkach. Załaduj powstały hdf5 do modułu Picasso Render, aby zwizualizować zrekonstruowaną mapę lokalizacji. Wybierz Postprocess, a następnie Undrift by RCC.Wprowadź początkową wartość segmentacji zaczynającą się od 1 000, aby uzyskać wykres dryfu xy. Powtórz z niższymi wartościami segmentacji, aby poprawić korektę dryfu. Kliknij na File and Save Localization, aby zapisać plik lokalizacji z korektą dryfu przed zamknięciem modułu renderowania.Teraz załaduj plik skorygowany dryfem do modułu filtra Picasso i zastosuj progi oparte na precyzji lokalizacji, szerokości funkcji rozproszenia punktowego, liczbie fotonów i innych metrykach jakości. Kliknij na File and Save Localization, aby zapisać filtrowany plik lokalizacji przed zamknięciem modułu filtra. Obrazowanie DNA-PAINT nukleoporiny 96 oznaczonej monomerycznie wzmocnionym zielonym fluorescencyjnym białkiem w komórkach U2OS dało wyraźny, superrozdzielony wzór złożonego poru jądrowego na polu widzenia.Powiększenie zdjęć ujawniło pary 96 podjednostek nukleoporiny ułożonych z oczekiwaną ośmiokrotną symetrią porów jądrowych. Pomiar euklidesowej odległości między wyrównanymi parami nukleoporyny 96 wykazał odległość szczyt-pik wynoszący 13 plus minus 2 nanometry. Nukleoporyna 96, mitochondria i mikrotubule były jednocześnie widoczne w komórkach U2OS z zachowaną precyzją lokalizacji pojedynczych cząsteczek we wszystkich celach.Duże pole widzenia Obrazowanie mikrotubul w komórkach HeLa wykazało, że precyzja lokalizacji zmieniała się wraz z powiększeniem i rozmiarem pola, a przy mniejszym powiększeniu obserwowano mniejszą precyzję. Wyższe powiększenia zapewniały lepszą i bardziej jednolitą precyzję lokalizacji w porównaniu z powiększeniem 1x. Obrazowanie całokomórkowe zostało wykazane poprzez DNA-PAINT pozyskiwania sieci mikrotubul na wielu płaszczyznach osiowych obejmujących całą głębokość komórki.Precyzja lokalizacji stopniowo spadała wraz ze wzrostem głębi obrazowania. Struktury mikrotubul o podwójnej ściance były rozstrzygane w wielu pozycjach osiowych z odległościami szczyt-pik od 30 nanometrów do 40 nanometrów. Nasz protokół umożliwia głębokie obrazowanie DNA-PAINT komórek i tkanek bez utraty rozdzielczości, wykorzystując prostą i komercyjnie dostępną optykę.DNA-PAINT o wysokiej rozdzielczości działa głównie przy TIRF lub wysokim oświetleniu, ograniczając głębokość obrazowania do zaledwie kilku mikronów. Nasze odkrycia sprawiają, że DNA-PAINT jest dostępny dla wielu laboratoriów, umożliwiając obrazowanie komórek i tkanek na głębokość w skali nano.

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj protokół głębokiego obrazowania całokomórkowego SMLM z wykorzystaniem DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów. Ta metoda umożliwia superrozdzielcze badania struktur komórkowych bez konieczności stosowania niestandardowej optyki.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Przeglądaj więcej filmów