Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej
13 marca 2026
Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.
Ten protokół jest zaprojektowany w celu oczyszczenia pierwotnych ludzkich trofoblastów z ludzkich tkanek łożyska w celu badania ich właściwości funkcjonalnych i immunologicznych w zdrowym ciążu oraz w warunkach patologicznych. Tak więc ten protokół zapewnia reproduktywalną platformę do przezwyciężenia niektórych wcześniejszych ograniczeń związanych z pracą z pierwotnymi ludzkimi trofoblastami pozawiłosowymi, a mianowicie ich żywotności. Tak więc ten protokół jest naprawdę zoptymalizowany, aby zwiększyć ich żywotność i czystość.
Aby rozpocząć, uzyskaj próbkę ludzkiego łożyska. Umieść łożysko stroną płodową w górę, aby widoczne było miejsce wpięcia pępowiny. Ręcznie oddziel łożysko od błony płodowej w kierunku miejsca wpięcia pępowiny i usuń je.
Następnie za pomocą nożyczek wytnij i wyrzuć łożysko. Wytnij błonę łożyskową na paski o długości dwóch cali, zaczynając od podstawy łożyska w górę, trzymając każdy pasek przymocowany do łożyska. Umieść pasek błony łożyskowej na dwóch palcach, przy czym strona decydualna powinna być skierowana w górę.
Za pomocą pary sterylnych kleszczy o zakrzywionym końcu delikatnie zeskrob decydualną ścianę macicy z chłoniaka. Zebraną decydualną ścianę macicy umieść w 50-mililitrowym stożkowym probówce zawierającym 20 mililitrów PBS do izolacji limfocytów. Następnie zebraną błonę chłoniaka umieść w oddzielnej 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 20 mililitrów medium myjącego A. Za pomocą nożyczek wytnij błonę chłoniaka wewnątrz 50-mililitrowej probówki na kawałki mniejsze niż dwa milimetre kwadratowe.
Wyrzuć medium myjące A z probówki. Myj tkankę wielokrotnie PBS, aż nadstanie stanie się przezroczysty. W celu rozcięcia łożyska umieść je stroną matczyną w górę i usuń skrzepy krwi.
Za pomocą sterylnych nożyczek wytnij kawałki łożyska podstawowego, unikając obszarów martwicy, zwapnienia lub niedokrwienia. Umieść kawałek decydualnej ściany macicy na palcach, przy czym włosy powinny być skierowane w górę. Następnie za pomocą nożyczek delikatnie usuń włoski, aby uzyskać membranę o grubości dwóch do trzech milimetrów z pozostawieniem tylko cienkiej warstwy włosków.
Zbierz tkankę decydualnej ściany macicy do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów PBS. Następnie pokroić tkankę na kawałki mniejsze niż dwa milimetre kwadratowe. Następnie wyrzuć PBS z probówki.
Wielokrotnie myj decydualną ścianę macicy PBS, aż nadstanie stanie się przezroczysty bez widocznej krwi. Następnie podziel 15 mililitrów zawiesiny tkankowej na dwie 50-mililitowe stożkowe probówki. Następnie napełnij wszystkie probówki PBS.
Wyśrodkuj probówki z siłą 200G przez jedną minutę i wylej nadstanie. Dodaj 150 mililitrów ciepłego koktajlu enzymów do trawienia tkanek do 300-mililitrowej szklanej butelki. Dodaj 30 mililitrów błony chłoniakowej do butelki.
Dodaj 20 mililitrów ciepłego DMEM/F-20 i 80 mililitrów ciepłego koktajlu enzymów do trawienia tkanek do dwóch oddzielnych 300-mililitrowych szkłanych butelek. Następnie dodaj 7,5 mililitra decydualnej ściany macicy do każdej butelki. Inkubatoruj butelki w kąpieli wodnej.
Trząś wszystkie butelki co trzy do czterech minut podczas 15-minutowej inkubacji. Po trawieniu przefiltruj tkankę przez metalowe sita o wielkości siatki 40. Następnie dodaj medium myjące B, aby przepłukać tkanki i rozpuścić żelatynowaty materiał.
Przenieś niestrawione tkanki z powrotem do szkłanych butelek i powtórz trawienie. Następnie przefiltruj zawiesiny komórkowe przez filtr o wielkości 100 mikrometrów do oznaczonych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Trzymaj komórki z pierwszego i drugiego trawienia oddzielnie.
Następnie wyśrodkuj zawiesinę komórkową z siłą 650G przez osiem minut. Wyrzuć nadstanie. Połącz pellety tego samego typu tkanki i numeru trawienia do jednej probówki.
Następnie uzupełnij objętość medium myjącym B do 25 mililitrów. Dodaj 12 mililitrów ficollu do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek oznaczonych typem tkanki i numerem trawienia. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na ficollu.
Następnie wyśrodkuj z siłą 800G przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez uszkodzenia. Ostrożnie aspiruj warstwę komórek na granicy medium ficoll i przenieś ją do czystych oznaczonych probówek. Następnie wypełnij probówki medium myjącym B, wyśrodkuj z siłą 650G przez osiem minut i ponownie zawieś pellety.
Umieść ponownie zawieszone pellety w sterylnych probówkach do sortowania komórek z aktywacją fluorescencji oznaczonych typem tkanki i numerem trawienia. Dodaj przeciwciała anty-CD45 BV785, anty-HLA GAPC i anty-EGFR1 BV711. Inkubatoruj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
Po wymyciu i ponownym zawieszeniu komórek w medium myjącym B natychmiast przepuść je przez 40-mikrometrową sitówkę do
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji i charakterystyki pierwotnych ludzkich trofoblastów pozawłośnieowych (EVT) z tkanek łożyska. Opisana metodologia umożliwia badaczom analizę unikalnych oddziaływań immunologicznych na granicy macierzyno-płodowej, z zastosowaniem w przypadku ciąż zdrowych oraz patologicznych, takich jak preeclampsia i przedwczesny poród.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia rozrodu
- Biologia łożyska
- Izolacja i charakterystyka komórek
Wprowadzenie
- Interfejs matczyno-płodowy jest wyspecjalizowanym środowiskiem immunologicznym wymagającym tolerancji immunologicznej.
- EVT wykazują ekspresję cząsteczek tolerogennych (HLA-G, PD-L1, PD-L2), które modulują odpowiedzi immunologiczne matki.
- Ludzkie EVT wykazują również ekspresję HLA-C, który oddziałuje z komórkami NK i limfocytami T matki.
- Modele zwierzęce nie posiadają ortologów kluczowych cząsteczek ludzkich EVT, co sprawia, że niezbędne są bezpośrednie badania tkanek ludzkich.
Cel badania
- Zapewnienie solidnego protokołu izolacji i charakteryzacji pierwotnych ludzkich komórek EVT z tkanek łożyska.
- Umożliwienie badania właściwości komórek EVT w warunkach fizjologicznych oraz patologicznych.
- Ułatwienie badań nad mechanizmami utrzymania ciąży oraz stanami zapalnymi łożyska.
Zastosowane metody
- Disekcja tkanek łożyska i błon owocowych.
- Trawienie enzymatyczne i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek.
- Oczyszczanie EVT za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
- Charakterystyka fenotypowa z wykorzystaniem wielowymiarowej cytometrii przepływowej.
- Krótkoterminowa hodowla in vitro oraz kokultura z komórkami odpornościowymi matki (do 96 godzin).
Główne wyniki
- Opracowanie powtarzalnego protokołu pozyskiwania wysoce czystych i żywotnych EVT.
- EVT odpowiednie do dalszych zastosowań, takich jak testy immunologiczne oraz analiza ekspresji genów/białek.
- Platforma umożliwiająca badanie interakcji między EVT a komórkami odpornościowymi matki zarówno w zdrowych, jak i powikłanych ciążach.
Wnioski
- Protokół ten przyczynia się do rozwoju badań nad ludzkimi trofoblastami zewnątrzdecidualnymi (EVT) i ich rolą immunologiczną na styku matki i płodu.
- Stanowi podstawę do badania powikłań ciąż związanych ze stanem zapalnym łożyska.
- Umożliwia uzyskanie nowej wiedzy na temat mechanizmów tolerancji immunologicznej oraz patofizjologii ciąży u ludzi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia izolacja i fenotypowanie trofoblastów pozawłośniczkowych (EVT) HLA-G+ z ludzkiej tkanki łożyska wypełnia istotną lukę w immunologii rozrodu, umożliwiając weryfikację mechanistyczną w przypadkach, gdy modele zwierzęce nie dostarczają przydatnych informacji. Platforma ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad tolerancją matczyno-płodową oraz pozwala na podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka w programach ukierunkowanych na powikłania ciążowe. Metodologia ta jest strategicznie ukierunkowana na badania translacyjne nad modulacją odpornościową na styku matka-płód.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia badanie mechanizmów tolerancji immunologicznej charakterystycznych dla ciąży u ludzi.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla cząsteczek takich jak HLA-G, PD-L1 i PD-L2 w trofoblastach pozaplacentarnych (EVT).
- Ułatwia analizę mechanistyczną w celu zminimalizowania ryzyka w odniesieniu do szlaków zaangażowanych w zapalenie łożyska.
- Zapewnia specyficzny dla człowieka system testowania hipotez w sytuacjach, gdy modele zwierzęce nie są odpowiednie.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Zapewnia uzyskanie populacji EVT o wysokiej czystości do standaryzowanych testów immunologicznych.
- Umożliwia powtarzalną charakterystykę fenotypową i funkcjonalną z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Wspiera ilościową ocenę interakcji między EVT a matczynymi komórkami odpornościowymi w hodowli współdzielonej.
- Przygotowuje zwalidowane układy komórkowe do późniejszego przesiewania związków modulujących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób takich jak przedwczesna pęknięcie błon płodowych, przedwczesny poród oraz zapalenie łożyska.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć do przedklinicznej walidacji w ludzkich systemach tkankowych.
- Wspiera identyfikację translacyjnych biomarkerów powikłań ciążowych.
- Stanowi platformę do rozwoju terapeutyków immunomodulujących z uwzględnieniem oceny ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych w zakresie immunologii rozrodu, łącząc wczesne badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi nad zaburzeniami ciąży.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących tolerancji immunologicznej i funkcji EVT na granicy macierzyńsko-płodowej.
- Przesiewy: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne preparaty EVT do ilościowych analiz immunologicznych.
- Analityka: Umożliwia wysokowymiarową cytometrię przepływową i odczyty funkcjonalne do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z fenotypami klinicznymi w powikłaniach ciążowych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań z zakresu immunologii macierzyńsko-płodowej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad ciążą u ludzi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i charakterystykę EVT w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) nad interwencjami immunomodulującymi w czasie ciąży.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów ukierunkowanych na stan zapalny łożyska i zaburzenia z nim związane, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie przygotowania tkanek łożyska oraz cytometrii przepłyewej.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury FACS oraz wielowymiarowych platform analitycznych.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności izolacji i fenotypowania komórek.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody w zależności od tego, czy źródłem jest tkanka patologiczna, czy zdrowa.
- Metoda jest ograniczona brakiem ortologów w modelach zwierzęcych, co podkreśla potrzebę dostępu do tkanek ludzkich.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:38
Isolation and Separation of Chorionic Membrane and Decidua Parietalis from Human Placenta
2:14
Dissection and Preparation of Decidua Basalis from Human Placenta
3:27
Enzymatic Digestion of the Chorionic Membrane and Decidua Basalis
5:22
Ficoll Separation
6:05
Sorting of Extravillous Trophoblast Cells
6:56
Results
8:06
Conclusion
