Name: Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Naucz się izolować pozabłonkowe trofoblasty HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska do badań immunologicznych. Ta metoda umożliwia analizę interakcji z komórkami odpornościowymi matki w zdrowej i patologicznej ciąży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Sherry Thornton oraz Research Flow Cytometry Core z Działu Reumatologii w Cincinnati Children's Hospital Medical Center za całą pomoc w zakresie cytometrii przepływowej i sortowania komórek; wszystkim pielęgniarkom i lekarzom z uczestniczących szpitali za wysiłki w zbieraniu materiałów łożyskowych; wszystkim członkom laboratorium Tilburgs oraz wykładowcom immunologii z CCHMC za pomocne dyskusje; Ta praca została wsparta przez NIH R01HD116852 (T.T.); Cincinnati Children's Research Foundation (T.T.); Burroughs Wellcome Fund Next Gen Pregnancy Award #NGP10115 (T.T.); oraz grant współpracy March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. jest wspierany przez granty JSPS KAKENHI Numery 22KK0287 i 25K12697.

Komisja Etyki Badań Instytucjonalnego w Cincinnati Children's Hospital zatwierdziła ten protokół badawczy (Zezwolenie nr 2021-0336), który spełnia wymagania dotyczące rozważań bioetycznych, postępowania z informacjami osobowymi, patogenami zakaźnymi i procedur uzyskania zgody na udzielenie informacji zgodnie z prawem amerykańskim. Każde laboratorium powinno uzyskać zgodę zgodną z krajowymi wytycznymi badań przed rozpoczęciem eksperymentu.
Niniejszy protokół koncentruje się na hodowlanośc w pierwotnych HLA-G+ EVT, które utrzymują żywotność do 96 godzin dla wtórnego badania funkcjonalnego poprzez udoskonalenie naszego poprzedniego protokołu2,28. Odnoś się do Hamiltona i wsp.2 w celu ustanowienia linii komórek przypominających HLA-G+ EVT i Ikumi i wsp.28 do zaangażowania dopasowanych limfocytów z macierzyńskiej śluzówki macicy.
1. Przygotowanie laboratorium (dzień 0).
UWAGA: Do obsługi próbek używaj szafki biobezpieczeństwa klasy II (BSL2).
<ol>
	<li>Ustaw dwa kąpiele wodne o 39 °C i 37 °C. Ustaw skondycjonowany inkubator CO2 w 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1x PBS, Medium myjące A, Medium myjące B, Medium hodowlany EVT A, B i C (Tabela 1 i Tabela 2).</li>
	<li>Odtapiaj 15 mL 10 mg/mL roztworu DNase I (Tabela 1) i 500 mL 0,25% Trypsyny/EDTA w kąpieli wodnej w 37 °C.</li>
	<li>Umieść pojemnik wypełniony roztworem biocydalnym/wirusobójczym (np. 10% bielacza) w szafie BSL2 do zbierania płynnych odpadów. Ustaw pojemnik na odpady z workiem do odpadów biologicznie niebezpiecznych w szafie BSL2.</li>
	<li>Przygotuj podkładki pochłaniające, sterylne narzędzia do sekcji (kleszcze z zakrzywionymi końcówkami i nożyczki 6 3/4"), sterylne metalowe filtry, stojaki na probówki i sterylne 50 mL stożkowe probówki w szafie BSL2.</li>
	<li>Przygotuj trzy 50 mL stożkowe probówki (dwie z 1x PBS każda i jedną z Medium myjącym A na zbiórkę kawałków tkanki łożyskowej podczas sekcji.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek (dzień 0)
UWAGA: Użyj ludzkich łożysk z błonami płodowymi uzyskanych drogą cięcia cesarskiego między 24 a 42 tygodniem ciąży. Łożysko dostarczone naturalnie może dać mniej EVT.
<ol>
	<li>Zacznij przetwarzać łożysko natychmiast w szafie BSL2, najlepiej w ciągu 1-2 godzin od porodu, aby zmaksymalizować wydajność żywych komórek. Zachowaj łożysko w temperaturze pokojowej przez cały czas.</li>
	<li>Sprawdź łożysko i, jeśli to konieczne, zarejestruj jego rozmiar, wagę i ogólny wygląd morfologiczny.</li>
</ol>
3. Sekcja tkanki (dzień 0)
<ol>
	<li>Sekcja błony
	<ol>
		<li>Umieść łożysko zwrócone stroną płodową do góry (część wstawiania pępowiny widoczna). Usuń amnion, który jest warstwą błony najbliżej strony płodowej, poprzez ręczne ściągnięcie od bocznej błony w kierunku ujścia pępowiny; wyciąć i wyrzucić amnion.</li>
		<li>Przeciąć błonę choriodecydualną na paski o długości 2 cali, zaczynając od podstawy łożyska w górę, pozostawiając pas błony choriodecydualnej przymocowanej do łożyska.</li>
		<li>Umieść pasek błony choriodecydualnej dwoma palcami zwróconymi stroną śluzówkową do góry i delikatnie zeskrob śluzówkę maciczną z chorionu za pomocą sterylnych kleszczy z zakrzywionymi końcówkami. 
		UWAGA: Pracuj efektywnie i nie pozwól, aby błona chorionu wyschła.</li>
		<li>Zbierz błonę chorionu do 50 mL stożkowej probówki z 20 mL Medium myjącego A.</li>
		<li>Zbierz śluzówkę maciczną do izolacji limfocytów śluzówkowych w 50 mL stożkowej probówce z 20 mL PBS i postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez Ikumi i wsp. w zakresie izolacji limfocytów28.</li>
		<li>Wytnij błonę chorionu nożyczkami w probówce 50 mL, aż stanie się mniejszymi kawałkami o powierzchni mniejszej niż 2 mm2. 
		UWAGA: Idealna ilość osadzonej błony po wycięciu to 30 mL.</li>
		<li>Wyrzuć Medium myjące A i przemyj PBS-em kilkakrotnie, aż nadstanie staje się czysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja łożyska
	<ol>
		<li>Umieść łożysko zwrócone stroną macierzystą do góry i usuń skrzepy krwi. Przetnij kawałki łożyska (długość 2 cm, szerokość 2 cm, głębokość 0,5 cm) używając sterylnych nożyczek, unikając części martwicy, skamielin lub niedokrwienia.</li>
		<li>Umieść kawałek śluzówki podstawowej na palcach zw

<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

Nie ma żadnego konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Kluczowe kroki w protokole
Aby uzyskać żywe EVT, kluczowe jest rozpoczęcie izolacji komórek z łożyska natychmiast po porodzie i wykonanie wszystkich procedur od izolacji do sortowania w temperaturze pokojowej. Ponieważ EVT są większe i bardziej adhezywne w porównaniu z limfocytami, należy podjąć następujące środki ostrożności, aby uniknąć zatykania się podczas sortowania: i) przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 µm przed sortowaniem, ii) użyć medium zawierającego DNase do zawiesiny komórek, iii) unikać nadmiernego koncentratu zawiesin komórek (idealnie ~1 × 10⁶ komórek/mL), oraz iv) użyć wielkości dyszy co najmniej 100 µm. Sorter Jet-in-Air (np. Bigfoot, MoFlo) osiąga wyższy wydajność żywych EVT w porównaniu z sorterami komórek opartymi na technikach płynowych (np. sortery BD, Sony Nano).
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą
Nadmierny lub niedostateczny proces trawienia po pierwszym trawieniu EVT z decydualnej bazalnej
Efektywność trawienia tkanki decydualnej bazalnej różni się między łożyskami. Nadmiernie strawione tkanki tworzą duże, lepkie agregaty, które są trudne do przepuszczenia przez metalowe sita. Zazwyczaj dodanie 10-30 mL Medium do płukania B pomaga rozproszyć te agregaty podczas filtracji. Jeśli to nie rozwiąże problemu, dodaj 1-2 mL DNase bezpośrednio do tkanek. Jeśli pierwsze trawienie wynika w nadmiernym strawieniu, zmniejsz stężenie Koktajlu Enzymów do Trawienia Tkanki z 80% do 70% na drugie trawienie. Po filtracji pierwszego trawienia objętość pozostałej tkanki powinna zmniejszyć się do mniej niż połowy. Jeśli objętość pozostałej tkanki nie ulegnie zmianie, zwiększ stężenie Koktajlu Enzymów do Trawienia Tkanki z 80% do 90-100% na drugie trawienie. Tkanki błony kosmówkowej są jednolicie strawione w łożyskach. Dlatego dostosowywanie stężenia koktajlu enzymów do trawienia tkanki jest generalnie niepotrzebne.
W przypadku trawienia większych objętości tkanki niż te opisane w powyższym protokole
W przypadku trawienia więcej niż 30 mL błony kosmówkowej lub więcej niż 15 mL tkanki decydualnej bazalnej, użyj dodatkowych butelek z Koktajlem Enzymów do Trawienia Tkanki. Zwiększenie objętości tkanki w pojedynczej butelce zwykle prowadzi do niedostatecznego trawienia.
Ograniczenia metody
Mniejszy wydajność EVT jest oczekiwany w przypadku łożysk dostarczonych naturalnie. EVT nie może być krioprezerwowane przed lub po sortowaniu, ponieważ są wrażliwe na stres zamrażania i rozmrażania, co znacznie ogranicza ich żywotność i funkcjonalność. Dlatego ten protokół nie zawiera żadnego punktu zatrzymania.
Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących metod
Wcześniej opisaliśmy protokół do ustanowienia linii komórek podobnych do EVT-jakich HLA-G+ z łożysk końcowych za pomocą Medium do hodowli tkankowej B i płytek pokrytych kolagenem. Jednak kilka inhibitorów w medium i kolagenie potencjalnie wpływa na funkcjonowanie limfocytów T w systemie współhodowlanym2. Inne wcześniejsze doniesienia, które nie używały Medium do hodowli tkankowej B, pozwoliły na ocenę limfocytów T w współhodowli, ale nie EVT z powodu zmienności komórek1,10. Zaletą obecnego protokołu jest minimalizowanie wpływu medium hodowlanego, jednocześnie umożliwiając hodowlę żywych pierwotnych EVT. Ten protokół zapewnia platformę eksperymentalną do badania funkcji immunologicznych EVT i ich funkcjonalnych zmian w odpowiedzi na otaczające komórki odpornościowe – obszar, który był słabo zbadany.

Łożysko ludzkie zawiera cztery szerokie kategorie rodzajów trofoblastów, komórek macierzystych trofoblastu, syncytiotrofoblastów, cytotrofoblastów kosmkowatych i trofoblastów pozakosmkówkowych (EVT), każda z odrębnymi funkcjami i cechami fenotypowymi. Wśród nich EVT wykazują unikalne cechy immunologiczne, w tym wysokie występowanie cząstek immunosupresyjnych, takich jak HLA-G, PD-L1, PD-L2 i członków rodziny B7, a także polimorficznego HLA-C1,2,3,4,5,6. EVT inwazyjnie penetrują głęboko tkankę maciczną, tętnice spiralne i mięsień macicy, umieszczając je w bezpośrednim kontakcie z komórkami odpornościowymi matki7. EVT charakteryzują się wyraźnym występowaniem polimorficznego HLA-C, kluczowego mediatora interakcji z komórkami T i NK matczynej, które muszą być kontrolowane, aby zachować tolerancję immunologiczną podczas ciąży. Jako jedyna klasyczna cząsteczka MHC ekspresowana przez EVT, HLA-C umożliwia też prezentację antygenu matczynym pamięciowym komórkom T i wspiera ochronę immunologiczną8. Jednak kilka badań wykazało, że EVT bezpośrednio zwiększają regulacyjne komórki T CD4 i stany tolerogenne komórek T CD8 i NK, aby chronić się przed cytotoksycznością i odrzuceniem immunologicznym9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Ponadto niektóre badania zgłaszały zmiany immunologiczne w komórkach odpornościowych matki i EVT łożysk uzyskanych po przedrzucawicy, przedwczesnym porodzie lub poronieniu w porównaniu ze zdrowymi kontrolami14,15,16,17,18,19,20,21. Kilka możliwości może leżeć u podstaw tych zmian immunologicznych, w tym i) wcześniej istniejąca nieprawidłowość komórek T matczynych; ii) upośledzone funkcje immunosupresyjne EVT; lub iii) zakłócone interakcje między dwoma typami komórek. Aby wyjaśnić podstawowe czynniki mechaniczne, ex vivo systemy modelowania eksperymentalnego, które pozwalają na ocenę interakcji komórek odpornościowych matczynych i EVT, są niezbędne.
Metody i podejścia przedstawione tutaj mają kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, które wykorzystują klasyczne linie trofoblastu, modele komórek macierzystych trofoblastu lub organoidalne. Co najważniejsze, klasyczne linie komórek trofoblastu i modele komórek macierzystych trofoblastu nie odtwarzają istotnych cech pierwotnych EVT, w tym ich profili ekspresji MHC3,5,22,23. Po drugie, złożone wymagania środowiskowe dla komórek macierzystych trofoblastu ludzkiego (hTSC) i kultur organoidów, które obejmują kilka inhibitorów molekularnych, bezpośrednio wpływają na funkcje i fenotypy komórek odpornościowych, uniemożliwiając odpowiednią ocenę interakcji EVT i komórek odpornościowych22,24,25,26,27. Wreszcie, różnorodność komórkowa kultur hTSC po różnicowaniu i wewnętrzna natura struktur organoidalnych łożyska, pozwalają na interakcje odpornościowe z rodzajami trofoblastów, które brak mają odpowiednika in vivo, zmniejszając klarowność badań22,27.
Tutaj opisujemy metody do oczyszczania pierwotnych EVT HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska końcowego, umożliwiające hodowlę do 96 h w obecności lub bez populacji komórek odpornościowych. W środowisku nie ma inhibitorów molekularnych, które wpływają na funkcje EVT i komórek odpornościowych, zachowując ich żywotność. To podejście zapewnia wartościową platformę do bezpośrednich ex vivo badań interakcji EVT i komórek odpornościowych w ciąży zdrowo przebiegającej i powikłanej. Oczekuje się, że przyczyni się do odkrycia kluczowych czynników tolerancji immunologicznej matczyno-płodowej i zidentyfikowania celów terapeutycznych do rozwiązania zapalenia łożyska.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C freezer</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 Incubator</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C fridge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; scissors</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C freezer&nbsp;</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, mouse, IgG1 k Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Cell Sorter</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 biosafety cabinet</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Mouse IgG1, &kappa; isotype Control&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation sieve</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (mesh size 60)</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Curved tip tweezers</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, Human, Recombinant, Animal Free</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>magnet separator</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10X Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>Research grade FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath 37&nbsp;&deg;C</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x No Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów hla-g+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

Interfejs matczyńsko-płodowy u ludzi reprezentuje unikalne środowisko immunologiczne, w którym komórki układu odpornościowego matki i łożyskowe komórki trofoblastyczne pozabłonkowe (EVT) angażują się w bezpośredni kontakt komórkowy w celu ustanowienia i utrzymania tolerancji immunologicznej. EVT wykazują charakterystyczny immunofenotyp opisany przez ekspresję tolerogennych cząsteczek, w tym HLA-G, PD-L1 i PD-L2, które odgrywają kluczową rolę w modulowaniu reakcji odpornościowych matki. Ponadto, ludzkie EVT wyrażają HLA-C, które może być bezpośrednio rozpoznane przez macierzyste komórki NK i T i sprzyja ich aktywacji. Co ważne, brak jest ortologów HLA-C lub HLA-G w modelach zwierzęcych stosowanych do badań, a łożyskowe komórki mysie nie wyrażają MHC. Dlatego też badanie fenotypowych i funkcjonalnych właściwości ludzkich EVT z tkanki łożyska, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstawy utrzymania ciąży i patofizjologii zapalenia łożyska związanego z ciążowym nadciśnieniem tętniczym, przedwczesnym porodem, ograniczeniem wzrostu płodu i łożyskiem zaciekającym. Protokół ten opisuje kompleksową metodykę izolacji i charakteryzacji pierwotnych ludzkich EVT z tkanki łożyska zdrowych noworodków, a także po przedwczesnym porodzie i ciążowym nadciśnieniu tętniczym. Obejmuje on: (1) rozcinanie tkanki łożyska i błon płodowych; (2) enzymatyczne trawienie i przygotowanie pojedynczych zawiesin komórkowych; (3) oczyszczanie EVT przez sortowanie FACS; (4) charakteryzację fenotypowo za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej; oraz (5) krótkotrwałą hodowlę in vitro i kohodowlę z komórkami układu odpornościowego matki przez maksymalnie 96 godzin. Duży nacisk kładzie się na uzyskanie wysoce czystych i żywych EVT nadających się do dalszych zastosowań, takich jak testy funkcjonalne układu odpornościowego, analiza ekspresji białek i genów. Zastosowanie tego protokołu umożliwia uzyskanie solidnej i powtarzalnej platformy do pogłębiania zrozumienia interakcji między EVT a komórkami układu odpornościowego matki oraz ich znaczenia zarówno w ciąży zdrowej, jak i powikłanej.

Oczekiwane plony komórek
Z 15 mL ścięgna gruczołowego oczekuje się, że plony HLA-G+ EVT wynoszą 0,1-0,3 × 106 komórek z pierwszego trawienia i 0,1-0,6 × 106 komórek z drugiego trawienia (łącznie 0,2-0,8 × 106 komórek). Z 30 mL błony kosmówkowej oczekuje się, że plony HLA-G+ EVT wynoszą 0,4-1,0 × 106 komórek z pierwszego trawienia i 0,4-1,5 × 106 komórek z drugiego trawienia (łącznie 0,8-2,5 × 106 komórek). Oczekuje się, że proporcja caspase 3/7- 7-AAD- żywych EVT w izolatów wynosi 90-95%.
Pierwotna kultura EVT HLA-G+
Analiza cytometrii przepływowej markerów pochodzenia (HLA-G, HLA-C, EGFR) i markerów śmierci komórkowej wykazała, że ten protokół zapewnia żywą pierwotną kulturę EVT do dnia 4 (96 h po posadzeniu posortowanych EVT) (Rysunek 1B-D). Pokazano reprezentatywne obrazy mikroskopu świetlnego pierwotnych chorionowych i d.basalis HLA-G+ EVT po 24, 48 i 72 h kultury (Rysunek 2A-F).
Kokultura pierwotnych HLA-G+ EVT z limfocytami T
Ten protokół poprawił żywotność pierwotnych EVT 96 h po izolowaniu z łożyska, co jest poprawą w porównaniu z naszym poprzednim raportem1,2,10. Dlatego umożliwia analizę odpowiedzi EVT po kokulturze z wstępnie stymulowanymi limfocytami, co naśladuje ostre zapalenie na granicy macierzyńsko-płodowej. EVT wyrażają polimorficzne HLA-C, jak również immunosupresyjne cząsteczki ko-hamujące, takie jak PD-L1, PD-L2, PVR (znane również jako CD155), B7H3 i HLA-E, zgodnie z wynikami barwienia cytometrii przepływowej pozakomórkowej (Rysunek 3A,B). EVT zwiększyły ekspresję HLA-C, jak również PD-L1, PD-L2 i HLA-E, ale nie zwiększyły ekspresji PVR i B7H3, gdy były kokulturowane z aktywowanymi limfocytami przez 72 h zgodnie z sekcją protokołu 8 (Rysunek 4A,B). Ponadto nie zaobserwowano wzrostu śmierci EVT, co wykazano za pomocą barwienia 7AAD i caspase 3/7 (Rysunek 4C,D).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Strategia bramek dla sortowania komórek EVT i wykresów cytometrii przepływowej po kulturze posortowanych EVT. (A) Reprezentatywna strategia bramek dla sortowania EVT ścięgna gruczołowego i EVT kosmówkowych. R1 to brama dla żywych komórek na wykresie Forward-Side Scatter. R2 to brama dla wykluczenia leukocytów CD45+. R3 to brama dla HLA-G+EGFR+EVT. R4 to 7-AAD-caspase3/7- żywe EVT. Chociaż brama R4 nie jest konieczna do sortowania, jest tu pokazana, aby wykazać żywotność pierwotnych EVT. (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej posortowanych HLA-G+EGFR+EVT, po 96 h kultury in vitro. (C,D) Częstotliwości caspase 3/7- 7-AAD- żywych EVT podczas sortowania (dzień 0) i 96 h kultury (dzień 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Morfologia EVT podczas kultury in vitro. Reprezentatywne obrazy mikroskopu świetlnego kosmówkowych EVT po (A) 24 h, (B) 48 h i (C) 72 h kultury oraz EVT ścięgna gruczołowego po (D) 24 h, (E) 48 h i (F) 72 h kultury. Skala pozioma = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Feno

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

Ten protokół jest zaprojektowany w celu oczyszczenia pierwotnych ludzkich trofoblastów z ludzkich tkanek łożyska w celu badania ich właściwości funkcjonalnych i immunologicznych w zdrowym ciążu oraz w warunkach patologicznych. Tak więc ten protokół zapewnia reproduktywalną platformę do przezwyciężenia niektórych wcześniejszych ograniczeń związanych z pracą z pierwotnymi ludzkimi trofoblastami pozawiłosowymi, a mianowicie ich żywotności. Tak więc ten protokół jest naprawdę zoptymalizowany, aby zwiększyć ich żywotność i czystość.Aby rozpocząć, uzyskaj próbkę ludzkiego łożyska. Umieść łożysko stroną płodową w górę, aby widoczne było miejsce wpięcia pępowiny. Ręcznie oddziel łożysko od błony płodowej w kierunku miejsca wpięcia pępowiny i usuń je.Następnie za pomocą nożyczek wytnij i wyrzuć łożysko. Wytnij błonę łożyskową na paski o długości dwóch cali, zaczynając od podstawy łożyska w górę, trzymając każdy pasek przymocowany do łożyska. Umieść pasek błony łożyskowej na dwóch palcach, przy czym strona decydualna powinna być skierowana w górę.Za pomocą pary sterylnych kleszczy o zakrzywionym końcu delikatnie zeskrob decydualną ścianę macicy z chłoniaka. Zebraną decydualną ścianę macicy umieść w 50-mililitrowym stożkowym probówce zawierającym 20 mililitrów PBS do izolacji limfocytów. Następnie zebraną błonę chłoniaka umieść w oddzielnej 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 20 mililitrów medium myjącego A. Za pomocą nożyczek wytnij błonę chłoniaka wewnątrz 50-mililitrowej probówki na kawałki mniejsze niż dwa milimetre kwadratowe.Wyrzuć medium myjące A z probówki. Myj tkankę wielokrotnie PBS, aż nadstanie stanie się przezroczysty. W celu rozcięcia łożyska umieść je stroną matczyną w górę i usuń skrzepy krwi.Za pomocą sterylnych nożyczek wytnij kawałki łożyska podstawowego, unikając obszarów martwicy, zwapnienia lub niedokrwienia. Umieść kawałek decydualnej ściany macicy na palcach, przy czym włosy powinny być skierowane w górę. Następnie za pomocą nożyczek delikatnie usuń włoski, aby uzyskać membranę o grubości dwóch do trzech milimetrów z pozostawieniem tylko cienkiej warstwy włosków.Zbierz tkankę decydualnej ściany macicy do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 20 mililitrów PBS. Następnie pokroić tkankę na kawałki mniejsze niż dwa milimetre kwadratowe. Następnie wyrzuć PBS z probówki.Wielokrotnie myj decydualną ścianę macicy PBS, aż nadstanie stanie się przezroczysty bez widocznej krwi. Następnie podziel 15 mililitrów zawiesiny tkankowej na dwie 50-mililitowe stożkowe probówki. Następnie napełnij wszystkie probówki PBS.Wyśrodkuj probówki z siłą 200G przez jedną minutę i wylej nadstanie. Dodaj 150 mililitrów ciepłego koktajlu enzymów do trawienia tkanek do 300-mililitrowej szklanej butelki. Dodaj 30 mililitrów błony chłoniakowej do butelki.Dodaj 20 mililitrów ciepłego DMEM/F-20 i 80 mililitrów ciepłego koktajlu enzymów do trawienia tkanek do dwóch oddzielnych 300-mililitrowych szkłanych butelek. Następnie dodaj 7,5 mililitra decydualnej ściany macicy do każdej butelki. Inkubatoruj butelki w kąpieli wodnej.Trząś wszystkie butelki co trzy do czterech minut podczas 15-minutowej inkubacji. Po trawieniu przefiltruj tkankę przez metalowe sita o wielkości siatki 40. Następnie dodaj medium myjące B, aby przepłukać tkanki i rozpuścić żelatynowaty materiał.Przenieś niestrawione tkanki z powrotem do szkłanych butelek i powtórz trawienie. Następnie przefiltruj zawiesiny komórkowe przez filtr o wielkości 100 mikrometrów do oznaczonych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Trzymaj komórki z pierwszego i drugiego trawienia oddzielnie.Następnie wyśrodkuj zawiesinę komórkową z siłą 650G przez osiem minut. Wyrzuć nadstanie. Połącz pellety tego samego typu tkanki i numeru trawienia do jednej probówki.Następnie uzupełnij objętość medium myjącym B do 25 mililitrów. Dodaj 12 mililitrów ficollu do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek oznaczonych typem tkanki i numerem trawienia. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na ficollu.Następnie wyśrodkuj z siłą 800G przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez uszkodzenia. Ostrożnie aspiruj warstwę komórek na granicy medium ficoll i przenieś ją do czystych oznaczonych probówek. Następnie wypełnij probówki medium myjącym B, wyśrodkuj z siłą 650G przez osiem minut i ponownie zawieś pellety.Umieść ponownie zawieszone pellety w sterylnych probówkach do sortowania komórek z aktywacją fluorescencji oznaczonych typem tkanki i numerem trawienia. Dodaj przeciwciała anty-CD45 BV785, anty-HLA GAPC i anty-EGFR1 BV711. Inkubatoruj przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Po wymyciu i ponownym zawieszeniu komórek w medium myjącym B natychmiast przepuść je przez 40-mikrometrową sitówkę do

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Opisujemy użycie przeciwciał monoklonalnych TG30 (CD9) i GCTM-2 do połączonego wykrywania antygenów powierzchniowych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do identyfikacji i wzbogacania żywych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) za pomocą selekcji pozytywnej, a także użycie selekcji negatywnej do usuwania hESC z populacji komórek mieszanych.

Wzbogacanie i oczyszczanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez wykrywanie antygenów powierzchniowych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych TG30 i GCTM-2

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Protokół ten opisuje przygotowanie roślin tkanki łożyskowej ludzkich hodowanych na styku powietrze-ciecz do badania infekcji wirusowych.

Ex vivo Hodowla ludzkich implantów łożyskowych do badania transmisji wirusa na styku matka-płod

Naucz się izolować pozabłonkowe trofoblasty HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska do badań immunologicznych. Ta metoda umożliwia analizę interakcji z komórkami odpornościowymi matki w zdrowej i patologicznej ciąży.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G⁺ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Przeglądaj więcej filmów