Name: Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania wewnątrzżyciowego terminali aksonów LTMR w skórze myszy. Ta technika umożliwia badanie struktury i funkcji obwodowych układów sensorycznych podczas rozwoju i w wieku dorosłym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Hannah Elam, dr Snighdzie Mukerjee, Rachelle Larivee oraz dr Tegy J. Vadakkan za całe wsparcie i pomoc podczas tych badań. Dziękujemy Ryanowi Michaelowi Nuerze za pomoc w konfiguracji systemu izofluranowego. Prace te są wspierane przez stypendium Hanna Gray Instytutu Howarda Hughesa (Grant# GT17518).

Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) na Uniwersytecie Vanderbilt. Dla bezpieczeństwa eksperymentatorów wszystkie procedury wykonywano w fartuchach laboratoryjnych, sterylnych rękawiczkach i maskach. Wszystkie narzędzia były dokładnie sterylizowane przed użyciem, a wszystkie powierzchnie eksperymentalne były czyszczone 70% etanolem przed i po każdym eksperymencie. Myszy użyte w tym badaniu to nastolatki i dorosłe zwierzęta obu płci, pochodzące ze szczepów Thy1-YFP, TrkBCreEr oraz Ai140. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie instrumentów
<ol>
	<li>Włącz laser. Daj wystarczająco dużo czasu, by laser się rozgrzał. W tej pracy użyto lasera Chameleon Discovery NX, który ma czas trwania impulsu 100 femtosekund (fs) i częstotliwość powtarzalności 80 ± 0,5 megaherca (MHz).</li>
	<li>Włącz mikroskop dwufotonowy i otwórz oprogramowanie do sterowania i akwizycji na komputerze.</li>
	<li>Włącz termofor i ustaw go na 37 °C, aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie znieczulenia i przedniej łapy do obrazowania
<ol>
	<li>Aby wywołać znieczulenie, umieść mysz w komorze indukcyjnej i ustaw układ na 3,5% izofluranu, aż mysz straci odruch prostowania i zaczyna płynnie oddychać (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Powietrze w pomieszczeniu jest używane jako nośnik i powinno być ustawione na 1,0 litra na minutę (L/min).</li>
	<li>Połóż mysz na termoforze na platformie obrazującej i zmniejsz ilość izofluranu do 1,5% oraz tlenu do 0,5 L/min. Izofluran powinien być podawany przez stożek nosowy. U myszy młodszych niż 20 dzień poporodowy izofluran jest ustawiony na 2-4%, aby utrzymać znieczulenie. Monitoruj głębokość znieczulenia co 10 minut, oceniając utratę odruchu pedałowego i odruchowego odruchu pomózgowego, częstość i głębokość oddechu oraz ogólne napięcie mięśni.</li>
	<li>Aby zminimalizować artefakty ruchu podczas obrazowania, w tym ruch związany z oddychaniem, mysz powinna być umieszczona na osobnym etapie od łapy. W tym protokole korpus myszy spoczywa na platformie bezpośrednio sąsiadującym, ale nie dotykającej platformy obrazującej, na której zamontowana jest łapa.</li>
	<li>Nakładaj maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec suchości podczas obrazowania.</li>
	<li>Delikatnie nałóż krem depilacyjny na łapę za pomocą patyczka kosmetycznego, aby usunąć włosy. Po chwili pozostawienia na skórze usuń śmietankę, a następnie wyczyść łapkę myszy 70% etanolem i wodą.</li>
	<li>Delikatnie rozciągnij skórę, aby ustabilizować powierzchnię skóry. Używając sterylnej igły 30 G i czarnego tuszu, delikatnie przekłuj skórę i tatuaż z dwoma sąsiadującymi kropkami po obu stronach zamierzonego obszaru obrazu. Upewnij się, że kropki są rozmieszczone co około 2 milimetrów (mm). Po zakończeniu tatuażu prawidłowo wyrzuć igłę do pojemnika na ostre naczyńki.</li>
	<li>Na szkiełku mikroskopowym umieść cztery kropki smaru próżniowego na rogach i umieść mały kawałek gliny (np. DAS Air-Harting Modeling Clay) o grubości około 1 mm na środku preparatu. Umieść szkiełko pod soczewką obiektywu i wyśrodkowaj łapę myszy bezpośrednio na kawałku gliny (Rysunek 1A,B). Delikatnie przesuwaj łapką myszy po suwaku, aby ją spłaszczyć i wcisnąć w glinę. Ostrożnie umieść na łapie slip o wymiarach 22 mm x 60 mm, aby zabezpieczyć suwak. Reguluj kąt skóry myszy, delikatnie naciskając na każdy z rogów pokrywy, aż powierzchnia pokrywy i skóra będą równoległe do płaszczyzny obrazu. Stosowanie delikatnej siły podczas obrazowania pomaga zapobiegać potencjalnym uszkodzeniom skóry.</li>
	<li>Aby obrazować nagą skórę, umieść preparat pod obiektywem i wyśrodkowaj łapę myszy na preparatie, jak opisano w kroku 2.7. Użyj pęsety, aby obrócić łapę tak, aby gładka skóra była skierowana do góry. Użyj płaskiego końca pęsety, aby delikatnie wcisnąć łapę w glinę. Gdy łapa jest płaska, połóż pokrywkę na wierzchu i dociśnij zgodnie z krokiem 2.7.</li>
</ol>
3. Obrazowanie morfologii LTMR mikroskopem dwufotonowym
UWAGA: Następujące parametry można dostosować w zależności od konkretnego eksperymentu. W tym eksperymencie użyto obiektywu 20x do zanurzenia w wodzie o przysłonie numerycznej 1 i zasięgu roboczym 2,00 mm. Kroki 3.1-3.6 opisują konkretne parametry używane dla prawej przedniej łapy myszy Thy1-YFP , które mogą służyć jako przewodnik referencyjny.
<ol>
	<li>Na pokrywce połóż kroplę destylowanej wody, bezpośrednio nad myszą łapką.</li>
	<li>Opuść soczewkę obiektywu, aż utworzy się kolumna wody.</li>
	<li>Gdy soczewka obiektywu jest wycentrowana nad łapą myszy, zamknij pudełko mikroskopu i użyj ekranu LED, aby ustawić ostrość na próbce za pomocą kontrolerów X, Y i Z. Ekran LED wyświetla obraz na żywo oświetlony wbudowaną diodą LED mikroskopu. UWAGA: Tryb LED służy do potwierdzenia, że obiektyw jest wycentrowany na polu zainteresowania przed przejściem na tryb dwufotonowy. Obraz LED pokazuje cechy powierzchniowe, takie jak naczynia krwionośne i mieszki włosowe, służąc jako wizualny przewodnik dla ustawienia i celowania. Tatuaże na łapce myszy pojawiają się jako czarne plamki na ekranie LED. Korzystając z tych punktów orientacyjnych, znajdź i skup się na obszarze pomiędzy czarnymi plamami. Zapewnia to, że ten sam obszar łapy myszy jest wielokrotnie obrazowany.</li>
	<li>Gdy próbka zostanie znaleziona, wyłącz ekran LED. Aby wykonać obrazowanie dwufotonowe z tkanki, przełącz mikroskop z ustawienia lustra na dichroiczny , przekręcając dźwignię po prawej górnej stronie mikroskopu.</li>
	<li>Zamknij zasłony zaciemniające i włącz detektor, aby zobaczyć YFP.</li>
	<li>Korzystając z Prairie View, otwórz migawkę i przełącz oprogramowanie na tryb obrazowania. Aby obrazować Thy1-YFP, włącz strojony laser ustawiony na 960 nanometrów (nm) do wzmocnienia 700-800. Podczas obrazowania GFP ustaw laser z regulacją na 920 nm.<ol>
		<li>Dla myszy po dniu 10 lub młodszych ustaw początkową moc lasera na 50, zwiększając ją aż do osiągnięcia pożądanej intensywności sygnału. Ta niższa początkowa moc lasera minimalizuje przenikanie światła oraz ryzyko uszkodzeń fotofoto. Po ustawieniu długości fali, wzmocnienia i mocy lasera, rozpocznij skanowanie. UWAGA: Do wykonania obrazu o wysokiej rozdzielczości 1,00x pola widzenia lub obrazu krwinek Meissnera na obfitych palcach zaleca się użycie obrazu o rozmiarze 1024 x 1024 z polem widzenia 601,9 μm x 601,9 μm i rozmiarem piksela 0,588 μm x 0,588 μm. Do obrazowania końcówek lancetowych wokół mieszków włosowych zaleca się posiadanie rozmiaru obrazu 1024 x 1024 przy zoomie 8,00x, pola widzenia 75,2 μm x 75,2 μm oraz rozmiaru piksela 0,147 μm x 0,147 μm. Ważne jest, aby zauważyć, że pole widzenia i rozmiar piksela zmieniają się wraz z ustawieniami zoomu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kontrolerów X, Y i Z, aby znaleźć pole obrazowania, dostosować zoom w razie potrzeby i rozpocząć akwizycję obrazu. Optymalny obraz zazwyczaj uzyskuje się w pozycji początkowej około 10-20 μm pod powierzchnią skóry. UWAGA: Obraz o wysokiej rozdzielczości owłosionej skóry zazwyczaj ma rozmiar kroku 1 μm lub 2 μm z około 40-120 przekrojeniami. Tymczasem obraz o wysokiej rozdzielczości nagiej skóry zazwyczaj ma rozmiar kroku od 2 μm do 4 μm i obejmuje około 80-100 przekrojów. Daje to typowy zakres z-100-250 μm, a całkowita maksymalna głębokość obrazowania wynosi około 300 μm.</li>
	<li>Sesja obrazowa będzie ograniczona do 25 minut, aby zminimalizować czas ekspozycji na izofluran i zmniejszyć ryzyko wystąpienia niepożądanych skutków związanych ze znieczuleniem dla zwierzęcia. Nadmiar izofluranu jest wchłaniany przez filtr z węglem drzewnym znieczulającym, który można wyrzucić do zwykłych śmieci.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wyjmij łapę myszy ze szklanego szkiełka i odłóż mysz do klatki odzyskującej.</li>
	<li>Trzymaj klatkę ciepłą na termoforze, aż mysz całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce domowej, obserwując ją przez dodatkowe 30 minut, aby upewnić się, że mysz integruje się z towarzyszami w klatce.</li>
</ol>
5. Przewlekłe obrazowanie morfologii LTMR in vivo 
<ol>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem dwufotonowym, wykonując kroki 2.4-3.3.</li>
	<li>Za pomocą ekranu LED zlokalizuj kropki atramentu z poprzedniej sesji zdjęciowej. Ustawij ekran pomiędzy kropkami, aby upewnić się, że pożądany obszar zostanie uchwycony. Podczas trybu skanowania pod mikroskopem sprawdź punkty orientacyjne, takie jak duże nerwy czy wzory mieszków włosowych, aby mieć pewność, że zlokalizowano ten sam obszar.</li>
	<li>Po znalezieniu obszaru obrazowania należy postępować zgodnie z krokami 3.4-3.6, aby kontynuować obrazowanie.</li>
	<li>Sprawdź jakość i intensywność obrazów, a także morfologię głównych aksonów, uzyskanych poprzez wzbudzenie powierzchni skóry za pomocą dwóch fotonów. Upewnij się, że pola obrazów są porównywalne z tymi wykonanymi podczas poprzedniej sesji obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Abraira, V. E., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+neurons+of+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The sensory neurons of touch.</a> Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).</li>
<li>Handler, A., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensory+neurons+of+touch+and+their+mechanisms+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation.</a> Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).</li>
<li>Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+somatosensory+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development.</a> Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).</li>
<li>Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+types+in+cat+hairy+skin+supplied+by+myelinated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers.</a> J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).</li>
<li>Iggo, A., Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+a+slowly+adapting+touch+corpuscle+in+hairy+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin.</a> J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li>
<li>Rutlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+direction+selectivity+of+A%CE%B4-LTMRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs.</a> Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).</li>
<li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li>
<li>Handler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstructions+of+mechanosensory+end+organs+suggest+a+unifying+mechanism+underlying+dynamic%2C+light+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch.</a> Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).</li>
<li>Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+the+palisade-type+sensory+endings+in+relation+to+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles.</a> J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).</li>
<li>Cauna, N., Ross, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+Meissner%27s+touch+corpuscles+of+human+fingers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).</li>
<li>Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+and+wiring+of+mammalian+cutaneous+low-threshold+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).</li>
<li>Koutsioumpa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-type-dependent+development+of+murine+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons.</a> Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).</li>
<li>Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuits+transmitting+mechanical+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch.</a> Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).</li>
<li>Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cycle-dependent+plasticity+of+skin+and+hair+follicle+innervation+in+normal+murine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin.</a> J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).</li>
<li>Peters, E. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+timing+of+hair+follicle+and+dorsal+skin+innervation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice.</a> J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+visualization+of+a+rare+subset+of+unmyelinated+sensory+neurons+that+may+detect+gentle+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch.</a> Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).</li>
<li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+axon-glial+interactions+and+Netrin-G1+signaling+in+the+formation+of+low-threshold+mechanoreceptor+end+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chronic+two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus.</a> J Vis Exp. (185), e64104(2022).</li>
<li>Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+within+a+niche+as+a+determinant+of+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate.</a> Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).</li>
<li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci+Vis%22%5BJournal%5D)">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).</li>
<li>Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+imaging+of+the+spinal+cord+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice.</a> Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Vis Exp. (59), e2760(2012).</li>
<li>Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+structural+dynamics+in+the+spinal+dorsal+horn+in+an+inflammatory+pain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+hair+follicles+are+innervated+by+one+afferent+axon%3F+A+confocal+microscopic+analysis+of+palisade+endings+in+the+auricular+skin+of+thy1-YFP+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).</li>
<li>Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+rapidly+adapting+mechanoreceptors+and+their+developmental+dependence+on+Ret+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling.</a> Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).</li>
<li>Neubarth, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meissner+corpuscles+and+their+spatially+intermingled+afferents+underlie+gentle+touch+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception.</a> Science. 368 (6497), eabb2751(2020).</li>
<li>Bai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Identification+of+an+Expansive+Mechanoreceptor+Sensitive+to+Skin+Stroking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking.</a> Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).</li>
<li>Griffin, J. W., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+pathology+of+nonmyelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells.</a> Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).</li>
<li>Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depilatory+creams+increase+the+number+of+hair+follicles%2C+and+dermal+fibroblasts+expressing+interleukin-6%2C+tumor+necrosis+factor-%CE%B1%2C+and+tumor+necrosis+factor-%CE%B2+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-threshold+mechanoreceptor+subtypes+selectively+express+MafA+and+are+specified+by+Ret+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling.</a> Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).</li>
<li>Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+peripheral+nerve+regeneration+in+the+acute+healing+phase+using+tissue+clearing+and+optical+microscopy+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model.</a> PLoS One. 9 (4), e94054(2014).</li>
<li>Gangadharan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathic+pain+caused+by+miswiring+and+abnormal+end+organ+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting.</a> Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Meleshina, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+label-free+imaging+of+living+dermal+equivalents+including+dermal+papilla+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).</li>
<li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych istotnych ujawnień.

Badanie to demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania morfologii LTMR w nienaruszonej skórze noworodków i dorosłych myszy. To podejście do obrazowania podłużnego przezwycięża ograniczenia związane z utrwalaniem tkanek i umożliwia obserwację struktur aksonalnych w nienaruszonych tkankach w czasie rzeczywistym. Morfologie aksonów Aβ RA-LTMR i Aδ-LTMR wizualizowane za pomocą obrazowania dwufotonowego są zgodne z obserwacjami z wcześniejszych tkanek fiksowanych PFA 2,6,7,1...

Dotyk jest najwcześniejszym zmysłem, który się rozwija, i odgrywa centralną rolę w tym, jak organizmy doświadczają i reagują na świat fizyczny. Dotyk wykrywany jest przez mechanoreceptory o niskim progu (LTMR), które są podtypami neuronów zwojowe grzbietowego korzenia (DRG) wykrywających nieszkodliwe bodźce mechaniczne, w tym wgłębienia, drgania i odchylenie włosów 1,2. LTMR są pseudounipolarne i rozszerzają aksony obwodowe do tkanek obwodowych, tworząc zakończenia specyficzne dla podtypu. Ich centralne aksony przekazują informacje dotykowe do ośrodkowego układu nerwowego, tworząc połączenia synaptyczne z neuronami rdzenia kręgowego3. Jednak sposób ustanawiania i utrzymania obwodów dotykowych jest słabo zrozumiany.
Wcześniejsze badania podstawowe u kotów z lat 60. i 70. XX wieku po raz pierwszy zidentyfikowały te funkcjonalnie odrębne mechanoreceptory oraz ich właściwości odpowiedziowe w skórze owłosionej 4,5. Podtypy LTMR klasyfikuje się według unikalnej morfologii, prędkości przewodzenia oraz właściwości odpowiedzi2. Główne podtypy LTMR to Aβ szybko adaptujące się (RA) i powoli adaptujące (SA) LTMR, Aδ-LTMR oraz C-LTMR 2,6,7. Aβ RA-LTMR, Aδ-LTMR i C-LTMR tworzą podłużne kompleksy lancetowate wokół mieszków włosowych2. Aδ-LTMR tworzą spolaryzowane lancetowe zakończenia wokół mieszków włosowych po stronie ogonowej, co jest kluczowe dla ich selektywnych reakcji kierunkowych na odchylenie włosów7. Zakończenia aksonów w kompleksach lancetowych są ściśle wyrównane z włoskami i otoczone są wyrostkami przypominającymi palce z komórek Schwanna końcowych, które zapewniają wsparcie troficzne i wpływają na morfogenezę aksonów 8,9,10. U skóry gładkiej aksony Aβ RA-LTMRs kończą się w ciałkach Meissnera, które są jajowatymi strukturami zlokalizowanymi wewnątrz brodawków skórnych, dostrojonych do ruchu na skórze 2,11.
Organizacja zakończeń aksonalnych LTMR jest regulowana zarówno przez programy wewnętrzne, jak i sygnały zależne od skóry podczas rozwoju12,13. Po uszkodzeniu dysfunkcja LTMR wiąże się z chorobami patologicznymi, takimi jak mechaniczna allodynia12,14. Jednak mechanizmy rozwoju i utrzymania LTMR w nienaruszonej skórze pozostają niejasne. Większość wiedzy o ich rozwoju pochodzi z tkanek stałych, które nie są w stanie uchwycić dynamicznych procesów zachodzących in vivo 6,15,16,17,18. Na przykład Aβ RA-LTMR i Aδ-LTMR wykazują aktywne unerwienia wokół mieszków włosowych oraz przycinanie aksonów podczas wczesnego rozwoju poporodowego19. Sposób unerwienia i utrzymania mieszków włosowych in vivo pozostaje nieznany.
Dwufotonowa mikroskopia laserowo-skanująca, zaawansowana technika obrazowania umożliwiająca wizualizację fluorescencyjnie oznakowanych struktur w tkankach żywych, umożliwiła obrazowanie dynamicznych procesów fizjologicznych o wysokiej rozdzielczości in vivo 20,21. Podczas obrazowania dwufotonowego krótkie impulsy światła bliskiego podczerwieni pobudzają fluorofory tylko w płaszczyźnie ogniskowej, ograniczając sygnał do małej objętości i minimalizując nieostrość fluorescencji 21,22. To uwięzienie znacząco zmniejsza fototoksyczność i umożliwia trójwymiarowe, przestrzennie rozdzielone obrazowanie struktur 20,23,24. Ponadto dłuższe długości fal wzbudzeń stosowane w mikroskopii dwufotonowej rozpraszają się mniej w tkance, co pozwala na głębsze przenikanie i mniejszy poziom szumów w złożonych środowiskach 20,25,26. Na przykład obrazowanie dwufotonowe wykazało strukturalną plastyczność synaptyczną oraz aktywność neuronów w neuronach rogu grzbietowego rdzenia kręgowego 27,28,29. Ponadto przewlekłe obrazowanie in vivo dwufotonowe mieszków włosowych ujawniło informacje o ich homeostazie skóry ucha myszy23. Dlatego mikroskopia dwufotonowa doskonale nadaje się do badania struktur LTMR w skórze in vivo, zwłaszcza gdy wymagane jest powtarzalne, długoterminowe obrazowanie w celu śledzenia zmian rozwojowych i przewlekłych.
W połączeniu z genetycznie modyfikowanymi liniami myszy wyrażającymi fluorescencyjne raporty, mikroskopia dwufotonowa może ujawnić morfologię neuronów skóry3. W układzie somatosensorycznym żółte białko fluorescencyjne (YFP) eksprimowane pod kontrolą promotora thy1 (Thy1-YFP)30 selektywnie oznacza kompleksy lancetowe Aβ-LTMR u skóry owłosionej oraz krwinki Meissnera w skórze gładkiej30,31. U myszy Thy1-YFP oznakowane aksony wykazują obecność białka zasadowego mieliny i neurofilamentu, które są markerami dla mielinizowanych aksonów Aβ30,31. Dodatkowo TrkB CreER, w którym rekombinaza Cre indukowana przez tamoksyfen (CreER) jest napędzana ekspresją genu TrkB (kinazy receptora Tropomiozyny B), selektywnie oznacza Aδ-LTMR podczas rozwoju7. W skórze mikroskopia dwufotonowa jest najskuteczniejsza do obrazowania LTMR u znieczulonych myszy, ponieważ ruch myszy wpływałby na pozyskiwanie obrazów w wysokiej rozdzielczości. Wizualizacja białek fluorescencjowych na zakończeniach aksonalnych po ekspresji indukowanej CreER zajmuje trochę czasu, a minimalny czas oczekiwania należy określić dla każdej linii transgenicznej. Ogólnie rzecz biorąc, ta metodologia może być stosowana do wizualizacji LTMR u myszy na wszystkich etapach rozwoju oraz u dorosłych.
Protokół ten wyjaśnia procedury wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do badania morfologii aksonów LTMR w owłosionej i gładkiej skórze rozwijających się i dorosłych myszy w wysokiej rozdzielczości. Protokół zawiera kilka wskazówek dotyczących optymalnego badania obrazowego w wysokiej rozdzielczości i przewlekłych obrazowania. To integracyjne podejście umożliwia badanie mechanizmów komórkowych napędzających składanie i plastyczność aksonów sensorycznych dotyku in vivo.

<table><tbody><tr><td>obiektyw 20x &ndash; Super NA 1.0</td><td>Olympus</td><td>1-U2B965</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Pokrywka 22x60</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Modelarska glina do utwardzania powietrznego</td><td>DAS</td><td></td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Pompa powietrzna znieczulona (HF), 110V</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>R510-30</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Koncentryczna maska znieczulona</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>R510-M</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna znieczulająca i indukcja; Mysz i Szczur</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>V105</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Bruker Ultima Investigator plus mikroskop laserowy skanujący</td><td>Bruker Nano, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Motyle Igły</td><td>Fisher Scientific</td><td>1484041</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Chameleon Discovery NX z TPC: Dual</td><td>Spójność</td><td>1385777</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Maska stożkowa z rurką dla noworodkowych myszy</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>68680</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Filtry z podwójną emisją (et525/70m i et595/50m) oraz t565lpxr&nbsp; Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Nikon</td><td>INVP-01</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych ET-GFP ET470/40x i ET252/50m; dichroiczne T495LPXR&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>518065</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td></td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Podkład grzewczy w dalekiej podczerwieni z kontrolerem (zasilanie AC)</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0515</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Detektory GaAsp (2) &nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics&nbsp;</td><td>HED-UP-2&nbsp;</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Filtry gazowe</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>R510-31-6</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Smar o wysokiej próżni</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td>System obrazowania</td></tr><tr><td>Izofluran, USP (250 mL)</td><td>Piramal Intensywna Opieka Krytyczna</td><td>6679-017-25</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Pudełko na okładkę laserową&nbsp;</td><td>Technologia Teco</td><td></td><td>System obrazowania</td></tr><tr><td>Myszy: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/J</td><td>JAX</td><td>27214</td><td></td></tr><tr><td>Myszy: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/J</td><td>JAX</td><td>30220</td><td></td></tr><tr><td>Myszy: B6. CG-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>Rzeka Charles</td><td>3709</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji Nair</td><td>Amazon</td><td>28001</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Surowe pliki danych</td><td>Zenodo</td><td></td><td>10.5281/zenodo.17370834</td></tr><tr><td>Sztywny podstawek z dużym prostokątnym uchwytem na wkładkę</td><td>Thorlabs</td><td>MP15M</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Platforma do działania znieczulenia dla małych zwierząt</td><td>RWD Life Science Inc.</td><td>R510-PGL</td><td>System izofluranowy</td></tr><tr><td>Maść do oczu Soothe Lubrykant</td><td>Bausch + Lomb</td><td></td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Układ mikroskopu dwufotonowego</td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Intravital Two-Photon Imaging of Touch Sensory Axon Morphology in Mouse Skin

Mechanoreceptory o niskim progu (LTMR) to neurony somatosensoryczne, które wykrywają nieszkodliwe bodźce dotyku świetlnego, takie jak drgania, ugięcie włosów i nacisk. Tworzą one specyficzne dla podtypu zakończenia aksonalne na obrzeżach i wysyłają aksony centralnie do rdzenia kręgowego, przekazując informacje dotykowe. Obecna wiedza na temat rozwoju i organizacji LTMR pochodzi z tkanek stałych, które nie są w stanie ujawnić dynamicznych i czasowych procesów związanych z okablowaniem aksonalnym i przebudowywaniem. Przedstawiono tutaj metodę obrazowania dwufotonowego do wizualizacji morfologii aksonów LTMR u przedniej łapy myszy podczas rozwoju oraz u dorosłych. Mikroskopia dwufotonowa pozwala na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w nienaruszonej skórze, umożliwiając powtarzane obrazowanie tych samych zakończeń aksonowych w różnych okresach poporodowych. Obrazowanie dwufotonowe można łączyć z nowymi narzędziami genetycznymi myszy, aby ujawnić rozwój aksonów z podtypową specyficznością. Przewlekłe obrazowanie LTMR umożliwia badania składania i naprawy obwodów po urazie. Te podejścia zapewniają system in vivo , który dostarczy nowych informacji o mechanizmach komórkowych regulujących rozwój i regenerację aksonów somatosensorycznych.

W tych badaniach zastosowano mikroskopię dwufotonową do wizualizacji struktur aksonalnych Aβ RA-LTMR i Aδ-LTMR w skórze podczas rozwoju oraz u dorosłych. Dojrzałe lancetowe zakończenia, występujące u myszy około 20. dnia poporodowego i starszego, są w pełni rozwinięte19,32. Ogólna organizacja zakończeń aksonów w owłosionej skórze dorosłych myszy została zobrazowana, co pokazano na projekcji maksymalnej intensywności (Rysunek 2A). Głę...

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Low-threshold mechanoreceptors (LTMRs) are somatosensory neurons that detect innocuous light touch stimuli such as vibration, hair deflection, and ...

Badamy molekularne i komórkowe mechanizmy powstawania obwodu somatosensorycznego poprzez obrazowanie in vivo aksonów somatosensorycznych w skórze myszy. Najnowsze osiągnięcia genetyki myszy w badaniach sensacji somato pozwoliły nam badać rozwój aksonów somatosensorycznych in vivo z użyciem specyficzności podtypowej. Na początek włącz laser i daj mu wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie.Następnie włącz mikroskop dwufotonowy i otwórz oprogramowanie sterujące i akwizycyjne na podłączonym komputerze. Włącz termofor i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia. Teraz przenieś znieczuloną mysz na poduszkę grzewczą na platformie obrazującej.Ustaw ciało myszy na platformie przylegającej do sceny obrazowania tak, aby nie dotykała miejsca, gdzie zamontowana jest łapka, minimalizując artefakty ruchu podczas obrazowania. Następnie nałóż maść okulistyczną na oba oczy myszy, aby zapobiec suchości podczas obrazowania. Następnie, używając patyczka kosmetycznego, delikatnie nałóż krem depilacyjny na łapkę myszy, aby usunąć włosy.Po minucie usuń krem i oczyść łapę 70% etanolem, a następnie wodą. Następnie jedną ręką delikatnie rozciągnij skórę, aby ustabilizować powierzchnię łapy. Używając sterylnej igły 30 gauge i czarnego tuszu, przebij skórę i wytatuuj dwie sąsiadujące kropki po obu stronach obszaru obrazowania celu, odstępujące od siebie około dwóch milimetrów.Po tatuażu wyrzuć używaną igłę do pojemnika na ostre naczyńki. Weź szkiełko mikroskopu szklanego i umieść cztery kropki smaru próżniowego na rogach. Następnie umieść kawałek gliny modelarskiej o grubości jednego milimetra w centrum preparatu.Umieść suwak pod obiektywem obiektywu i wycentruj łapę myszy bezpośrednio na glinie. Delikatnie przesuwaj łapką myszy po suwaku, aby ją spłaszczyć i wcisnąć w glinę. Następnie ostrożnie załóż na łapę pokrywkę o wymiarach 22 na 60 milimetrów, aby ją zabezpieczyć.Reguluj kąt skóry myszy, delikatnie naciskając na każdy róg pokrywy, aż powierzchnia skóry będzie równoległa do płaszczyzny obrazowania. Aby zobrazować skórę glabry, użyj pęsety, aby obrócić łapę tak, aby skóra glabra była skierowana ku górze, a następnie użyj płaskiego końca pęsety, by delikatnie wcisnąć łapę w glinę. Po spłaszczeniu połóż na wierzchu pokrywkę i delikatnie dociśnij.Potwierdź, że łapa jest wyśrodkowana. Na pokrywce okładowej połóż kroplę destylowanej wody bezpośrednio nad myszą łapą. Opuść soczewkę obiektywu, aż między soczewką a osłoną utworzy się kolumna wody.Gdy soczewka obiektywu jest wycentrowana nad łapą myszy, zamknij pudełko mikroskopu i użyj ekranu LED, aby ustawić ostrość na próbce, regulując kontrolery X, Y i Z. Ekran LED będzie wyświetlał obraz na żywo oświetlony wbudowanymi mikroskopami LED. Po zlokalizowaniu próbki wyłącz ekran LED.Aby rozpocząć obrazowanie dwufotonowe, przełącz dźwignię po prawej górnej stronie mikroskopu, aby przełączyć się z ustawienia lustra na dichroiczny. Następnie zamknij zasłony zaciemniające i włącz detektor, aby zobaczyć żółte białko fluorescencyjne, czyli YFP. W widoku prerii otwórz migawkę i przełącz oprogramowanie na tryb obrazowania.Aby obrazować thy1-YFP, włącz laser z regulacją i ustaw długość fali na 960 nanometrów, z wzmocnieniem między 700 a 800. W przypadku zielonego białka fluorescencyjnego, czyli obrazowania GFP, dostosuj laser do 920 nanometrów. Dla myszy w wieku 10 dni poporodowych lub młodszych ustaw początkową moc lasera na 50 i stopniowo zwiększaj moc, aż osiągniesz pożądaną intensywność sygnału.Minimalizuje to przenikanie światła i zmniejsza ryzyko uszkodzenia zdjęć. Gdy długość fali, wzmocnienie i moc lasera zostaną ustalone, rozpocznij skanowanie tkanki. Teraz użyj kontrolerów X, Y i Z, aby zlokalizować pole obrazowania i dostosować zoom w razie potrzeby.Rozpocznij akwizycję obrazu w pozycji około 10 do 20 mikrometrów pod powierzchnią skóry. Na koniec po zdjęciu usuń myszą łapę ze szkiełka i odłóż mysz do klatki do rekonwalescencji na opiekę pooperacyjną. W owłosionej skórze dorosłych myszy ogólna aksonalna organizacja końcowa w czterołapowej części została ujawniona dzięki maksymalnej intensywności projekcji, ukazując w pełni rozwinięte lancetowate zakończenia otaczające mieszki włosowe.Średnia gęstość końcówek lancetowych otaczających mieszki włosowe u tych myszy wynosiła 15,8 zakończeń na milimetr kwadratowy. Na czwartym dniu poporodowym zaobserwowano rzadkie, półksiężycowate zakończenie w kształcie delta LTMR unerwiającego mieszek włosowy. Podłużny kompleks lancetowy w owłosionej skórze został sfotografowany u dorosłej myszy w dniu 39 poporodowym, a zdjęcia wysokorozdzielczości płaszczyzny Z pokazały szybko adaptujące się końcówki LTMR lancetowate z A beta, każde oddzielone od siebie o trzy mikrometry.Niedojrzałe kompleksy lancetowe zaobserwowano w skórze owłosionej w 10. dniu poporodowym z mniejszą liczbą aksonów LTMR A beta, a poszczególne płaszczyzny Z wykazały rzadkie, początkujące końcówki lancetowe. U dorosłej myszy u palca u dorosłych widać, jak aksony LTMR beta RA unerwiają ciałka Meissnera jako elipsoidalne struktury pod naskórkiem, a poszczególne przekroje optyczne podkreślają odrębne zakończenia aksonów na różnych głębokościach skóry. Przez trzy kolejne dni te same pęczki nerwowe u dorosłych myszy o owłosionej skórze zostały zidentyfikowane z niewielkimi zmianami kształtu, prawdopodobnie spowodowanymi ułożeniem łap.Te same morfologie aksonów wokół mieszków włosowych w skórze owłosionej były konsekwentnie obrazowane przez trzy dni. Nasz protokół odpowiada na wyzwanie w terenie, jakim jest wizualizacja struktury i dynamiki aksonów somatosensorycznych u żywych zwierząt podczas rozwoju. Nasza technika umożliwia przewlekłe obrazowanie rozwoju aksonów somatosensorycznych w wysokiej rozdzielczości, a także w stadium dorosłym in vivo.Badanie to umożliwia badanie molekularnych i komórkowych mechanizmów rozwoju i regeneracji aksonów somatosensorycznych in vivo.

intravital-two-photon-imaging-touch-sensory-axon-morphology-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u noworodków myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje mikroskopię dwufotonową używaną do obrazowania neuronów w mózgu znieczulonego transgenicznego szczeniaka myszy. Laser dwufotonowy pozwala na głębsze obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną i minimalnym rozpraszaniem światła, umożliwiając szczegółowe uchwycenie morfologii neuronów, w tym projekcji dendrytycznych.

Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania morfologii neuronów u szczeniaka myszy

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe może być użyte do zbadania interakcji między różnymi typami komórek w rdzeniu kręgowym w ich naturalnym środowisku tkankowym u chimerycznego zwierzęcia szpiku kostnego z urazowym uszkodzeniem rdzenia kręgowego w kolumnie grzbietowej.

Przyżyciowe obrazowanie interakcji aksonalnych z mikroglejem i makrofagami w urazie zmiażdżenia kolumny grzbietowej myszy

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Prezentujemy zoptymalizowaną procedurę miejscowego wyrzucania za pomocą szklanej mikropipety i szybkiej metody obrazowania dwufotonowego hiperstosu, która pozwala na precyzyjny pomiar zmian średnicy kapilary i badanie jej regulacji w trzech wymiarach.

Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Poznaj metodę dwufotonowego obrazowania wewnątrzżyciowego terminali aksonów LTMR w skórze myszy. Ta technika umożliwia badanie struktury i funkcji obwodowych układów sensorycznych podczas rozwoju i w wieku dorosłym.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Przeglądaj więcej filmów